Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
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Este estudio fue apoyado por una beca de investigación intramuros del Instituto de Ciencia y Tecnología de Corea (2E29563).

1. Preparación de P. aeruginosa PAO1 y Escherichia coli OP50 Cultura
<ol><li>Preparar 500 ml de medio esterilizado Luria-Bertani (LB)(Tabla 1) e inocular una sola colonia de P. aeruginosa en el medio. Incubar el cultivo durante 14 a 15 h a 37oC con una velocidad de agitación de 150 rpm.</li>
	<li>Distribuir igualmente el cultivo bacteriano en dos tubos centrífugos de 500 ml y centrifugar los tubos a 3.220 x g a 4 oC durante 30 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

Mediante la utilización de este nuevo método para determinar la permeabilidad intestinal en C. elegans, que combina la microscopía de fluorescencia automatizada y el análisis cuantitativo de imágenes, las diferencias causadas por microorganismos intestinales o productos químicos se pueden determinar in vivo, específicamente en el intestino de C. elegans. Este protocolo es útil para las investigaciones de permeabilidad intestinal y aplicable a muchas tareas, como la determinación reactiva de esp...

La permeabilidad intestinal se considera como una de las principales barreras relacionadas con la microbiota intestinal y la inmunidad a la mucosa y es probable que se vea afectada por varios factores, como modificaciones de la microbiota intestinal, deterioro epitelial o alteraciones de la capa de moco1. Documentos recientes han reportado protocolos eficaces para medir la permeabilidad intestinal de las células intestinales humanas cultivadas mediante el análisis de las tasas de flujo de fluorescencia a través de la capa de células intestinales2, pero menos documentos de investigación presentan un procedimiento adecuado para medir la permeabilidad intestinal en los nematodos, particularmente en C. elegans,mediante el uso de la tinción FITC-dextran.
Existen dos protocolos representativos para medir la permeabilidad intestinal en C. elegans utilizando Rojo nilo3 y erioglaucina disódico (o el ensayo Pitufo)4,5. En este protocolo, utilizamos FITC-dextran (peso molecular medio 10.000), que tiene un peso molecular mucho mayor que el rojo del Nilo (MW 318,37) y el erioglaucina disódico (MW a 792,85). FITC-dextran es más similar a los colorantes disódicos rojos del Nilo o erioglaucina a nutrientes macromoleculares reales como los carbohidratos, que se absorben a través de la capa intestinal. La permeabilidad intestinal de C. elegans alimentados con erioglaucina disódico (tinte azul pitufo) se puede evaluar fácilmente sin microscopía de fluorescencia. Sin embargo, en el ensayo Pitufo, el análisis cuantitativo de la permeabilidad intestinal es difícil debido a la falta de estandarización y debe evaluarse manualmente4,5. En el caso del ensayo rojo del Nilo, el rojo del Nilo también tiñe las gotas de lípidos en las células, lo que puede interferir con la determinación exacta de la permeabilidad intestinal en C. elegans6. Los protocolos actuales permiten un análisis cuantitativo rápido y preciso de la permeabilidad intestinal en C. elegans tratados con diversas bacterias intestinales y productos químicos evitando la tinción de lípidos inespecíficos.
C. elegans es un modelo típico en campos biológicos debido a su precio asequible, fácil manipulación, problemas de ética animal limitada, y corta vida útil, que es beneficioso para la experimentación rápida7. En particular, después de que se publicó todo el genoma de C. elegans, casi el 40% de los genes en el genoma de C. elegans fueron encontrados como ortologos a los genes que causan enfermedades humanas8. Además, el cuerpo transparente permite la observación dentro del organismo, lo que es ventajoso para la investigación de eventos celulares y para aplicaciones de fluorescencia en biología celular, por ejemplo, la tinción de células madre con DAPI o inmunohistoquímica9. C. elegans se utiliza a menudo como un animal experimental para estudiar la interacción entre la microbiota intestinal y el huésped; además, C. elegans se utiliza para la pantalla de bacterias probióticas que promueven la salud10,11,12, así como productos químicos dietéticos que promueven la salud intestinal13,14.
Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis son bacterias intestinales bien conocidas que afectan negativamente el sistema gastrointestinal, especialmente las células epiteliales colónicas del tracto intestinal15,16. Por lo tanto, medir la permeabilidad intestinal desencadenada por estas bacterias es necesario para el cribado y desarrollo de nuevos fármacos que pueden recuperar y reducir el daño causado por la inflamación bacteriana y la infección. En este protocolo, probamos los efectos de estas bacterias intestinales en la permeabilidad intestinal de C. elegans.
También informamos de un protocolo optimizado para probar productos químicos sobre la permeabilidad intestinal de C. elegans. Para este propósito, utilizamos 3,3'-diindolylmethane (DIM) como un modelo químico porque DIM es un compuesto metabolito bioactivo derivado de indol-3-carbinol, que está presente en las plantas de alimentos Brassica, y se ha informado que tiene efectos terapéuticos sobre la EII en ratones17,18. Además, recientemente descubrimos que DIM mejora la disfunción de la permeabilidad intestinal tanto en las células intestinales humanas cultivadas como en el nematodo modelo C. elegans19.
En este estudio, utilizamos tres condiciones experimentales diferentes. En primer lugar, medimos los efectos de las diferentes bacterias, P. aeruginosa y E. faecalis, en la permeabilidad intestinal(Figura 1). En segundo lugar, medimos los efectos de P. aeruginosa en la permeabilidad intestinal(Figura 2). En tercer lugar, medimos los efectos de DIM (un modelo químico) en la permeabilidad intestinal de C. elegans alimentados con P. aeruginosa (Figura 3).
El objetivo de este estudio fue desarrollar protocolos optimizados que midan la permeabilidad intestinal de C. elegans,que se cambia por el tratamiento con diversas bacterias intestinales, así como con productos químicos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

En los organismos vivos, la hiperpermeabilidad intestinal es un síntoma grave que conduce a muchas enfermedades inflamatorias intestinales (EII). Caenorhabditis elegans es un modelo animal no mamífero que es ampliamente utilizado como un sistema de ensayo debido a su corta vida útil, transparencia, rentabilidad y falta de problemas de ética animal. En este estudio, se desarrolló un método para investigar los efectos de diferentes bacterias y 3,3'-diindolylmethane (DIM) en la permeabilidad intestinal de C. elegans con un sistema de análisis de imagen de alto rendimiento. Los gusanos fueron infectados con diferentes bacterias intestinales o cotratados con DIM durante 48 h y alimentados con isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran durante la noche. Luego, se examinó la permeabilidad intestinal comparando las imágenes de fluorescencia y la intensidad de la fluorescencia dentro de los cuerpos de gusanos. Este método también puede tener el potencial de identificar bacterias intestinales probióticas y patógenas que afectan la permeabilidad intestinal en el modelo animal y es eficaz para examinar los efectos de los productos químicos nocivos o que promueven la salud en la permeabilidad intestinal y la salud intestinal. Sin embargo, este protocolo también tiene algunas limitaciones considerables a nivel genético, especialmente para determinar qué genes se alteran para controlar la enfermedad, ya que este método se utiliza principalmente para la determinación fenotípica. Además, este método se limita a determinar exactamente qué sustratos patógenos causan inflamación o aumentan la permeabilidad de los intestinos de los gusanos durante la infección. Por lo tanto, se requieren más estudios en profundidad, incluida la investigación del mecanismo genético molecular utilizando bacterias y nematodos mutantes, así como el análisis de componentes químicos de bacterias, para evaluar completamente la función de las bacterias y los productos químicos para determinar la permeabilidad intestinal.

Después de la incubación con P. aeruginosa PAO1, C. elegans mostró un aumento significativo en la fluorescencia FITC-dextran en el cuerpo del gusano en comparación con la fluorescencia mostrada después de la incubación con las otras dos cepas bacterianas(Figura 1). Las intensidades de fluorescencia de los gusanos alimentados con E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 y E. faecalis KCTC3206 fueron de 100,0 a 6,6, 369,7 a 38,9 y 105,6 a 10,6%, respe...

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Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe cómo medir la permeabilidad intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método es útil para la investigación biológica básica sobre la salud intestinal relacionada con la interacción entre las bacterias intestinales y su huésped y para la detección para identificar agentes probióticos y químicos para curar el síndrome del intestino con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales.

Medición de los efectos de las bacterias y los productos químicos en la permeabilidad intestinal de los ceganes

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Este método será útil para estudios biológicos básicos relacionados con la interacción entre la microbiota intestinal y la salud intestinal. Además, Este protocolo se puede utilizar para la detección de posibles probióticos y nutracéuticos para curar problemas de salud intestinal, como síndrome intestinal con fugas y enfermedades inflamatorias intestinales. Este protocolo utiliza un sistema de imágenes de alto rendimiento para permitir un análisis cuantitativo rápido y preciso de la permeabilidad intestinal en C.elegans tratados con diversas bacterias y productos químicos.Recomendamos que un científico que no esté familiarizado con esta técnica limite el número de muestras para evitar el etiquetado incorrecto y otros errores. Este procedimiento consta de muchos pasos que requieren demostración visual, como la transferencia de gusanos a placas de 96 pozos y el uso de la máquina Operetta, así como el software Harmony. Comience preparando 500 mililitros de medio LB estéril.Inocular una sola colonia de P.aeruginosa en el medio, e incubar el cultivo durante 14 a 15 horas a 37 grados celsius mientras se agita a 150 rpm. Al día siguiente, distribuya uniformemente el cultivo bacteriano en dos tubos de 500 mililitros, y centrifugarlos a 3, 220 veces g y cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Retire el sobrenadante, dejando 25 mililitros en cada tubo, para un volumen restante total de 50 mililitros, luego resuspender el pellet bacteriano.Almacene el cultivo bacteriano a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para usar. Para probar los efectos de las bacterias en la permeabilidad intestinal de C.elegans, retire los cultivos del refrigerador, y vórtice a fondo. Agregue un total de 800 microlitros a cada placa NGM fresca, y deje que las placas se sequen en una incubadora de 20 grados Celsius durante la noche.Para preparar las placas DIM, agregue 50 mililitros de medio de agar NGM en una botella de caldo de DIM que contenga caldo NGM, y mezcle bien. Luego, vierta 20 mililitros del medio en cada plato Petri de 90 por 15 milímetros. Prepare las placas DMSO añadiendo 20 mililitros de DMSO que contengan el medio NGM a cada plato Petri, y deje las placas a temperatura ambiente durante al menos tres horas para solidificarse.Esparza 800 microlitros de cultivo de E.coli o P.aeruginosa con vórtice en cada placa NGM fresca, y deja que las placas se sequen en una incubadora de 20 grados Celsius durante la noche. Lave las larvas L4 sincronizadas por la edad con S-buffer y transfiera aproximadamente 500 gusanos a las placas NGM que contienen diferentes bacterias y productos químicos. Luego, incuba las placas a 20 grados centígrados durante 48 horas.Prepare las placas suplementadas con FITC-dextran mezclando dos mililitros de E.coli termoactivado con cuatro miligramos de FITC-dextran. Agregue 100 microlitros de la mezcla a cada una de las 20 placas de agar NGM frescas, y deje que las placas se sequen durante una hora en un banco de laboratorio limpio. Después de 48 horas de tratamiento, lave los gusanos con S-buffer, transfieralos a placas suplementadas con FITC-dextran y a placas NGM sin FITC-dextran, e incubar las placas durante la noche.Al día siguiente, lave los gusanos con S-buffer y déjelos arrastrarse en la placa de agar NGM fresca durante una hora. Agregue 50 microlitros de 4%formaldehído a cada pozo de una placa negra de 96 bien, de fondo plano, y transfiera aproximadamente 50 gusanos a cada pozo. Después de uno a dos minutos, retire todo el formaldehído y agregue 100 microlitros de medio de montaje en cada pozo.El formaldehído es un producto químico tóxico y debe manipularse con cuidado. Para capturar imágenes fluorescentes, pulse el icono Abrir tapa dentro del software de imágenes e inserte la placa en la máquina. Haga clic en Configuración, seleccione el tipo de placa y agregue los canales brightfield y EGFP.Para ajustar el diseño, vaya a la selección Diseño y seleccione Seguimiento. Establezca la primera imagen en un micrómetro, el número de planos a 10 y la distancia a un micrómetro. Seleccione uno de los pozos de tratamiento y un campo de captura, y pulse Probar en la sección Ejecutar experimento.Si las imágenes son satisfactorias, vuelva a la sección Configuración y pulse el icono Restablecer. A continuación, seleccione todos los pozos de destino y un número adecuado de campos de captura. Vaya a Ejecutar experimento, introduzca el nombre de la placa y pulse Inicio.Para medir la intensidad de la fluorescencia, vaya a la sección Análisis de imagen, introduzca la imagen y busque la celda eligiendo el canal EGFP y el método B.Ajuste los parámetros según las direcciones del manuscrito y elija la media como salida. Pulse el icono Aplicar para guardar la configuración. Para obtener un mapa de calor y una tabla de datos, vaya a la sección Evaluación y ajuste el parámetro de lectura y, a continuación, inicie la evaluación.C.elegans mostró un aumento significativo de la fluorescencia FITC-dextran después de la incubación con P.aeruginosa en comparación con las otras dos cepas bacterianas, lo que indica que P.aeruginosa causó más daño vital a la barrera intestinal epitelial y mayor permeabilidad intestinal. P.aeruginosa vivo e inactivado por calor desencadenó efectos muy diferentes sobre la permeabilidad intestinal en C.elegans. Tras la inactivación del calor, tanto las imágenes de fluorescencia como los datos estadísticos indican que P.aeruginosa no desencadenó toxicidad para los nematodos.Un co-tratamiento de 48 horas con DIM disminuyó significativamente la intensidad de fluorescencia FITC-dextran dentro de las tripas de los gusanos expuestos a P.aeruginosa, lo que demuestra que DIM puede considerarse un buen producto natural para curar la disfunción de la permeabilidad intestinal causada por infecciones bacterianas. Es importante recordar que durante la preparación de las placas recubiertas FITC-dextran, es necesario minimizar la exposición a la luz debido a la sensibilidad a la luz de FITC-dextran. Esta técnica se puede utilizar para determinar los efectos patógenos y probióticos de las bacterias intestinales y sus componentes activos mediante la prueba de las bacterias, así como su composición química.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

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Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

Investigación

Medicina

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A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

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Evaluación no invasiva de la eficacia de nuevas terapias para Intestinal Patologías recurriendo a imágenes de Endoscópica serie de ratones vivos

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

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Ex Vivo intestinal Sacs para evaluar la permeabilidad de la mucosa en modelos de enfermedad gastrointestinal

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir<em&gt; En Vivo</em&gt; Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analizar los efectos beneficiosos de los suplementos nutricionales sobre las funciones epitelial intestinal de barrera durante Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Medir el efecto de productos químicos sobre el crecimiento y reproducción de Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Un modelo murino de exposición fetal a la inflamación materna para estudiar los efectos de la coleamnionitis aguda en el desarrollo intestinal neonatal

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Assessing Strength Exercise Volume and Its Impact on Insulin Sensitivity in Obesity

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Exploring the Impact of Reduced Resistance Exercise Volume on Metabolic Health (Video) | JoVE

Ensayo controlado aleatorizado para estudiar los efectos agudos del ejercicio de fuerza sobre la sensibilidad a la insulina en adultos obesos

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