Name: measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2019-12-03T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Denna studie stöddes av ett Korea Institute of Science and Technology interna Research Grant (2e29563).

1. beredning av P. aeruginosa PAO1 och Escherichia coli OP50 kultur
<ol><li>Förbered 500 mL av steriliserat Luria-Bertani (LB) medium (tabell 1) och Inokulera en enda koloni av P. aeruginosa i mediet. Inkubera kulturen i 14 till 15 h vid 37 ° c med en skakhastighet på 150 RPM.</li>
	<li>Fördela bakteriekulturen jämnt i 2 500 mL centrifugrör och centrifugera rören vid 3 220 x g vid 4 ° c i 30 min.</li>
	<li>Ta bort supernatanten tills volymen är 50 mL (en tio...

<ol>
	<li>Bischoff, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+permeability&#8211;a+new+target+for+disease+prevention+and+therapy.">Intestinal permeability&#8211;a new target for disease prevention and therapy.</a> BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).</li><li>Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate+enhances+the+intestinal+barrier+by+facilitating+tight+junction+assembly+via+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+in+Caco-2+cell+monolayers.">Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers.</a> The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).</li><li>Ren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+intestinal+barrier+against+the+toxicity+of+graphene+oxide.">Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide.</a> Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).</li><li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group.">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li><li>Gelino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+autophagy+improves+healthspan+and+longevity+in+C.+elegans+during+dietary+restriction.">Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction.</a> PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).</li><li>Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+lipid+abundance+and+evaluation+of+lipid+distribution+in+Caenorhabditis+elegans+by+Nile+red+and+oil+red+O+staining.">Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).</li><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+disadvantages+of+Caenorhabditis+elegans+for+aging+research.">Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research.</a> Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).</li><li>Culetto, E., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Caenorhabditis+elegans+in+understanding+the+function+and+interactions+of+human+disease+genes.">A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes.</a> Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).</li><li>Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+germ+line:+A+model+for+stem+cell+biology.">Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).</li><li>Park, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+Lactobacillus+fermentum+strain+JDFM216+stimulates+the+longevity+and+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+through+a+nuclear+hormone+receptor.">Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor.</a> Scientific Reports. 8, 7441 (2018).</li><li>Kim, Y., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+immune+conditioning+with+the+probiotic+bacterium+Lactobacillus+acidophilus+strain+NCFM+enhances+gram-positive+immune+responses.">Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses.</a> Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).</li><li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+and+mechanisms+of+prolongevity+induced+by+Lactobacillus+gasseri+SBT2055+in+Caenorhabditis+elegans.">Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).</li><li>Dinh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranberry+extract+standardized+for+proanthocyanidins+promotes+the+immune+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+Vibrio+cholerae+through+the+p38+MAPK+pathway+and+HSF-1.">Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1.</a> PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).</li><li>Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+apple+extracts+increase+lifespan,+healthspan+and+resistance+to+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).</li><li>Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterococcus+faecalis+produces+extracellular+superoxide+and+hydrogen+peroxide+that+damages+colonic+epithelial+cell+DNA.">Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA.</a> Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).</li><li>Laughlin, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+PA-I+lectin+on+experimental+gut-derived+sepsis.">The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis.</a> Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+decreases+VCAM-1+expression+and+alleviates+experimental+colitis+via+a+BRCA1-dependent+antioxidant+pathway.">3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway.</a> Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).</li><li>Jeon, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Oral+Administration+of+3,3'-Diindolylmethane+on+Dextran+Sodium+Sulfate-Induced+Acute+Colitis+in+Mice.">Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-Diindolylmethane+improves+intestinal+permeability+dysfunction+in+cultured+human+intestinal+cells+and+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans.">3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).</li><li>Lee, S. Y., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+Effect+of+Chemicals+on+the+Growth+and+Reproduction+of+Caenorhabditis+elegans.">Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Al Atya, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+potential+of+Enterococcus+faecalis+strains+isolated+from+meconium.">Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).</li><li>Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Genus+Enterococcus:+Between+Probiotic+Potential+and+Safety+Concerns-An+Update.">The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).</li><li>Pollack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+exotoxin+A+in+pseudomonas+disease+and+immunity.">The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity.</a> Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).</li><li>Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+inactivating+factor+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A.">Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A.</a> Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).</li><li>Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+exotoxin+A,+peptidoglycan+and+endotoxin+after+exposure+of+clinical+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+to+carbapenems+in+vitro.">Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro.</a> Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).</li><li>Kirikae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+characterization+of+endotoxins+released+from+antibiotic-treated+Pseudomonas+aeruginosa+and+Escherichia+coli.">Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).</li><li>Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+A+is+dispensable+for+cell+intoxication.">Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).</li><li>Kim, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3,3'-diindolylmethane+attenuates+colonic+inflammation+and+tumorigenesis+in+mice.">3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).</li><li>Kanmani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotics+and+its+functionally+valuable+products-a+review.">Probiotics and its functionally valuable products-a review.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).</li><li>Nguyen, M. T., Gotz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).</li></ol>

Genom att utnyttja denna nya metod för att bestämma Gut permeabilitet i c. elegans, som kombinerar automatiserad fluorescens mikroskopi och kvantitativ bildanalys, kan de skillnader som orsakas av intestinal mikroorganismer eller kemikalier bestämmas in vivo, särskilt i C. elegans tarmen. Detta protokoll är användbart för Gut permeabilitet utredningar och gäller för många uppgifter, såsom reaktiva syreradikaler (ROS) bestämning under stressförhållanden och morfologiska undersökningar, på...

Intestinal permeabilitet anses vara en av de viktigaste hindren i samband med intestinal bakterieflora och slemhinnor immunitet och kommer sannolikt att påverkas av flera faktorer, såsom Gut bakterieflora modifieringar, epitelial försämring, eller slemskikt förändringar1. De senaste tidningarna har rapporterat effektiva protokoll för att mäta intestinal permeabilitet av odlade mänskliga tarmceller genom att analysera fluorescensen Flux priser över tarmen cell Layer2, men färre forskningsrapporter presentera ett lämpligt förfarande för att mäta tarmpermeabilitet i nematoder, särskilt i C. elegans, genom att använda FITC-dextran färgning.
Det finns två representativa protokoll för att mäta tarmpermeabiliteten i C. elegans med hjälp av Nile Red3 och erioglaucine dinatrium (eller Smurf-analysen)4,5. I detta protokoll använde vi FITC-dextran (medelmolekylvikt 10 000), som har en mycket högre molekylvikt än Nile Red (MW = 318,37) och erioglaucine dinatrio (MW = 792,85). FITC-dextran är mer liknande än Nile röd eller erioglaucine dinatriumfärgämnen till faktiska makromolekylära näringsämnen såsom kolhydrater, som absorberas genom tarm lagret. Den intestinala permeabiliteten hos C. elegans matas med erioglaucine dinatrium (blå Smurf Dye) kan enkelt utvärderas utan fluorescens mikroskopi. Men i Smurf analysen, kvantitativ analys av intestinal permeabilitet är svårt på grund av bristen på standardisering och bör utvärderas manuellt4,5. När det gäller Nilens röda analys fläckar Nilen Red också lipiddroppar i celler, vilket kan störa den exakta bestämningen av Gut permeabilitet i C. elegans6. De nuvarande protokollen möjliggör snabb och exakt kvantitativ analys av intestinal permeabilitet i C. elegans som behandlats med olika tarmbakterier och kemikalier samtidigt som man undviker ospecifik lipidfärgning.
C. elegans är en typisk modell i biologiska områden på grund av dess rimliga priser, enkel manipulation, begränsade djur etikfrågor, och kort livslängd, vilket är fördelaktigt för snabb experiment7. I synnerhet, efter att hela c. elegans genomet publicerades, nästan 40% av gener i C. elegans genomet befanns vara ortologous för gener som orsakar mänskliga sjukdomar8. Dessutom medger den genomskinliga kroppen observation inuti organismen, vilket är fördelaktigt för att forska cellulära händelser och för fluorescenstillämpningar i cellbiologi, till exempel, stamcells färgning med DAPI eller immunohistokemi9. C. elegans används ofta som försöksdjur för att studera samspelet mellan tarmfloran och värden; Dessutom, C. rymlns används för att skärmen hälsofrämjande probiotiska bakterier10,11,12 samt kost kemikalier främja intestinal hälsa13,14.
Pseudomonas aeruginosa och Enterococcus faecalis är välkända tarmbakterier som negativt påverkar det gastrointestinala systemet, särskilt kolon epitelceller i tarmkanalen15,16. Därför är att mäta den Gut permeabilitet utlöses av dessa bakterier är nödvändigt för screening och utveckling av nya läkemedel som kan återhämta sig och minska skadorna orsakade av bakteriell inflammation och infektion. I detta protokoll testade vi effekterna av dessa tarmbakterier på tarm permeabiliteten hos C. elegans.
Vi rapporterar också ett optimerat protokoll för att testa kemikalier på tarm permeabiliteten hos C. elegans. För detta ändamål, vi använde 3, 3 '-diindolylmethane (dim) som en modell kemikalie eftersom dim är en bioaktiva metabolit förening som härrör från indol-3-carbinol, som finns i Brassica mat växter, och har rapporterats ha terapeutiska effekter på IBD hos möss17,18. Dessutom upptäckte vi nyligen att DIM förbättrar intestinal permeabilitet dysfunktion i både odlade mänskliga tarmceller samt modellen Nematoden C. elegans19.
I denna studie använde vi tre olika försöksbetingelser. Först mätte vi effekterna av de olika bakterierna, P. aeruginosa och E. faecalis, på tarm permeabilitet (figur 1). För det andra mätte vi effekterna av levande och Värmeinaktiverade P. aeruginosa på tarm permeabilitet (figur 2). För det tredje mätte vi effekterna av DIM (en modell kemisk) på intestinal permeabilitet av C. elegans matas med P. aeruginosa (figur 3).
Syftet med denna studie var att utveckla optimerade protokoll som mäter tarm permeabiliteten hos C. elegans, som ändras genom behandling med olika tarmbakterier samt med kemikalier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >3,3&#8217;-diindolylmethane&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D9568</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >90&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60&#215;15 mm Petri dishes</td>
			<td >SPL Life Sciences, South Korea</td>
			<td >10060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bactor Agar</td>
			<td >Beckton Dickinson</td>
			<td >REF. 214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formaldehyde solution&#160;</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td>Wild type&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cholesterol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene</td>
			<td >Corning Incorporated</td>
			<td >REF. 3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Enterococcus faecalis KCTC 3206</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 3206</td>
			<td>Falcutative anaerobic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Escherichia coli OP50</td>
			<td >Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescein isothiocyanate - dextran</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >FD10S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Harmony software&#160;</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td ></td>
			<td>verson 3.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luria-Bertani LB medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td >VM743185 626&#160; 1.10285.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium sulfate heptahydrate&#160;</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP2213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount aqueous mounting medium</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Operetta CLS High-Content Analysis System</td>
			<td >PerkinElmer</td>
			<td>&#160;HH16000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptone</td>
			<td >Merck</td>
			<td >EMD 1.07213.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pseudomonas aeruginosa PA01</td>
			<td >Korean Collection for Type Culture</td>
			<td >KCTC NO. 1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo Microscope</td>
			<td >Nikon, Japan</td>
			<td >SMZ800N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >REF. 212750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the effects of bacteria and chemicals on the intestinal permeability of caenorhabditis elegans

I levande organismer, intestinal hyperpermeabilitet är ett allvarligt symptom som leder till många inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs). Caenorhabditis elegans är en icke däggdjur djurmodell som ofta används som ett analyssystem på grund av dess korta livslängd, transparens, kostnadseffektivitet, och brist på djur etikfrågor. I denna studie, en metod har utvecklats för att undersöka effekterna av olika bakterier och 3, 3 '-diindolylmethane (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans med ett högt dataflöde bildanalys system. Maskarna var infekterade med olika tarmbakterier eller cobehandlad med DIM för 48 h och utfodras med fluorescein isotiocyanat (FITC)-dextran över natten. Därefter undersöktes tarm permeabiliteten genom att jämföra fluorescensbilderna och fluorescensintensiteten inuti mask kropparna. Denna metod kan också ha potential att identifiera probiotiska och patogena tarmbakterier som påverkar intestinal permeabilitet i djur modellen och är effektiv för att undersöka effekterna av skadliga eller hälsofrämjande kemikalier på intestinal permeabilitet och intestinal hälsa. Detta protokoll har emellertid också vissa avsevärda begränsningar på genetisk nivå, särskilt för att bestämma vilka gener som ändras för att kontrollera sjukdom, eftersom denna metod används främst för fenotypisk bestämning. Dessutom är denna metod begränsad till att bestämma exakt vilka patogena substrat orsaka inflammation eller öka permeabiliteten av maskar tarmarna under infektion. Därför krävs ytterligare djupgående studier, inklusive undersökning av den molekylära genetiska mekanismen med muterade bakterier och nematoder samt kemisk komponent analys av bakterier, för att fullt ut utvärdera funktionen hos bakterier och kemikalier vid bestämning av tarmpermeabilitet.

Efter inkubering med P. aeruginosa PAO1 visade C. elegans en signifikant ökning i FITC-dextran-fluorescens i mask kroppen jämfört med fluorescensen som visades efter inkubering med de andra två bakteriestammarna (figur 1). Fluorescensintensiteten hos maskar som matas med e. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 och e. faecalis KCTC3206 var 100,0 ± 6,6, 369,7 ± 38,9 och 105,6 ± 10,6%. Data betona att P. aeruginosa orsakat mer vitala skador ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Detta protokoll beskriver hur man mäter intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans. Denna metod är till hjälp för grundläggande biologisk forskning om intestinal hälsa relaterade till samspelet mellan tarmbakterier och deras värd och för screening för att identifiera probiotiska och kemiska agenter för att bota läckande tarm syndrom och inflammatoriska tarmsjukdomar.

Mäta effekterna av bakterier och kemikalier på tarm permeabiliteten hos Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Denna metod kommer att vara till hjälp för grundläggande biologiska studier relaterade till samspelet mellan intestinal mikrobiota och gut hälsa. Dessutom, Detta protokoll kan användas för screening potentiella probiotika och nutraceuticals att bota intestinala hälsoproblem, såsom läckande tarm syndrom och inflammatoriska tarmsjukdomar. Detta protokoll använder ett bildsystem med hög genomströmning för att möjliggöra snabb och exakt kvantitativ analys av tarmgenomsläpplighet i C.elegans som behandlats med olika bakterier och kemikalier.Vi rekommenderar att en forskare som inte är bekant med denna teknik begränsar antalet prover för att undvika felmärkning och andra misstag. Denna procedur består av många steg som kräver visuell demonstration, till exempel att överföra maskar till 96-brunnsplattor och använda Operetta-maskinen, samt Harmony-programvaran. Börja med att förbereda 500 milliliter sterilt LB-medium.Inokulera en enda koloni av P.aeruginosa i mediet, och inkubera kulturen i 14 till 15 timmar vid 37 grader Celsius medan skakar vid 150 rpm. Nästa dag, jämnt fördela bakteriekulturen i två 500-milliliter rör, och centrifug dem på 3, 220 gånger g och fyra grader Celsius i 30 minuter. Ta bort supernatanten och lämna 25 milliliter i varje rör, för en total återstående volym på 50 milliliter, och återanvänd sedan bakteriepelleten.Förvara bakteriekulturen i fyra grader Celsius tills den är klar att användas. För att testa bakteriernas effekter på tarmpermeabiliteten hos C.elegans, ta bort kulturerna från kylskåpet och virvel dem noggrant. Tillsätt totalt 800 mikroliter till varje färsk NGM-platta, och låt plattorna torka i en 20-graders Celsius inkubator över natten.För att förbereda DIM plattor, tillsätt 50 milliliter NGM agar medium i en flaska DIM som innehåller NGM buljong, och blanda noggrant. Häll sedan 20 milliliter av mediet i varje 90-av-15-millimeters petriskål. Förbered DMSO-plattor genom att tillsätta 20 milliliter DMSO innehållande NGM-medium till varje Petri-skål, och låt plattorna vara i rumstemperatur i minst tre timmar för att stelna.Sprid 800 mikroliter av virvelad E.coli eller P.aeruginosa kultur på varje färsk NGM-platta, och låt plattorna torka i en 20-graders Celsius inkubator över natten. Tvätta de ålderssynkronerade L4-larverna med S-buffert, och överför ungefär 500 maskar till NGM-plattorna som innehåller olika bakterier och kemikalier. Sedan, inkubera plattorna vid 20 grader Celsius i 48 timmar.Förbered DEC-dextran-kompletterade plattorna genom att blanda två milliliter värme-inaktiverade E.coli med fyra milligram FITC-dextran. Tillsätt 100 mikroliter av blandningen till var och en av 20 färska NGM agar plattor, och låt plattorna torka i en timme på en ren lab bänk. Efter 48 timmars behandling, tvätta maskarna med S-buffert, för över dem till FITC-dextran-kompletterade plattor och till NGM-plattor utan FITC-dextran, och inkubera plattorna över natten.Nästa dag, tvätta maskarna med S-buffert, och låt dem krypa i den färska NGM agar plattan i en timme. Tillsätt 50 mikroliter av 4%formaldehyd till varje brunn av en svart, 96-brunn, plattbottnad platta och överför cirka 50 maskar i varje brunn. Efter en till två minuter, ta bort alla formaldehyd, och tillsätt 100 mikroliter av monteringsmedium i varje brunn.Formaldehyd är en giftig kemikalie och bör hanteras med försiktighet. För att fånga lysrörsbilder trycker du på ikonen Öppna lock inom bildhanteringsprogrammet och sätter in plattan i maskinen. Klicka på Installationsprogrammet, välj plåttyp och lägg till brightfield- och EGFP-kanalerna.Om du vill justera layouten går du till markeringen Layout och väljer Spår. Ställ in den första bilden på en mikrometer, antal plan till 10, och avståndet till en mikrometer. Välj en av behandlingsväldarna och ett infångningsfält och tryck på Testa i avsnittet Kör experiment.Om bilderna är tillfredsställande återgår du till avsnittet Setup och trycker på ikonen Återställ. Sedan väljer du alla mål brunnar och ett lämpligt antal fånga fält. Gå till Kör Experiment, ange skyltnamnet och tryck på Start.För att mäta fluorescensintensitet, gå till avsnittet Bildanalys, mata in bilden och hitta cellen genom att välja EGFP-kanal och metod B.Justera parametrarna enligt manuskriptets riktningar och välj medelvärdet som utdata. Tryck på ikonen Använd för att spara konfigurationen. Skaffa en värmekarta och en datatabell genom att gå till avsnittet Utvärdering och justera utläsningsparametern, starta sedan utvärderingen.C.elegans visade en signifikant ökning av FITC-dextran fluorescens efter inkubation med P.aeruginosa jämfört med de andra två bakteriestammarna, vilket indikerar att P.aeruginosa orsakade mer vital skada på epitelial gut barriär och ökad tarmpermeabilitet. Levande och värme-inaktiverade P.aeruginosa utlöste mycket olika effekter på tarmen permeabilitet i C.elegans. Vid värmeinaktivering indikerar både fluorescensbilderna och statistiska data att P.aeruginosa inte utlöste någon toxicitet för nematoder.En 48-timmars sambehandling med DIM minskade signifikant FITC-dextran fluorescens intensitet inuti tarmarna av maskar som utsätts för P.aeruginosa, som visar att DIM kan anses vara en bra naturlig produkt för att bota intestinal permeabilitet dysfunktion orsakad av bakteriella infektioner. Det är viktigt att komma ihåg att under beredningen av FITC-dextran-belagda plattor, måste du minimera ljusexponeringen på grund av ljuskänsligheten hos FITC-dextran. Denna teknik kan användas för att bestämma de patogena och probiotiska effekterna av tarmbakterier och deras aktiva komponenter genom att testa bakterierna, liksom deras kemiska sammansättning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

Measuring the Strength of Mice

Att mäta styrkan hos möss

Kondziela7 devised the inverted screen test and published it in 1964. It is a test of muscle strength using all four limbs. Most normal mice easily score ...

Measuring Frailty in HIV-infected Individuals. Identification of Frail Patients is the First Step to Amelioration and Reversal of Frailty

Mätning Frailty i HIV-infekterade individer. Identifiering av sköra patienter är det första steget till förbättrande och Återföring av Frailty

A simple, validated protocol consisting of a battery of tests is available to identify elderly patients with frailty syndrome. This syndrome of decreased ...

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Icke-invasiv bedömning av effektiviteten av New Therapeutics för Intestinal Sjukdomar Använda Serial Endoskopisk avbildning av Live Möss

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

Ex vivo Intestinal Sacs att bedöma Mukös permeabilitet i Modeller av gastrointestinal sjukdom

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Fosfor-31-magnetisk resonansspektroskopi: ett verktyg för att mäta<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial oxidativ fosforylering Kapacitet i human skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Analysera gynnsamma effekterna av Kosttillskott på intestinala epiteliala barriärfunktioner Under experimentell kolit

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Mäta effekten av kemikalier på tillväxt och reproduktion av Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

En murinmodell av fosterexponering för moderns inflammation för att studera effekterna av akut chorioamnionitis på nyfödda tarmutveckling

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

Isolering av murin tarmmesenkym vilket resulterar i ett högt utbyte av telocyter

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Assessing Strength Exercise Volume and Its Impact on Insulin Sensitivity in Obesity

Randomized Controlled Trial to Study the Acute Effects of Strength Exercise on Insulin Sensitivity in Obese Adults

Exploring the Impact of Reduced Resistance Exercise Volume on Metabolic Health (Video) | JoVE

Randomiserad kontrollerad studie för att studera de akuta effekterna av styrketräning på insulinkänslighet hos överviktiga vuxna

An acute session of strength exercise (SE) ameliorates insulin sensitivity (IS) for several hours; however, the effects of SE volume (i.e., number of ...