Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل وكاله الدفاع عن الحد من التهديد (DTRA) أرقام المشروع CB-البذور-SEED09-0061 و CBCall4-CBM-05-2-0019 ، وجزئيا من قبل برنامج البحوث داخل المبني/خارج الأورال من NCATS ، المعاهد القومية للصحة (XH) والبحوث البحرية قاعده مختبر الصناديق.

الآراء المعرب عنها هنا هي تلك التي للمؤلفين ولا تمثل تلك التي من الولايات الامريكيه البحرية ، الجيش الأمريكي ، الولايات الامريكيه وزاره الدفاع ، أو الحكومة الامريكيه.

ولا ينظر إلى التدمير الخاص بالتسلسل للبروتين أو الحمض النووي الموجه بتسلسل أجنبي الا في حالات قليله في علم الاحياء. أليات المبينة في الشكل 1 هي أليات الدفاعية التي تحمي المضيف من فيروس ، أو فيروس من المضيف.
باستخدام أساليب المعلوماتية الحيوية يمكننا تحديد الأهداف التي دمرتها هذه الانظمه. في تحليلاتنا لمتواليات SSHHP ، اكتشفنا ان العديد منها يمكن العثور عليها في البروتينات اللازمة لتوليد الاستجابات المناعية الفطرية. وكان بعض الأدوار واضحة مثل mavs و trif (TIR-المجال التي تحتوي علي محول-يحفز المضادة للفيروسات-β) ، في حين ان البعض الآخر كانت تتعلق الحصانة علي الرغم من أليات أكثر تعقيدا (علي سبيل المثال ، histone H3 ، SFRP1 ، FOXG1)8،9. المعلومات الهدف المخزنة في تسلسل SSHHP لديه القدرة علي تحديد المسارات التي لها تاثيرات مضاده للفيروسات ضد هذه الفيروسات. الاستجابات المضادة للفيروسات في فيفو غالبا ما تكون محدده الفيروسات26,43. علي سبيل المثال ، مجموعات فرعيه من البروتينات تقليم لها اثار مضاده للفيروسات علي مختلف الفيروسات43،44،45، وبعضها عوامل تقييد الفيروسية (علي سبيل المثال ، فيروس نقص المناعة الTRIM5α). خصوصية البروتينات تقليم (~ 70 وقد تم تحديد) لا يزال يجري فحص44،45. المعلومات داخل SSHHPS قد تسهم في فهمنا لكيفيه التهرب من هذه الفيروسات الاستجابات المناعية الفطرية. ويمكن الكشف عن أنماط أخرى والارتباطات كما يتم فحص مزيد من SSHHPS.
وكانت الاختلافات الخاصة بالأنواع واضحة في تحليلاتنا (الشكل2، الشكل 10). ومن المعروف ان هذه الفيروسات تؤثر علي بعض الأنواع أكثر من غيرها. قد تكون معلومات حول نطاق المضيف وقابليه المضيف ودفاعات المضيف موجودة داخل SSHHPS. علي سبيل المثال ، الخيول ، والأنواع الأكثر عرضه للفيروسات التهاب الدماغ الخيول ، تفتقر إلى منطقه TRIM14 البشرية التي تم قطعها بشكل عابر من قبل الانزيم البروتيني VEEV nsP2. البشر نادرا ما يموتون من التهابات VEEV ولكن يمكن ان يصاب24. الإنسان TRIM14 البروتين حملت nsP2 البروتيني الانقسام تسلسل6. يشير وجود موقع الانشقاق إلى ان البشر لديهم اليه دفاعيه ضد هذه الفيروسات. وقد يعتقد ان الطيور الخزانات المحتملة لهذه الفيروسات46. واختلف تسلسل SSHHP المقابل في بروتين TRIM14 من الدجاج عن المتواليات الموجودة في البشر والأنواع الأخرى. قد تجعل الاختلافات خفيه مثل هذه أونكليافابلي البروتين المضيف الهدف أو أكثر بسهوله المشقوق. واظهر اغيري وآخرون16 ان بروتين سلسله أونكليافابلي تحور المستحثة مستويات اعلي من ifn بعد عدوي فيروس الضنك وان الفئران تحمل بطبيعة الأمر نسخه من لدغه التي لا تقطعها حمي الضنك ns2B3 البروتياز. لم يتم قطع البروتين المغلف murine بواسطة الانزيم البروتيني ZIKV47. في تحليل SSHHPS لدينا ، لاحظنا أيضا الاختلافات في تسلسل الانقسام زيكف البروتياز الموقع عندما قارننا البروتينات البشرية مع تلك القوارض6 (الشكل 10د). قد يكون استنساخ انقسامات البروتينية الخاصة بالأنواع من البروتينات المضيفة مهما في النماذج الحيوانية المستخدمة لفيروسات المجموعة الرابعة. تثبيط انشقاق البروتين المضيف له أيضا اثار فيما يتعلق بتطوير مثبطات الانزيم البروتيني المجموعة الرابعة. في المنشور السابق ، أظهرنا اننا يمكن ان تمنع TRIM14 الانقسام من قبل البروتيني VEEV nsP2 باستخدام CA074 استر الميثيل6. وتشير هذه النتيجة إلى ان مثبطات جزيء صغير من هذه بروتياسيس قد تكون قادره علي تعديل الاستجابات المناعية الفطرية التي هي قادره علي قمع العدوى6,31.
الاختلاف الجيني داخل الأنواع أيضا لديه القدرة علي إنتاج الاختلافات في الانقسام البروتيني. الاختلافات خفيه في استخدام كودون يمكن ان تؤثر علي الريبوسوم التوقف48. وبما ان بعض البروتينات الفيروسية المجموعة الرابعة مضمنه في غشاء الحركة المؤقتة ، فان الاختلافات في هذه التوقفات يمكن ان تؤثر علي انشقاق الهدف إذا حدث الانشقاق بشكل مشترك. وكانت بعض المواقع الانشقاق التي حددناها في تسلسل الببتيد اشاره المتوقعة (علي سبيل المثال ، SFRP1) في حين ان البعض الآخر كانت داخلية.
تحليل SSHHPS يمكن ان تنتج المعلومات التي تختلف عن غيرها من أساليب تحليلات البروتين المضيف. وكان تحليل SSHHPS غير مكلفه وسهله الاستخدام. وقد سمح استخدام نظام التعبير البكتيري باختبار الأجزاء القصيرة (~ 25 من الأحماض الامينيه) من متواليات الثدييات دون استخدام ثقافة خلايا الثدييات. وجدنا ان ركائز اف بي اف-YFP كانت قادره علي تحمل كل من تسلسل البروتين البشري اختبارها; ومع ذلك ، تباينت الغلة. في اختبارات مماثله, ركائز التي تحتوي علي تسلسل البروتين البشري طالما تم التعبير عن الأحماض الامينيه 63 بنجاح, تنقيه, وتستخدم للتحليلات الحركية وفحص المثبط49,50,51. بما ان فقط كميات صغيره من الركيزة لازمه لمقايسة متقطعه, [ا لرج نومبر] الأهداف يستطيع كنت استكشفت. ومن مزايا هذا النظام انه يمكن استخدام الركائز التي تستخدم في التحليل التفصيلي لصفحات المخزونات والتحليلات الحركية الأكثر تفصيلا (اي IC50، ki، km، Vmax). لاكتشاف المخدرات ، يمكن ان تنتج المركبات المثبطة التحف في اختبارات الفلورسنت. وهكذا ، فان الفحص المتقطع في تركيبه مع الفحص المستمر يسمح لأحد بتاكيد الانشقاق أو تثبيط الانقسام. ويمكن أخذ العينات الخاصة بالمقايسة المتقطعة لصفحات SDS مباشره من لوحات 96. وقد استخدمت ركائز الباسيفيكي/YFP لمكتبه مجمع الفرز52. غير انه يلزم اجراء تحليلات اضافيه لتحديد ما إذا كانت الركيزة مناسبه للفحص العالي الإنتاجي مثل حساب العامل Z53.
تحدي واحد في تصميم الركيزة هو تحديد المنطقة حول السندات سسيسيلي التي هي ملزمه والمعترف بها من قبل الانزيم البروتيني. في الامثله المعروضة هنا ، بدانا مع 12 تسلسل بقايا التي كانت تتمحور حول السندات سسيسيلي. بعد يحلل تسلسل تحالفات من الانشقاق موقعات [هومولوج] إلى البقايا [ن-ترمينل] من ال [سسيسيلي بوند] كان أسست ل ال [فيف] البروتياز, حيث ان ل ال [زيكف] البروتياز [هوثلوج] إلى عده من ال [ك-ترمينل] رواسب كان أسست. ويمكن استخدام نموذج سيليكو من الركيزة رست لتصميم التجارب الطفرات الموجهة الموقع التي التحقيق في مواقع ملزمه من الركيزة. بما ان الركيزة وانزيم تسلسل علي البلازميدات, اما يستطيع كنت تحورت ان يختبر ال في [سلكو] نماذج أو موقعات فرعيه تفاوت. وهذا يمكن ان يكون مفيدا إذا كان هيكل الكريستال من الركيزة (ق) ملزمه غير متوفر.
وقد ينتج عن تحليل SSHHPS أيضا معلومات جديده عن أليات التي تنتج عن طريق الانزيمات الفيروسية الأنماط الظاهرية المستحثة بالفيروس. واحده من الأهداف zikv ، SFRP1 ، هو جزء من مسار الإشارات wnt ولها ادوار في كل من تنميه الدماغ والعين وفي الاستجابات المناعية36،37،54،55،56،57. وجدنا ان متواليات البروتين الأخرى التي يمكن ان تقطعها زيكف ns2B/ns3 البروتياز كانت أيضا في البروتينات المشاركة في تنميه المخ والعين; لوحظ وجود تشوات في كل من متلازمة زيكا الخلقية ويعتقد انها جزء من النمط الظاهري المستحث بالفيروس58.
ويمكن استغلال امكانيه التنبؤ بالتفاعلات بين المضيف والممرض بالنسبة لمجموعه متنوعة من التطبيقات: العلاجات الفيروسية المحددة الهدف ؛ أزاله المخاطرة بلقاحات الفيروسات الحية ؛ صقل النماذج الحيوانية أو التنبؤ بها أو اختيارها ؛ التنبؤ بالنطاق المضيف أو القابلية ؛ التنبؤ بالاحداث الحيوانية الحيوانية ؛ والتنبؤ بالدفاعات المضيفة. وبما ان الأساليب الموصوفة تستند إلى التسلسل ، فانها قد تكون ذات قيمه لدمجها في البرمجيات في المستقبل.

دليل علي نقل الجينات الأفقي من الفيروس إلى المضيف ، أو المضيف للفيروس ، يمكن العثور عليها في مجموعه متنوعة من الجينوم1،2،3،4. أمثله من اندوجينوشن الفيروسية هي سلاسل الفاصل CRISPR وجدت في الجينوم المضيف البكتيرية4. في الاونه الاخيره ، وجدنا أدله علي تسلسل البروتين المضيف جزءا لا يتجزا من البروتينات المتعددة غير الهيكلية من (+) الفيروسات المجموعة الرابعة أسا نا. ويمكن نشر هذه المتواليات داخل مناطق الترميز من الجينوم الفيروسي بصفه عامه. يتم العثور علي امتدادات قصيرة من متواليات بروتين المضيف الذاتية (sshhps) في الفيروس والمضيف5,6. Sshhps هي تسلسل عزر موقع الانقسام المحفوظة المعترف بها من قبل بروتينيه الفيروسية التي لديها التنادد للبروتينات المضيف محدده. هذه المتواليات مباشره تدمير البروتينات المضيفة المحددة.
في المنشور السابق6، قمنا بتجميع قائمه بجميع البروتينات المضيفة التي استهدفتها البرواسات الفيروسية ووجدت ان قائمه الأهداف كانت غير عشوائية (الجدول 1). وقد ظهر اتجاهان. أولا ، ان غالبيه البروبروتياسات الفيروسية التي قطعت البروتينات المضيفة تنتمي إلى فيروسات المجموعة الرابعة (24 من 25 حاله تتعلق بالمجموعة الرابعة من البرواسات الفيروسية) ، وينتمي أحد البروتياز إلى فيروس العوز المناعي البشري (+) المجموعة السادسة للفيروسات الرجعية (HIV). ثانيا ، كانت أهداف البروتين المضيف التي يتم قطعها بواسطة البرواسات الفيروسية تشارك عموما في توليد الاستجابات المناعية الفطرية مما يوحي بان الانقسامات كانت تهدف إلى معاداه الاستجابات المناعية للمضيف. وكان نصف البروتينات المضيفة التي تستهدفها البرواسات الفيروسية مكونات معروفه من السلاسل التعاقبية التي تولد مضادات الفيروسات (IFN) والخلوية التهابيه (الجدول 1). وشاركآخرون فينسخ الخليةالمضيفة8أو9أو10 أو الترجمة11. ومن المثير للاهتمام, وقد أظهرت شماكوف et al.4 ان العديد من المتواليات protospacer كريسبر تتوافق مع الجينات المشاركة في الاقتران البلازميد أو النسخ المتماثل4.
وتشمل المجموعة الرابعة ، من بين أمور أخرى ، فلافيريداي ، وبيكورنافريداي ، والكورونا التاجية ، والكالسيفيريد ، والتوافيريداي. وينتمي العديد من مسببات الامراض الجديدة والناشئة إلى المجموعة الرابعة مثل فيروس زيكا ، وغرب النيل ، وشيكونغونيا (CHIKV) ، وفيروس المتلازمة التنفسية الحاده الوخيمة (سارس) ، وفيروس متلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS). (+) الجينوم أسا نا هو أساسا قطعه من mRNA. لإنتاج الانزيمات اللازمة للنسخ المتماثل الجينوم ، يجب ان تترجم (+) الجينوم أسانا أولا. في الفيروسات الفا وغيرها من الفيروسات المجموعة الرابعة ، يتم إنتاج الانزيمات اللازمة للنسخ المتماثل في بوليبروتين واحد (اي ، nsP1234 ل VEEV). والبروتينات غير الهيكلية (nsP) هي معالجه بروتينيه (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) من قبل الانزيم البروتيني nsP2 لإنتاج نشطه12 (الشكل 1). انشقاق بوليبروتين من قبل البروتياز nsP2 ضروري للنسخ المتماثل الفيروسية. وقد ثبت هذا عن طريق الحذف والطفرات الموجهة إلى الموقع من السيستين الموقع النشط من nsP2 البروتياز13,14. وعلي وجه الخصوص ، فان ترجمه البروتينات الفيروسية تسبق احداث النسخ المتماثل الجينوم. علي سبيل المثال ، يحتوي nsP4 علي البوليميجين الRNA التابع للجيش الريبي النيبالي الذي يحتاج إلى تكرار (+) جينوم أسا نا. يمكن ان تنتج النسخ المتماثل الجينوم وسيطه dsRNA; هذه الوسيطة يمكن ان تؤدي إلى الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف. وهكذا, هذه الفيروسات قد يلتصق المضيف البروتينات استجابه المناعية الفطرية في وقت مبكر من العدوى من أجل قمع اثارها15,16,17.
يمكن ان يحدث إسكات علي مستوي الحمض النووي ، RNA ، والبروتين. ما هو شائع لكل من أليات إسكات المبينة في الشكل 1 هو ان الحمض النووي الأجنبي قصيرة ، RNA ، أو تسلسل البروتين تستخدم لتوجيه تدمير أهداف محدده لمعاداه وظيفتها. وتتشابه أليات إسكات الأصوات في برامج "البحث والحذف" التي كتبت بثلاث لغات مختلفه. يماثل تسلسل موقع الانشقاق القصير "الكلمة الرئيسية". يحتوي كل برنامج علي انزيم يتعرف علي التطابق بين التسلسل القصير ("الكلمة الرئيسية") وكلمه في "الملف" الذي سيتم حذفه. وبمجرد العثور علي المباراة ، والتخفيضات انزيم ("يحذف") تسلسل الهدف أكبر. وتستخدم أليات الثلاث المبينة في الشكل 1 للدفاع عن المضيف من الفيروسات ، أو للدفاع عن فيروس من الجهاز المناعي للمضيف.
بروتينيه الفيروسية الاعتراف قصيرة الانشقاق عزر الموقع بين ~ 2-11 الأحماض الامينيه; في [نوكليودس], يماثل هذا إلى 6-33 قواعد. للمقارنة, [كريبر] فاصل تسلسل [~ 26-72 [نوكليودس] و [رناي] ~ 20-22 [نوكليودس]18,19. وفي حين ان هذه التسلسلات قصيرة نسبيا ، فانه يمكن التعرف عليها علي وجه التحديد. ونظرا للتنوع العالي للأحماض الامينيه ، فان احتمال حدوث انشقاق عشوائي منخفض نسبيا بالنسبة للبروتيز الفيروسي الذي يميز بين تسلسل البروتين من الأحماض الامينيه 6-8 أو أطول. التنبؤ SSHHPS في البروتينات المضيفة سوف تعتمد إلى حد كبير علي خصوصية الانزيم البروتيني الفيروسي يجري فحصها. إذا كان الانزيم البروتيني لديه متطلبات محدده تسلسل صارمة فرصه العثور علي تسلسل موقع الانشقاق هو 1/206 = 1 في 64,000,000 أو 1/208 = 1 في 25,600,000,000; ومع ذلك ، معظم بروتينيه لديها تفاوت التحمل الفرعي (علي سبيل المثال ، R أو K قد يكون التسامح في موقع S1). التالي ، لا يوجد شرط للهوية المتسلسلة بين التسلسلات الموجودة في المضيف مقابل الفيروس. للبروتينات الفيروسية التي لديها متطلبات تسلسل أكثر مرونة (مثل تلك التي تنتمي إلى Picornaviridae) احتمال العثور علي موقع الانشقاق في البروتين المضيف قد تكون اعلي. العديد من المدخلات في الجدول 1 هي من عائله Picornaviridae .
Schechter & بيرغر التدوين20 يستخدم عاده لوصف البقايا في الركيزة البروتيني والمواقع الفرعية التي تربط ، ونحن نستخدم هذا التدوين في جميع انحاء. ويشار إلى البقايا في الركيزة التي هي N-الطرفية للسندات سسيسيلي ك P3-P2-P1 في حين ان تلك التي هي C-الطرفية هي المشار اليها باسم P1'-P2'-P3 '. المواقع الفرعية المقابلة في البروتياز التي تربط هذه بقايا الأحماض الامينيه هي S3-S2-S1 و S1'-S2' ' ، علي التوالي.
لتحديد البروتينات المضيفة التي يتم استهدافها ، يمكننا تحديد SSHHPS في المواقع الفيروسية الانقسام بوليبروتين والبحث عن البروتينات المضيفة التي تحتوي عليها. هنا, نحن الخطوط العريضة لإجراءات لتحديد SSHHPS باستخدام المعروفة الفيروسية البروتيني الانقسام موقع تسلسل. والغرض من أساليب المعلوماتية الحيوية ، واختبارات الانزيم البروتيني ، وأساليب السيبيكو الموصوفة ، هو استخدامها بالاقتران مع الاختبارات القائمة علي الخلايا.
وقد كشفت محاذاة تسلسل البروتينات المضيفة التي تستهدفها البرواسات الفيروسية الاختلافات الخاصة بالأنواع داخل هذه التسلسلات القصيرة لموقع الانشقاق. علي سبيل المثال ، تم العثور علي فيروس التهاب الدماغ الفروسية الفنزويلي (VEEV) nsP2 البروتياز لخفض TRIM14 الإنسان ، وهو الثلاثي عزر (تريم) البروتين6. بعض البروتينات تريم هي عوامل التقييد الفيروسية (علي سبيل المثال ، TRIM5α21) ، ويعتقد معظم ان تكون اوبيكويتين E3 ligases. TRIM14 يفتقر إلى عصابه (الجينات الجديدة مثيره للاهتمام حقا) المجال ولا يعتقد ان يكون E3 يغاز22. وقد اقترح TRIM14 ليكون محول في signalosome المضادة للفيروسات الميتوكوندريا (مافس)22، ولكن قد يكون الوظائف المضادة للفيروسات الأخرى23. محاذاة تسلسل TRIM14 من الأنواع المختلفة يظهر ان الخيول تفتقر إلى موقع الانشقاق والميناء نسخه مقتطعه من TRIM14 التي تفتقد المجال C-الطرفية PRY/SPRY. يحتوي هذا المجال علي موقع polyubiاسكيتامييشن (الشكل 2). في الخيول ، وهذه الفيروسات هي قاتله للغاية (~ 20-80 ٪ وفيات) في حين ان في البشر فقط ~ 1 ٪ يموتون من العدوى VEEV24. قد انشقاق المجال حدق/SPRY عابره دائره قصيرة الإشارات MAVS تتالي. يمكن ان يتم تشغيل هذا التتالي من قبل dsRNA ويؤدي إلى إنتاج السايتوكينات مضاده للفيروسات والموالية للالتهابات. التالي ، قد يكون وجود SSHHPS مفيدا للتنبؤ بالأنواع التي لديها أنظمه دفاعيه ضد فيروسات معينه من المجموعة الرابعة.
في فيروسات المجموعة الرابعة ، ويعتقد ان أليات العداء IFN ان تتضاعف زائده25. قد يكون انشقاق البروتين المضيف عابرا اثناء العدوى وقد تتعافي التركيزات مع مرور الوقت. وجدنا في الخلايا التي يمكن الكشف عن المنتجات TRIM14 الانقسام في وقت مبكر جدا بعد الانتقال (6 ح) مع ترميز البلازميد البروتيني (مروج الفيروس المضخم للخلايا). ومع ذلك ، في فترات أطول ، لم يتم الكشف عن منتجات الانشقاق. في الخلايا المصابة بالفيروس ، كانت حركيه مختلفه ويمكن الكشف عن منتجات الانشقاق بين 6-48 ح6. وأفادت الآخرين ظهور المنتجات البروتين المضيف الانقسام في وقت مبكر كما 3-6 h آخر العدوى9,11.
وغالبا ما يكون من الصعب الإمساك بالنشاط البروتيني في الخلايا ؛ منتجات الانشقاق يمكن ان تختلف في الذوبان ، والتركيز ، والاستقرار ، والعمر. في الاختبارات المستندة إلى الخلايا ، لا يمكن افتراض ان المنتجات الانشقاق سوف تتراكم في خليه أو ان كثافة الفرقة من البروتين قطع وتقطيعه سوف تظهر زيادات التعويضية والانخفاضات كما البروتين قطع قد يكون المتدهورة بسرعة كبيره وقد لا تكون قابله للكشف في وصمه عار الغربية في الوزن الجزيئي المتوقع (ميغاواط) المنطقة التي تحتوي علي المربه يمكن ان تكون مشقوقة بواسطة البرواسات المضيفة الأخرى أو يمكن ان تكون اوبيتاميناتيد). إذا كانت ركيزة الانزيم البروتيني الفيروسي هو بروتين الاستجابة المناعية الفطرية ، قد يختلف تركيزه اثناء العدوى. علي سبيل المثال ، بعض بروتينات الاستجابة المناعية الفطرية موجودة قبل العدوى الفيروسية ويتم الحث عليها بشكل أكبر من قبل مضادات الفيروسات26. التالي قد تتذبذب تركيز البروتين المستهدف اثناء العدوى وقد يكون من الصعب تفسير المقارنة بين الخلايا المصابة. بالاضافه إلى ذلك ، قد لا يتم نقل جميع الخلايا بشكل موحد أو أصابه. في اختبارات البروتياز المختبر باستخدام البروتينات المنقية من e. كولاي من ناحية أخرى لديها اقل المتغيرات التي للسيطرة ويمكن القيام به مثل هذه المقايسات باستخدام SDS-PAGE بدلا من المناعية. تلوث بروتينيه يمكن ان تثبط في الخطوات المبكرة لتنقيه البروتين من الركيزة ف ب/س ، ويمكن تنقيه بروتينيه الفيروسية تحور واختبارها كضوابط لتحديد ما إذا كان الانقسام بسبب الانزيم البروتيني الفيروسي أو البروتينية البكتيرية الملوثة.
أحد القيود في اختبارات الانزيم البروتيني في المختبر هو انها تفتقر إلى تعقيد خليه الثدييات. لانزيم لقطع الركيزة ، يجب ان تكون مشتركه بين الاثنين. المجموعة الرابعة بروتينيه الفيروسية تختلف في البنية والتعريب. علي سبيل المثال ، يتم تضمين الانزيم البروتيني ZIKV في غشاء الشبكية الإندوبلازمي (ER) ويواجه cytosol ، في حين ان انزيم VEEV nsP2 هو بروتين قابل للذوبان في السيتوبلاسما والنواة27. وكانت بعض متواليات موقع الانشقاق الموجودة في تحليل زيكف SSHHPS في الببتيدات اشاره مما يوحي بان الانشقاق قد تحدث بالتناوب لبعض الأهداف. التالي ، فان موقع الانزيم البروتيني والركيزة في الخلية أيضا بحاجه إلى ان تؤخذ في الاعتبار في هذه التحليلات.
يمكن ان تكون الاختبارات المستندة إلى الخلايا قيمه لإنشاء دور للبروتين (البروتينات) المضيف المحدد في العدوى. الطرق التي تهدف إلى وقف الفيروسية البروتيني الانقسام من البروتينات المضيفة مثل أضافه مثبط الانزيم البروتيني6 أو طفرة في الهدف المضيف16 يمكن استخدامها لفحص اثارها علي النسخ المتماثل الفيروسية. وقد يؤثر الإفراط في التعبير عن البروتين المستهدف أيضا علي النسخ المتماثل الفيروسي28. يمكن استخدام اختبارات البلاك أو طرق أخرى لقياس النسخ المتماثل الفيروسي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

يتم توليف الانزيمات الفيروسية في ببتيد واحد. يتم معالجه بوليبروتين غير الهيكلية (nsP) بواسطة البروتياز nsP2 السيستين لإنتاج الانزيمات النشطة الضرورية للنسخ المتماثل الفيروسية. بروتينيه الفيروسية هي محدده للغاية والاعتراف المحفوظة الانقسام عزر موقع التسلسل (~ 6-8 الأحماض الامينيه). في العديد من الفيروسات في المجموعة الرابعة ، يمكن العثور علي متواليات الموقع الانشقاق البروتيني nsP في البروتينات المضيفة المحددة المشاركة في توليد الاستجابات المناعية الفطرية ، وفي بعض الحالات ، يبدو ان البروتينات المستهدفة مرتبطة بالنمط الظاهري المستحث بالفيروس. تستخدم هذه الفيروسات مسافات قصيرة من متواليات بروتين المضيف المسبب للمرض (SSHHPS) للتدمير المستهدف للبروتينات المضيفة. لتحديد SSHHPS الفيروسية البروتيني الانقسام عزر الموقع يمكن إدخالها في الانفجار والجينوم المضيف (ق) يمكن البحث. الانقسام في البداية يمكن اختبارها باستخدام nsP المنقي الفيروسية والفلورية الرنين نقل الطاقة (الحنق) ركائز المحرز في e. القولونية. وتحتوي ركائز التاكل علي بروتين فلوري ازرق سماوي واصفر وتسلسل موقع الانشقاق (التسلسل الرقمي المتسلسل-YFP). ويمكن استخدام هذا الفحص البروتيني بشكل مستمر في قارئ لوحه أو بشكل متقطع في الهلام SDS-PAGE. ويمكن توليد نماذج من ركائز الببتيد ملزمه في سيليكو لتوجيه اختيار الركيزة والدراسات الطفرات. وقد استخدمت أيضا ركائز الباسيفيكي/YFP لتحديد مثبطات الانزيم البروتيني. ويمكن استخدام هذه في المختبر وأساليب سيليكو في تركيبه مع الاختبارات القائمة علي الخلايا لتحديد ما إذا كان البروتين المضيف المستهدفة يؤثر علي النسخ المتماثل الفيروسية.

التحليل SSHHPS لل ZIKV ns2B/3 البروتيني حددت 4 أهداف البروتين المضيف: FOXG1, SFRP1, زs الفا الوحدة الفرعية من مكتبه cdna الشبكية, و NT5M الميتوكوندريا 5 ', 3 '-النيوبوتيداز (الشكل 10)6. ولا سيما ، لم توقع اي طريقه أخرى هذه البروتينات كاهداف محتمله للبروتيز ZIKV. وقد تم ربط الطفرات في الجينات FOXG1 إلى متلازمة خلقيه تتميز بضعف التنمية وتشوات الدماغ الهيكلية مثل ميكروسيفاي. SFRP1 هو البروتين المرتبطة التي يفرزها frizzled (SFRP) ؛ هذه المستقبلات القابلة للذوبان يمكن ربط تنافسيه wnt يغاندس لمعاداه وتمنع wnt الإشارات. وتشارك في المسار الإشارات Wnt في تنظيم استجابه IFN خلال الاصابه36العدوى الفيروسية. ومن المتوقع ان الانشقاق من SFRP1 لتعزيز النسخ المتماثل فلايروفيروس. SFRP1 وتشارك أيضا في التمايز Th17 الخلية37. وأظهرت التسلسلات المتوالية لل SSHHPS اختلافات خاصه بالأنواع في متواليات موقع الانشقاق (الشكل 10د). وكان تسلسل موقع الانشقاق في SFRP1 متطابقة في البشر والدجاج. يمكن ان يحفز زيكف الوفاات وصغر الراس في أجنه الدجاج38. في القوارض ، يتم استبدال بقايا P1 المحفوظة للغاية (K/R) R ↓ G بواسطة الجليسين (RGG). سلالات مناعية من الفئران هي عموما مقاومه للعدوى ZIKV والمرض39.
يمكن قياس المعلمات الحركية الثابتة للدولة وثوابت التثبيط لمتواليات بوليبروتين الفيروسية ولمتواليات البروتين المضيف باستخدام الفحص المستمر في لوحه القارئ31,40,41 (الشكل 11ا). لمعلومات الانقسام النوعي ، مثل انشقاق تسلسل معين أو تثبيط الانزيم البروتيني من قبل مركبات مختلفه ، يمكن استخدام الفحص المتقطع (الشكل 11ب).
قد تكون هناك حاجه إلى الاستفادة المثلي من عدد البقايا في الفترة ما بين الباسيفيكي و YFP. ويمكن اجراء نموذج الركيزة المرتبطة باستخدام أساليب سيليكو. ويبين الشكل 9نموذجا راسيا لتقاطع NsP1/nsP2. ل VEEV nsP2 البروتياز ، وقد تم الإبلاغ عن انشقاق من 12-الأحماض الامينيه Semliki الفيروسات الغابات (SFV) تسلسل (Km = 0.58 mM)33. أطاله تسلسل الركيزة إلى 19 ، 22 ، و 25 بقايا والحد من القوه الايونيه للمخزن المؤقت ادي إلى انخفاض كبير في Km. فحص هيكل الكريستال VEEV nsP2 والتعبئة والتغليف الكريستال وأظهرت أيضا ان جزءا من واحده من التقاطعات كانت معباه ضد المجال البروتياز وكان حلزونية. وهكذا ، فان ركائز VEEV أطول قد ربط أفضل نظرا للاعتراف عزر الهيكلية الثانوية.
لTRIM14 ، حصلنا علي Kم = 21 μM6،33. كم لركيزة تحمل تسلسل البروتين المضيف كانت مشابهه لقيم km من الركائز التي تحتوي علي الفيروسية الانقسامات موقع انشقاق البروتين (km(V12) = 12 μm و km(V34) = 21 μm). تم قطع متواليات موقع الانشقاق في nsP1/nsP2 ، nsP2/nsP3 ، وتقاطعات nsP3/nsP4 بكفاءات مختلفه. في الخلية ، ويعتقد ان هذا يسمح لانشقاق متسلسلة منال42المتعدد البروتين.
وينبغي توخي الحذر عند تفسير النتائج السلبية. إذا لم يحدث انشقاق ، قد يكون موقع الانشقاق قصير جدا أو قد يكون الانزيم البروتيني المنقي غير نشط. بالنسبة للركازات التي يتم قطعها ، هناك حاجه إلى تجارب اضافيه لتاكيد انشقاق البروتين كامل الطول أو الانقسام في الخلايا المصابة بالفيروس. وينبغي اختيار تجارب المتابعة المناسبة. ويمكن أيضا اختبار اثار الإفراط في التعبير أو إسكات البروتين المستهدف علي النسخ المتماثل الفيروسي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> الشكل 1: ثلاث أليات لإسكات الأصوات. يمكن ان يحدث إسكات علي مستوي الحمض النووي ، RNA ، أو البروتين. هذه الخوارزميات "البحث والحذف" كل استخدام "الكلمة الاساسيه" لتوجيه انشقاق ملف يحتوي علي الكلمة. وقد تم تعديل هذا الرقم من Morazzani et al.32 والإشارات الواردة فيه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> الشكل 2: الاختلافات الخاصة بالأنواع في تسلسل مواقع الانشقاق. يتم عرض المجالات C-الطرفية PRY/SPRY TRIM14 المتجانسات في المحاذاة. يمكن تحديد المجال PRY/SPRY بواسطة الزخارف المحفوظة التي تم تمييزها باللون الرمادي. يتم قطع الإنسان TRIM14 في القبلة ↓ G من قبل الانزيم البروتيني VEEV nsP2 السيستين. يتم عرض تسلسل SSHHP في اللون. بقايا في الأخضر هو P1 ' بقايا; في اللون الأزرق هو بقايا P4 ، اللون الأحمر هي بقايا المحفوظة الأخرى داخل تسلسل عزر موقع الانشقاق. الخيول الميناء نسخه مقتطعه من TRIM14 تفتقر إلى المجال PRY/SPRY. يسين المبرز في السماوي هو بولي-اوبيتاميناتيد وهو مهم لتجميع signalosome مافس. قد يتم قطع المجال C-الطرفية PRY/SPRY بشكل عابر من قبل البروتياز nsP2 لاضعاف استجابه المضيف المضادة للفيروسات اينتراسيلولارلي اثناء العدوى الفيروسية الحاده. في الخيول ، وهذا المجال غائبه دائما. وهذا يوحي بان المجال PRY/SPRY من TRIM14 قد يكون لها وظيفة وقائية ضد التهابات VEEV. وقد استنسخ هذا الرقم من Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> الشكل 3: تعريف SSHHPS باستخدام الانفجار. يتم محاذاة تسلسل عزر موقع الانشقاق في تقاطع VEEV nsP1/nsP2 مع تسلسل SSHHP في TRIM14 البروتين المضيف. بقايا الملونة في الأخضر هو P1 ' بقايا; في اللون الأزرق هو بقايا P4 اللون الأحمر بقايا المحفوظة الأخرى من تسلسل عزر موقع الانشقاق. تحتوي معظم المحاذاة علي التماثل إلى المناطق خارج عزر موقع الانقسام المحفوظة أو لم تتضمن بقايا السندات سيسيل P1/P1. وأظهرت TRIM14 مطابقه ل 6 بقايا بترتيب متسلسل يتضمن P1 و P1 '. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> الشكل 4: البروتين والحمض النووي تسلسل من الركيزة ف-V12-YFP ل VEEV nsP2 السيستين البروتياز. يتم عرض مواقع تقييد NdeI (CATATG) و XhoI (CTCGAG) في أحرف الراس. في الأحمر هو تسلسل موقع انشقاق من بوليبروتين الفيروسية التي هي في بين nsP1 و nsP2. بقايا في الأخضر هو P1 ' بقايا اللون الأزرق هو بقايا P4 من موقع الانشقاق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> الشكل 5: تسلسل البروتين من Trx-VEEV-nsP2 السيستين بناء الانزيم البروتيني. يظهر ثياوريدوكسين (Trx) باللون الأصفر. يظهر الموقع الانشقاق وعلامته في السماوي. يتم تسميه الصبغي مزدوج له باللون الأحمر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> الشكل 6: هياكل الببتيد في وزاره التربية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> الشكل 7: التحام من الببتيد الركيزة باستخدام PyRx/اوتودوك. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> الشكل 8: الوظائف التي تعمل علي مجموعه الجلف البيولوجي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> الشكل 9: نموذج الركيزة VEEV P12 التي تحتوي علي تسلسل موقع الانشقاق عند تقاطع nsP1/nsP2. و cys-477/له-546 الصبغي مزدوج الحفاز هو مبين باللون الأزرق. وقد تم الرقم باستخدام Pymol (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> الشكل 10: تحليل SSHHPS لفيروس زيكا ns2B/ns3 البروتياز. (ا) توقعات البروتين المضيف المستهدفة لل Zikv ns2B/ns3 البروتياز. البقايا باللون الأحمر تطابق تسلسل موقع انشقاق واحد. ويتم التغاضي عن البقايا باللون الأخضر في الموقع الفرعي وبقايا المباراات في مواقع الانشقاق الأخرى. وكان لSFRP1 اعلي عدد من البقايا المتطابقة في ترتيب متتابع. (ب) تم التعبير عن بروتينات الركيزة-yfp (~ 50-60 كده) وتنقيتها التي تحتوي علي تسلسل SSHHP المتوقع من كل بروتين مضيف (بشري). الانزيم البروتيني ZIKV قطع FOXG1 الإنسان ، SFRP1 ، NT5M و Gsالفا الوحدة الفرعية معزولة من مكتبه cdna الشبكية. المنتجات الانشقاق حوالي 28-30 كده. سلاسل الركيزة متوفرة في morazzani وآخرون6 (C) في حين ان ns2B/ns3 البروتيني قطع SFRP1 ، فانه لم يقطع المتجانسات (SFRP2 و SFRP4). (د) قد تكون محاذاة مواقع الانشقاق من الأنواع الحيوانية المختلفة مفيده في اختيار نموذج حيواني لفيروس المجموعة الرابعة. لاحظ ان تسلسل R ↓ G المحفوظة يختلف بين البشر والقوارض في SFRP1. الشكل مستنسخ من Morazzani وآخرون6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> الشكل 11: التحليل الحركي الثابت للدولة باستخدام المقايسات المستمرة وغير المستمرة. (ا) تم رسم البيانات الحركية المبينة في الجدول 5 في غراتيك. يظهر الداخلي مؤامرة Lineweaver-بورك. (ب) هلام الصفحات SDS يظهر المنتجات الانشقاق من الركيزة السفلية-V12-yfp. في حاره 1 هو "تقطيعه" الركيزة (48 كده). في حاره 2 هو الركيزة "CUT" (31 ده كده و 27 كده). في الممرات 3-9 وشملت مركبات مختلفه لاختبار نشاطها المثبطة. لين 4 يحتوي علي مثبط E64d التكافؤ. وقد تم تشغيل هذه التفاعلات بين عشيه وضحيها ل ~ 17 ساعة في درجه حرارة الغرفة. وكان من اللازم غلي العينات لتحقيق نمط النطاقات الحاد. NsP2 البروتياز مرئية (56 كده) في ردود الفعل التي تحتوي علي انزيم, ولكن ليس في حاره 1. لين 1 هو السيطرة "لا انزيم". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

نقدم بروتوكولا عاما لتحديد فترات قصيرة من متواليات بروتين المضيف المسبب للمرض (SSHHPS) المضمنة في بوليبروتين الفيروسي. يتم التعرف علي SSHHPS من قبل بروتينيه الفيروسية وتوجيه التدمير المستهدف من البروتينات المضيفة محدده من قبل العديد من الفيروسات المجموعة الرابع.

تحليل المجموعة الرابعة SSHHPS الفيروسية باستخدام في المختبر وأساليب Silico

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

لقد أظهرنا أن الجينوم الفيروسي المجموعة الرابعة ترميز فترات قصيرة من تسلسل البروتين المضيف. ويمكن العثور على هذه التسلسلات داخل مواقع الانقسام البروتياز الفيروسية. يتم استخدامها لتدمير مستهدف للبروتينات المضيفة ، وعادة ما تشارك البروتينات في توليد الاستجابات المناعية.ميزة رئيسية لاستخدام المقايسات protease هو أنه يزيل تعقيد الخلية ويظهر ما إذا كان أو لم يكن protease الفيروسية يمكن أن تشد تسلسل معين. لذلك عندما حللنا متواليات زيكا SSHHPS ، وجدنا أن البروتياز يمكن أن يقطع تسلسلات في البروتينات المشاركة في توليد استجابات المناعة وأن بعض هذه البروتينات لها أيضًا أدوار في نمو الدماغ والعين. عند تنفيذ هذه التقنية للمرة الأولى، ينبغي للمرء أن نتذكر أنه إذا لم يتم ملاحظة الانقسام، وأنه قد يكون بسبب مجموعة متنوعة من العوامل مثل نشاط البروتياز.(سيبرهن على العملية سيكون (جايمي كومبتون ، فني من مختبري تبدأ من خلال فتح البروتين BLAST ووضع الأحماض الأمينية 20 المحيطة السندات scissile والبوليبروتين الفيروسية وحدد تسلسل البروتين غير زائدة عن الحاجة ثم اكتب في الجينوم المضيف ليتم البحث فيها. إذا لزم الأمر، حدد PHI-BLAST واكتب في تسلسل نمط حيث تشير الأقواس المربعة إلى أن إما الأحماض الأمينية داخل الأقواس يمكن أن تكون في موقف بديل، ثم ضرب انفجار.ترتيب رتبة يضرب انفجار استناداً إلى عدد من المخلفات المتطابقة أو المتسامحة المتتالية التي تطابق تسلسل موقع الانقسام. من القائمة، حدد البروتينات التي تحتوي على ستة أو أكثر من المخلفات متطابقة أو مماثلة للتحليل في مقايسات البروتياز. بناء بلازميد ترميز بروتين الفلورسنت السماوي، ما يصل إلى 25 الأحماض الأمينية من تسلسل الانقسام، والبروتين الفلورسنت الأصفر.المقبل, إعداد ركائز CFP وYFP عن طريق تلقيح أربع قارورة أربعة لتر مع 25 ملليلتر من ثقافة بين عشية وضحاها. هز الثقافات في 37 درجة مئوية ورصد النمو كل ساعة من قبل الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي في 600 نانومتر. عندما تصل البكتيريا إلى امتصاص حوالي واحد ، تحث على التعبير البروتيني عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من IPTG مولور واحد إلى كل قارورة ، ثم خفض درجة حرارة الحاضنة المرتجفة إلى 17 درجة مئوية والسماح بالتعبير بالاستمرار بين عشية وضحاها لمدة 17 إلى 20 ساعة.في اليوم التالي، بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 7000 مرات ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة وتجاهل وسائل الإعلام السائل ثم تخزين الكريات في ناقص 80 درجة مئوية أو المضي قدما مع تحلل الخلية. لتحلل الخلايا ، وإعداد 100 ملليلتر من العازلة تحلل وفقا لاتجاهات المخطوطات ، resuspend الكريات في العازلة ، ونقل 25 إلى 25 ملليلتر من التعليق إلى 50 ملليلتر أنابيب مخروطية يمكن التخلص منها.ضع الأنابيب في زجاجة بلاستيكية مع ماء جليدي ثم أدخل طرف sonicator في الأنبوب بحيث تكون الحافة حوالي سنتيمتر واحد من أسفل الأنبوب و sonicate lysate 10 إلى 20 مرة حتى يصبح سائلًا وسيلًا. بعد سونيكيشن، نقل lysate إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة والطرد المركزي في 20، 500 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل ناظر إلى زجاجة نظيفة والتخلص من الكريات.تحميل lysate على عمود النيكل ثم غسل العمود مع اثنين من وحدات التخزين العمود من العازلة A تليها خمسة مجلدات العمود من 20٪ المخزن المؤقت B.Absorbance في 280 سوف يزيد نانومتر خلال الغسيل كما الملوثات elute من العمود. استمر في الغسل حتى يعود A280 إلى قيم الأساس. ثم قمل البروتين مع اثنين إلى ثلاثة مجلدات العمود من 100٪ العازلة B وجمع 10 ملليلتر الكسور، مع التأكد من قياس A280 من كل كسر.إعداد ثمانية ردود فعل يمزج وفقا لاتجاهات المخطوطات والماصات 45 ميكرولترات من كل مزيج في الآبار الثلاثة الأولى من كل صف من لوحة سوداء نصف مساحة 96 جيدا. إعداد قارئ لوحة للكشف في وقت واحد من فلوريسنس في أطوال موجية اثنين مع إعداد أنبوب الmultiplier ثابت. قم ببرمجة وقت القراءة إلى 20 إلى 30 دقيقة مع قراءة واحدة في الدقيقة وحدد الآبار التي سيتم قراءتها.أدخل اللوحة في الجهاز وابدأ القراءة، ومراقبة نسب الانبعاثات بمرور الوقت. تشغيل نقطة نهاية قراءة لوحة تحتوي على الركيزة غير المصقول. إزالة لوحة وماصة خمسة ميكروليترس من الانزيم في كل بئر.يمكن للمرء حفظ العمود الأول كتحكم غير مقطوع. ثم اقرأ اللوحة مرة أخرى لمدة 20 إلى 30 دقيقة ، مع التأكد من تعيين قارئ اللوحة لإخراج القيم المطلقة. بمجرد الانتهاء من القراءة، وختم لوحة مع الفيلم لمنع التبخر وتركها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة للسماح للأنزيم لخفض الركيزة تماما.بعد 24 ساعة، قم بإزالة الفيلم واؤد نقطة نهاية مقروءة من اللوحة. متوسط نسب الانبعاثات وتسجيلها كقطع. تأكيد انشقاق الركيزة باستخدام SDS-PAGE.تحميل علامة الوزن الجزيئي في حارة الأولى أو الأخيرة وتحميل خمسة ميكرولترات من كل خليط التفاعل في حارة من هلام، بدءا من رد فعل غير المصقول. قم بتوصيل أقطاب خزان الجل إلى مصدر الطاقة وتشغيل المنتجات بقوة 110 فولت لمدة 60 دقيقة. إزالة هلام من الكاسيت باستخدام أداة تكسير وغمره في خمسة إلى 10 ملليلتر من حل تلطيخ.بعد ساعة إلى 24 ساعة، وإزالة وصمة عار الزائدة وغمر الجل في الماء. ثم التقاط صورة من هلام باستخدام صورة هلام. لتحضير بنية البروتين، قم بتحميل ملف البروتين PDB في وزارة التربية.انقر فوق تحديد والمذيبات، ثم حذف المذيبات. افتح لوحة pPreparation Structure من شريط القائمة العلوي Compute ثم قم بتصحيح كافة العناصر الإنشائية تلقائيًا بالنقر على تصحيح. بروتونات الهيكل بالنقر على بروتونات 3D.إضافة رسوم جزئية إلى البروتين عن طريق فتح لوحة التكاليف الجزئية واختيار AMBER 99 وضبط الهيدروجين ولأزواج وحيد كما هو مطلوب. ثم احفظ ملف البنية. لبناء هيكل للببتيدات الركيزة و TRIM14، افتح لوحة منشئ البروتين، وأدخل تسلسل الركيزة، وحدد إعادة حزم تلقائي.بعد ذلك، قم بتعيين الهندسة كما الموسعة وانقر على بناء. وأخيراً تقليل الهيكل وحفظه كملف PDB. إرساء الببتيدات الركيزة لEV-nsP2 باستخدام PyRx AudoDock 4.2 البرمجيات.قم بتحميل البروتين، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق الاسم، وحدد جعل ماكروموليكول لإعداد ملف الإرساء PDBQT. ثم قم بتحميل جزيء الركيزة وحدد جعل ليجند لإعداد ملف الالتحام ليغاند. بدء تشغيل معالج AutoDock على لوحة الإرساء في الجزء السفلي وحدد ملفات ligand والبروتين المعدة.تعريف جيب ربط البروتين عن طريق ضبط يدويا البعد الشبكة، ثم تشغيل AuotGrid. بعد ذلك، قم بتشغيل AutoDock وحدد أسلوب الخوارزمية الوراثية لاماركيان. انقر فوق المعلمات الإرساء وتعيين عدد من تشغيل الجمعية العامة إلى 50 ثم انقر فوق إلى الأمام لبدء تشغيل الإرساء.عند اكتمال AutoDock، افتح لوحة تحليل النتائج ثم تفقد كافة الأوضاع الربط المتوقعة. حدد أفضل نموذج مع الطاقة الربط المتوقع أقل والتفاعلات ملزمة معقولة بين رابطة الدول المستقلة-477 والركيزة على موقع الانقسام ثم حفظه كملف PDB لمزيد من المحاكاة MD. بعد قراءة وضعيات الربط باستخدام AutoDock، من المهم إجراء تحليل ما بعد الإرساء لتحديد نموذج الربط المعقول للصقل باستخدام محاكاة MD.وقد استخدم هذا البروتوكول للعثور على فترات قصيرة من متواليات البروتين المُضيفة المسببة للأمراض المتجانسة أو SSHHPS في فيروس زيكا ns2B/3 protease. وتم تحديد أربعة أهداف للبروتين المضيف. FOXGS, SFRP1, وحدة فرعية Gsalpha من مكتبة cDNA شبكية العين, وNT5M الميتوكوندريا 5'3'nucleotidase.سمحت محاذاة التسلسل لـ SSHHPS بالاختلافات الخاصة بالأنواع في تسلسل موقع الانقسام. وكان تسلسل SFRP1 متطابقاً في البشر والدجاج، وهو أمر جدير بالملاحظة لأن فيروس زيكا يمكن أن يؤدي إلى الوفيات وصغر الرأس في أجنة الدجاج. واستخدمت المقايسة المستمرة لقياس المعلمات الحركية الثابتة الحالة وثوابت تثبيط لتسلسلات البوليبروتين الفيروسية واستخدمت المقايسة المستمرة للحصول على معلومات انشقاق نوعية، مثل انشقاق تسلسل معين أو تثبيط البروتياز من قبل مركبات مختلفة.وقدم نموذج لالتهاب الدماغ الخيول الفنزويلي nsP1-nsP2 تقاطع باستخدام في أساليب السيليكو. بالنسبة لـ NsP2 protease ، أدى إطالة تسلسل الركيزة وتقليل القوة الأيونية للمخزن المؤقت إلى انخفاض كبير في ثابت Michaelis من انشقاق تسلسل فيروس غابة Semliki. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم تشغيل عناصر التحكم.يجب اختبار الركائز التي تحتوي على تسلسلات موقع شق البروتياز الفيروسي قبل الشروع في تحليل تسلسل SSHHPS. إذا لوحظ انشقاق البروتين المضيف، ينبغي إجراء تجارب المتابعة للتأكد من أن هذا البروتين المضيف يؤثر على النسخ الفيروسي. ويمكن القيام بذلك عن طريق الإفراط في التعبير عن البروتين أو إسكاته ، ومن ثم فحص الآثار على تكرار الفيروسية.المجموعة الرابعة تحتوي على عدد كبير من مسببات الأمراض الجديدة والناشئة. وصلات تسلسل SSHHPS بروتينات محددة المضيف والمسارات مع البروتياز الفيروسية بطريقة يمكن التنبؤ بها للغاية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

مجموع استخراج بروتين و 2-D طرق جل الكهربائي ل<em&gt; بيركولديريا</em&gt; الأنواع

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

في طرق المختبر لمقارنة الهدف وتجليد وCDC التعريفي بين الأجسام المضادة العلاجية: تطبيقات في تحليل Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

أساليب بديلة في المختبر لتحديد السلامة الهيكلية قفيصه الفيروسية

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

الكشف عن نسخة منخفضة العدد الحمض النووي الفيروسي المتكاملة التي شكلتها في المختبر عدوى التهاب الكبد باء

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...