Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

这项工作得到了国防威胁减少局（DTRA）项目号CB-SEED09-SEED09-2-0061和CBCall4-CBM-05-2-0019的支持，并部分得到了国家航空工业局、NIH（XH）和海军研究实验室基地基金的校内/校外研究计划。

这里表达的观点是作者的观点，并不代表美国海军、美国陆军、美国国防部或美国政府的观点。

在生物学中只看到由外来序列引导的蛋白质或核酸的序列特异性破坏。图 1所示的机制是防御机制，用于保护主机免受病毒或主机的病毒侵害。
使用生物信息学方法，我们可以识别被这些系统破坏的目标。在分析SSHHP序列时，我们发现，其中许多可以在产生先天免疫反应所需的蛋白质中找到。有些具有明显的作用，如MAVS和TRIF（TIR-域包含适配器诱导干扰素-β），而其他与免疫有关，虽然更复杂的机制（例如，Histone H3，SFRP1，FOXG1）8，9。存储在 SSHHP 序列中的目标信息有可能识别对这些病毒具有抗病毒作用的路径。体内的抗病毒反应通常是病毒特异性26，43。例如，TRIM蛋白的子集对不同的病毒有抗病毒作用43，44，45，有些是病毒限制因子（例如，HIV和TRIM5+）。TRIM蛋白的特异性（约70个已经确定）仍在检查44，45。SSHHPS 中的信息可能有助于我们了解这些病毒如何逃避先天免疫反应。随着对更多 SSHHPS 的检查，可能会发现其他模式和相关性。
在我们的分析中，物种特异性的差异是显而易见的（图2，图10）。这些病毒对某些物种的影响比其他物种更大。有关主机范围、主机敏感性和主机防御的信息可能存在于 SSHHPS 中。例如，马，最易感染马脑炎病毒的物种，缺乏被VEEV nsP2蛋白酶暂时切割的人类TRIM14区域。人类很少死于VEEV感染，但可以感染24。人类TRIM14蛋白携带nsP2蛋白酶裂解序列6。裂解部位的存在表明人类有一个防御机制来对付这些病毒。鸟类被认为是这些病毒的潜在储存库46。TRIM14蛋白质中来自鸡的相应SSHHP序列与人类和其他物种的序列不同。像这样的细微差异可能使目标宿主蛋白不干净或更容易被分块。Aguirre等人16日表明，一种不洁变异的STRING蛋白在登革热病毒感染后诱导了较高的IFN水平，小鼠自然携带一种不是被登革热ns2B3蛋白酶切割的STING版本。ZIKV蛋白酶47没有切割鼠汀蛋白。在我们的SSHHPS分析中，当我们将人类蛋白质与啮齿动物6的蛋白质进行比较时，我们还观察到ZIKV蛋白酶裂解位点序列的差异（图10D）。在用于IV组病毒的动物模型中，复制宿主蛋白的物种特异性蛋白解裂解可能很重要。宿主蛋白裂解的抑制对IV组蛋白酶抑制剂的发展也有影响。在以前的出版物中，我们表明，我们可以用CA074甲基酯6抑制VEEV nsP2蛋白酶TRIM14裂解。这一结果表明，这些蛋白酶的小分子抑制剂也许能够调节能够抑制感染的先天免疫反应6，31。
一个物种内的遗传变异也有可能在蛋白溶性裂解中产生差异。康顿使用的细微差异可能会影响核糖体暂停48。由于一些IV组病毒蛋白酶嵌入在ER膜中，如果裂解以共翻译方式发生，这些暂停的差异可能会影响目标的裂解。我们识别的一些裂解位点位于预测信号肽序列中（例如 SFRP1），而其他则为内部。
SSHHPS 分析可以生成不同于其他宿主蛋白分析方法的信息。SSHHPS 分析成本低廉且易于使用。使用细菌表达系统允许测试哺乳动物序列的短段（±25氨基酸），而无需使用哺乳动物细胞培养。我们发现CFP-YFP基质能够耐受所有经过测试的人类蛋白质序列;然而，产量各不相同。在类似的测定中，含有人类蛋白质序列的基质只要63个氨基酸被成功表达、纯化，并用于动力学分析和抑制剂筛选49、50、51。由于不连续测定只需要少量的基板，因此可以探索大量目标。该系统的一个优点是CFP/YFP基板可用于SDS-PAGE分析和更精细的动力学分析（即IC50、Ki、Km、Vmax）。对于药物发现，抑制化合物可以在荧光测定中产生伪影。因此，不连续的测定与连续测定相结合，可以确认裂解或抑制裂解。不连续的SDS-PAGE检测样品可以直接从96孔板中抽取。CFP/YFP基板已用于化合物库筛选52。然而，需要额外的分析来确定基板是否适合高通量筛选，如Z因子53的计算。
设计基材的一个挑战是识别由蛋白酶约束和识别的剪刀键周围的区域。在此处显示的示例中，我们从以剪刀键为中心的 12 个残渣序列开始。在分析裂解部位与剪刀结的残余N端的序列对齐后，发现VEEV蛋白酶的裂解部位与若干C端残留物的ZIKV蛋白酶同源性。对接基板的硅基模型可用于设计探测基板结合位点的场位定向诱变实验。由于基质和酶序列在质粒上，因此可以突变以测试硅基模型或子位容差。如果绑定基板的晶体结构不可用，则这一点可能更有利。
SSHHPS分析还可能产生关于病毒诱导的表型由病毒酶产生机制的新信息。ZIKV目标之一，SFRP1，是Wnt信号通路的一部分，在大脑和眼睛发育以及免疫反应36，37，54，55，56，57的作用。我们发现，ZIKV ns2B/ns3蛋白酶可以切割的其他蛋白质序列也存在于大脑和眼睛发育的蛋白质中;在先天性寨卡综合征中观察到两种异常，被认为是病毒引起的表型58的一部分。
宿主-病原体相互作用的可预测性可用于各种应用：靶点特定的溶性溶性病毒疗法;消除活病毒疫苗的风险;动物模型的细化、预测或选择;宿主范围或易感性的预测;人畜共患病事件的预测;和主机防御的预测。由于所述方法基于序列，因此将来可以合并到软件中。

水平基因从病毒转移到宿主，或宿主病毒的证据，可以在各种基因组1，2，3，4中找到。病毒内元化的例子是在细菌宿主基因组4中发现的CRISPR间隔序列。最近，我们发现宿主蛋白序列嵌入（+）sSRNA IV组病毒的非结构多蛋白中的证据。病毒基因组编码区域内的这些序列可以代代传播。在病毒和宿主5，6中发现同源宿主病原体蛋白序列（SSHHPS）的短段。SSHHPS 是病毒蛋白酶识别的保存性裂解位点图案序列，与特定的宿主蛋白具有同源性。这些序列直接破坏特定的宿主蛋白。
在上一份出版物6中，我们编制了病毒蛋白酶所针对的所有宿主蛋白的列表，发现目标列表是非随机的（表1）。两种趋势显而易见。首先，切割宿主蛋白的病毒蛋白酶大部分属于IV类病毒（25例中24例涉及IV组病毒蛋白酶），其中1个蛋白酶属于（+）ssRNA VI类逆转录病毒（HIV，人体免疫缺陷病毒）7。其次，病毒蛋白酶切割的宿主蛋白靶点通常参与产生先天免疫反应，这表明裂解旨在对抗宿主的免疫反应。病毒蛋白酶所针对的宿主蛋白的一半是产生干扰素（IFN）和亲炎细胞因子的信号级联的已知成分（表1）。其他人参与主机细胞转录8，9，10或翻译11。有趣的是，Shmakov等人4已经表明，许多CRISPR原间隔序列对应于参与质粒结合或复制4的基因。
第四组包括弗拉维里达、皮科纳维里达、科罗纳维里达、卡尔西维里达和托加维里达。若干新的和正在出现的病原体属于第四类，如寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗河病毒（WNV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、严重急性呼吸系统综合症病毒（SARS）和中东呼吸综合征病毒（MERS）。（+）ssRNA基因组本质上是一个mRNA的片段。要产生基因组复制所需的酶，首先必须翻译（+）ssRNA基因组。在α病毒和其他IV组病毒中，复制所需的酶在单个多蛋白中产生（即，用于VEEV的nsP1234）。非结构多蛋白 （nsP） 由 nsP2 蛋白酶 （nsP1234 nsP1、 nsP2、 nsP3、 nsP4） 进行蛋白酶处理，以产生活性酶12（图 1）。nsP2蛋白酶的多蛋白分裂是病毒复制所必需的;这已经证明通过删除和站点导向的诱变活性网站半胱氨酸的nsP2蛋白酶13，14。值得注意的是，病毒蛋白的翻译先于基因组复制事件。例如，nsP4 包含复制 （+） sRNA 基因组所需的 RNA 依赖RNA 聚合酶。基因组复制可以产生dsRNA中间体;这些中间体可以触发宿主的先天免疫反应。因此，这些病毒可能在感染早期分离宿主先天免疫反应蛋白，以抑制其影响15、16、17。
沉默可能发生在DNA，RNA和蛋白质的水平。图1所示的每个沉默机制的共同点是，短的外来DNA、RNA或蛋白质序列用于指导特定靶点的破坏，以对抗其功能。沉默机制类似于用三种不同语言编写的"搜索和删除"程序。短的裂解站点序列类似于"关键字"。每个程序都有一个酶，用于识别要删除的"文件"中的短序列（"关键字"）和单词之间的匹配。一旦找到匹配，酶切割（"删除"）更大的目标序列。图 1所示的三种机制用于保护宿主免受病毒侵害，或保护病毒免受宿主免疫系统的攻击。
病毒蛋白酶识别+2-11氨基酸之间的短裂解位点图案序列;在核苷酸中，这相当于6-33个碱基。比较而言，CRISPR间隔序列为+26-72核苷酸，RNAi为+20-22核苷酸18，19。虽然这些序列相对较短，但可以专门识别它们。鉴于氨基酸的分集性较高，对于识别6-8个氨基酸或更长蛋白质序列的病毒蛋白酶，随机裂解事件的概率相对较低。宿主蛋白中SSHHPS的预测将在很大程度上取决于被检查的病毒蛋白酶的特异性。如果蛋白酶有严格的序列特异性要求，则找到裂解位点序列的几率为 1/206 = 6400 万分之一或 1/208 = 256 亿分之一;然而，大多数蛋白酶具有可变的子位容差（例如，R 或 K 在 S1 站点中可以耐受）。因此，在主机与病毒的序列之间不需要序列标识。对于具有较宽松序列要求的病毒蛋白酶（如属于Picornaviridae 的蛋白酶），在宿主蛋白质中发现裂解位点的概率可能更高。表1中的许多条目来自皮科纳维里达家族。
Schechter & Berger 符号20通常用于描述蛋白酶基质中的残留物及其结合的子位，我们始终使用此表示法。成板中成型粘结N端子的残留物表示为P3-P2-P1，而C端子的残留物表示为P1'-P2'-P3'。结合这些氨基酸残留物的蛋白酶中的相应子位分别是S3-S2-S1和S1'-S2'-S3'。
为了确定哪些宿主蛋白被瞄准，我们可以在病毒多蛋白裂解部位识别SSHHPS，并搜索含有它们的宿主蛋白。在这里，我们概述了使用已知的病毒蛋白酶裂解位序列识别SSHHPS的过程。生物信息学方法、蛋白酶测定和硅胶方法中描述，旨在与基于细胞的测定结合使用。
病毒蛋白酶所针对的宿主蛋白的序列排列揭示了这些短裂解位序列中物种特异性的差异。例如，委内瑞拉的马匹脑炎病毒（VEEV）nsP2蛋白酶被发现切割人类TRIM14，一种三方图案（TRIM）蛋白6。一些TRIM蛋白是病毒限制因子（例如，TRIM5_21），大多数被认为是泛于E3的利气。TRIM14缺乏一个RING（真正有趣的新基因）域，不被认为是一个E3利带22。TRIM14已被建议作为线粒体抗病毒信号体（MAVS）22的适配器，但可能具有其他抗病毒功能23。不同物种的TRIM14序列的对齐表明，马缺乏裂解位点，并怀有缺少C-终端PRY/SPRY域的TRIM14截断版本。此域包含多聚体化位点 （图2）。在马，这些病毒是高度致命的（+20-80%死亡率），而在人类只有+1%死于VEEV感染24。PRY/SPRY 域的裂解可能会暂时短路 MAVS 信令级联。这种级联可以由dsRNA触发，并导致干扰素和亲炎细胞因子的产生。因此，SSHHPS的存在对于预测哪些物种具有针对特定IV类病毒的防御系统可能很有用。
在第四组病毒中，IFN对抗机制被认为是倍增冗余25。宿主蛋白裂解在感染期间可能是短暂的，浓度可能随着时间的推移而恢复。我们在细胞中发现TRIM14裂解产物在转染（6小时）后可以非常早期地被检测到，其质粒编码蛋白酶（细胞巨细胞病毒促进剂）。然而，在较长的周期，裂解产物未被检测出来。在受病毒感染的细胞中，动力学不同，裂解产物可在6-48 h6之间检测到。其他人已经报告，早在感染9-6小时后，宿主蛋白裂解产物出现，11。
细胞中的蛋白水解活性往往难以捕获;裂解产物的溶解度、浓度、稳定性和寿命各不相同。在基于细胞的检测中，不能假定裂解产物会积聚在细胞中，或者切割和未切割蛋白的带强度会显示出补偿性增减，因为切割蛋白可能很快降解，并且可能无法在以预期分子量（MW）的西方污点中检测到（例如，包含表皮的区域可能被其他宿主蛋白酶压碎或可无用）。如果病毒蛋白酶的基质是先天免疫反应蛋白，其浓度在感染期间可能会有所不同。例如，一些先天免疫反应蛋白在病毒感染之前存在，由干扰素26进一步诱导。因此，目标蛋白的浓度在感染期间可能会波动，并且对未感染细胞和受感染的细胞解热物的比较可能难以解释。此外，所有细胞可能不会均匀转染或感染。另一方面，使用大肠杆菌的纯化蛋白质进行体外蛋白酶检测，其控制变量较少，因此可以使用 SDS-PAGE 而不是免疫图。在CFP/YFP基质蛋白质纯化的早期阶段，可以抑制污染蛋白酶，而突变的病毒蛋白酶可以作为对照物进行纯化和测试，以确定裂解是否由于病毒蛋白酶或污染细菌蛋白酶所致。
体外蛋白酶测定的一个局限性是它们缺乏哺乳动物细胞的复杂性。要切割其基质的酶，两者必须共同本地化。第四组病毒蛋白酶在结构和定位上有所不同。例如，ZIKV蛋白酶嵌入内质视网膜（ER）膜，面对细胞醇，而VEEV nsP2蛋白酶是细胞质和细胞核27中的可溶性蛋白质。ZIKV SSHHPS 分析中发现的一些裂解位点序列是在信号肽中，表明某些靶点可能以共翻译方式发生裂解。因此，在这些分析中还需要考虑蛋白酶和基质在细胞中的位置。
基于细胞的检测对于确定在感染中的宿主蛋白的作用有价值。旨在阻止宿主蛋白的病毒蛋白酶裂解的方法，如添加蛋白酶抑制剂6或宿主靶16的突变，可用于检查其对病毒复制的影响。靶向蛋白的过度表达也可能影响病毒复制28。斑块测定或其他方法可用于量化病毒复制。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

Α病毒酶在单个多肽中合成。非结构多蛋白 （nsP） 由其 nsP2 半胱氨酸蛋白酶处理，以产生病毒复制所必需的活性酶。病毒蛋白酶是高度特异性的，并识别保守的裂解位点图案序列（#6-8氨基酸）。在若干IV组病毒中，nsP蛋白酶（s）裂解位点图案序列可以在参与产生先天免疫反应的特定宿主蛋白质中找到，在某些情况下，靶向蛋白似乎与病毒引起的表型有关。这些病毒利用短段的同源宿主病原体蛋白序列（SSHHPS）来有针对性地破坏宿主蛋白。为了识别SSHHPS病毒蛋白酶裂解位点图案序列可以输入到BLAST和宿主基因组可以搜索。裂解最初可以使用纯化的nsP病毒蛋白酶和荧光共振能量转移（FRET）基质在大肠杆菌中进行测试。FRET基质含有青色和黄色荧光蛋白和裂解位点序列（CFP序列-YFP）。这种蛋白酶测定可以连续用于板片读取器，也可以在SDS-PAGE凝胶中连续使用。在硅酸盐中可以生成结合肽基板的模型，以指导基质的选择和诱变研究。CFP/YFP基质也被用于识别蛋白酶抑制剂。这些体外和硅胶方法可与基于细胞的测定相结合，以确定靶向宿主蛋白是否影响病毒复制。

对ZIKV ns2B/3蛋白酶的SSHHPS分析确定了4个宿主蛋白靶点：FOXG1，SFRP1，来自视网膜cDNA库的Gs α亚单位，以及NT5M线粒体5'，3'-核糖样酶（图10）6。值得注意的是，没有其他方法预测这些蛋白质作为ZIKV蛋白酶的潜在目标。FOXG1基因的突变与先天性综合征有关，其特征是发育受损和大脑结构异常（如小头症）。SFRP1是一种分泌的卷曲相关蛋白（SFRP）;这些可溶性受体可以竞争性地结合Wnt配体来对抗和抑制Wnt信号。在弗拉维病毒感染36年期间，Wnt信号通路参与IFN反应的调节。SFRP1的裂解有望增强黄病毒的复制。SFRP1也参与Th17细胞分化37。SSHHPS 的序列对齐显示了裂解位点序列中特定于物种的差异（图10D）。SFRP1中的裂解部位序列在人和鸡中相同;ZIKV可诱发鸡胚胎死亡和小头症38。在啮齿动物中，高度保存的P1残留物（K/R）R+G被甘氨酸（RGG）取代。小鼠的免疫能力菌株一般对ZIKV感染和疾病39具有抗药性。
对于病毒多蛋白序列和主机蛋白序列，可以使用板读取器31、40、41中的连续测定来测量稳态动力学参数和抑制常数（图 11A ）。对于定性裂解信息，如特定序列的裂解或各种化合物抑制蛋白酶，可以使用不连续的测定（图11B）。
可能需要优化 CFP 和 YFP 之间的残留物数量。可以使用在硅中方法创建基板绑定模型。图9显示了nsP1/nsP2结的代表性对接模型。对于VEEV nsP2蛋白酶，已报告12个氨基酸Semliki森林病毒（SFV）序列的裂解（Km = 0.58 mM）33。将基板序列延长到19、22和25残留物，降低缓冲液的离子强度，可显著降低Km。对VEEV nsP2晶体结构和晶体包装的检查还表明，其中一个结的一部分被包装在蛋白酶领域和螺旋。因此，由于对二次结构主题的识别，VEEV 基板的绑定时间越长越好。
对于TRIM14，我们得到了一个Km = 21 μM6，33。携带宿主蛋白序列的基板的Km值与含有病毒多蛋白裂解位点序列（Km（V12） = 12 μM 和 Km（V34） = 21 μM 的基质的 Km值相当。nsP1/nsP2、nsP2/nsP3和nsP3/nsP4结处的裂解位点序列以不同的效率被切割。在细胞中，这被认为是允许多蛋白42的连续裂解。
在解释负面结果时应小心谨慎。如果没有发生裂解，裂解位点可能太短，或者纯化蛋白酶可能处于非活动状态。对于被切割的基质，需要额外的实验来确认受病毒感染细胞中全长蛋白质或裂解的裂解。应选择适当的后续实验。也可以测试目标蛋白过度表达或沉默对病毒复制的影响。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> 图1：三种沉默机制。在DNA、RNA或蛋白质水平上可以发生沉默。这些"搜索和删除"算法每个使用"关键字"来指示包含该单词的文件的裂解。这一数字已由Morazzani等人32和其中的参考文献修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> 图2：裂解位点序列中物种特异性差异。TRIM14 同源的 C 端 PRY/SPRY 域显示在对齐中。PRY/SPRY 域可以通过以灰色突出显示的保存图案来标识。人类TRIM14在QEAGA@G被VEEV nsP2半胱氨酸蛋白酶切割。SSHHP 序列以颜色显示。绿色残留物是 P1 的残渣;蓝色是 P4 残留物，红色是裂解部位图案序列中其他保存的残留物。Equine 拥有缺少 PRY/SPRY 域的 TRIM14 截断版本。青色中突出显示的流氨酸是多泛化的，对MAVS信号体的组装非常重要。C-终端PRY/SPRY域可能被nsP2蛋白酶暂时切断，在急性病毒感染期间在细胞内损害宿主的抗病毒反应。在马中，此域始终不存在。这表明TRIM14的PRY/SPRY域可能具有保护VEEV感染的功能。这个数字已由Morazanni等人转载6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> 图 3：使用 BLAST 进行 SSHHPS 标识。VEEV nsP1/nsP2结处的裂解位点图案序列与宿主蛋白TRIM14中的SSHHP序列对齐。绿色着色的残渣是 P1 的残渣;蓝色是P4残留物，红色是裂解部位图案序列的其他保存残留物。大多数路线包含与保存的裂解部位图案以外的区域同源性，或者不包括 P1/P1' 剪刀粘结残留物。TRIM14 按顺序显示与 6 个残留物的匹配，顺序包括 P1 和 P1'。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> 图4：VEEV nsP2半胱氨酸蛋白酶CFP-V12-YFP基质的蛋白质和DNA序列。NdeI （CATATG） 和 XhoI （CTCGAG） 限制站点以大写字母显示。红色是来自nsP1和nsP2之间的病毒多蛋白的裂解位点序列。绿色残留物是 P1 的残留物，蓝色是裂解部位的 P4 残留物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> 图5：Trx-VEEV-nsP2半胱氨酸蛋白酶结构的蛋白质序列。二恶名食毒素（Trx）以黄色显示。血栓裂解部位和His标记以青色显示。Cys-His dyad 被标记为红色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> 图6：教育部的肽结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> 图7：使用PyRx/AutoDock对基板肽进行对接。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> 图 8：在 Biowulf 群集上运行的作业。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> 图9：在nsP1/nsP2结处包含裂解位点序列的VEEV P12基板的模型。Cys-477/His-546 催化dyad 以蓝色显示。图是使用 Pymol （https://pymol.org） 制作的。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> 图10：寨卡病毒ns2B/ns3蛋白酶的SSHHPS分析。（A） 预测 ZIKV ns2B/ns3 蛋白酶的宿主蛋白靶点。红色残留物与单个裂解位点序列匹配。在子部位可以容忍绿色残留物，并在其他裂解部位匹配残留物。SFRP1 的连续顺序相同残留物数量最多。（B） CFP-基质-YFP蛋白（+50-60 kDa）被表达和纯化，含有来自每个宿主蛋白（人）的预测SSHHP序列。ZIKV蛋白酶切割人类FOXG1，SFRP1，NT5M和从视网膜cDNA库分离的Gα亚单位。裂解产物约为 28-30 kDa。基质序列在Morazzani等人6（C）中可用，虽然ns2B/ns3蛋白酶切割SFRP1，但它没有切割其同源性（SFRP2和SFRP4）。（D） 不同动物物种的裂解部位的排列，可能有助于为IV组病毒选择动物模型。请注意，在SFRP1中，人类和啮齿动物之间保存的R+G序列不同。图转载自Morazzani等人6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">请点击这里查看这个数字的较大版本。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> 图11：使用连续和不连续测定的稳态动力学分析。（A） 表5所示的动力学数据绘制在GraFit中。内联显示了 Lineweaver-Burk 图。（B） 显示CFP-V12-YFP基板裂解产物的SDS-PAGE凝胶。在通道 1 是"UNCUT"基板 （48 kDa）。在车道 2 是"CUT"基板 （31 kDa 和 27 kDa）。在通道3-9个不同的化合物被包括在内，以测试其抑制活性。车道 4 包含 E64d 共价抑制剂。这些反应在室温下运行了±17小时。需要对样品进行沸腾，以实现尖锐的带状模式。nsP2蛋白酶在含有酶的反应中可见（56 kDa），但在通道1中不可见。车道 1 是"无酶"控制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

我们提出了一个通用方案，用于识别嵌入在病毒多蛋白中的同源宿主病原体蛋白序列（SSHHPS）的短段。SSHHPS被病毒蛋白酶识别，并指导几种IV组病毒对特定宿主蛋白的定向破坏。

第四组病毒SSHHPS使用体外和西里科方法的分析

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

我们已经表明，第四组病毒基因组编码短段宿主蛋白质序列。这些序列可以在病毒蛋白酶裂解位点内找到。它们被用于靶向宿主蛋白质的定向破坏，这些蛋白质通常是参与产生免疫反应的蛋白质。使用蛋白酶测定的一个主要优点是，它消除了细胞的复杂性，并表明病毒蛋白酶是否可以切割特定的序列。因此，当我们分析寨卡SSHHPS序列时，我们发现蛋白酶可以切割参与产生免疫反应的蛋白质序列，其中一些蛋白质在大脑和眼睛发育中也有作用。首次执行此技术时，应记住，如果不观察到裂痕，则可能是由于多种因素（如蛋白酶的活性）造成的。演示这个程序的将是海梅·康普顿，一个来自我实验室的技术人员。首先打开蛋白质 BLAST，将 20 个氨基酸围绕剪刀键和病毒多蛋白，并选择非冗余蛋白质序列，然后键入要搜索的宿主基因组。如果需要，选择 PHI-BLAST 并键入一个模式序列，其中方括号指示括号内的任一氨基酸可以处于替代位置，然后命中 BLAST。根据与裂解站点序列匹配的连续相同或耐受残留物数对 BLAST 命中进行排名。从列表中，选择含有六种或更多相同或类似残留物的蛋白质，用于蛋白酶测定中的分析。构建一个质粒编码的青色荧光蛋白，高达25个氨基酸的裂解序列，和黄色荧光蛋白。接下来，通过接种四个四升烧瓶和 25 毫升的隔夜培养物来准备 CFP 和 YFP 基板。在 37 摄氏度下摇动培养物，每小时通过 UV-Vis 光谱仪监测 600 纳米的生长情况。当细菌达到约一个的吸收度时，通过在每个烧瓶中加入0.5毫升的摩尔IPTG来诱导蛋白质表达，然后将摇动培养箱的温度降低至17摄氏度，让这种表达在一夜之间持续17至20个小时。第二天，在4摄氏度下，以7000次g的离心对细菌进行10分钟。取出并丢弃液体介质，然后在零下 80 摄氏度下储存颗粒，然后进行细胞解解。要对细胞进行解液，根据手稿指示准备100毫升的解液缓冲液，在缓冲液中重新悬浮颗粒，将25至25毫升悬浮液转移到50毫升一次性锥形管中。将管子与冰水一起放入塑料烧杯中，然后将声波尖端插入管中，使尖端离管底约一厘米，将酸盐声波化 10 到 20 次，直到其变得液体和液化。声波化后，将酸盐转移到高速离心管中，并在 4 摄氏度下以 20，500 x g 离心，30 分钟。将上清液转移到干净的瓶子中，然后丢弃颗粒。将落酸装载到镍柱上，然后用两列缓冲器 A 洗涤柱，然后用 280 纳米的五列卷 20% 缓冲液 B。继续清洗，直到 A280 返回到基线值。然后用两到三列体积100%缓冲B来分解蛋白质，并收集10毫升的馏分，确保测量每个分数的S280。根据手稿方向准备八个反应混合，将每个混合液的移液器 45 微升混合成黑色半区 96 孔板每排前三口。设置板读卡器，通过固定的光电倍增管设置同时检测两个波长的荧光。将读取时间编程为 20 到 30 分钟，每分钟读取一次，然后选择要读取的井。将板插入机器并启动读取，监测一段时间的排放比。运行包含未切割基板的板的端点读取。将盘子和移液器将五微升酶放入每个井中。可以将第一列另存为未切割控件。然后再次读取板 20 到 30 分钟，确保将板读取器设置为输出绝对值。读取完成后，用薄膜密封板以防止蒸发，并在室温下过夜，使酶完全切割基板。24 小时后，取出薄膜并执行板的端点读取。平均排放比，并记录为切割。使用 SDS-PAGE 确认基板的裂解。将分子量标记加载到第一或最后一个通道中，将每个反应混合物的五微升加载到凝胶的通道中，从未切割反应开始。将凝胶罐的电极连接到电源，以 110 伏运行产品 60 分钟。使用开裂工具从盒式磁带上取出凝胶，并将其淹没在 5 到 10 毫升染色溶液中。1 至 24 小时后，去除多余的污渍，将凝胶淹没在水中。然后使用凝胶成像器拍摄凝胶的照片。要准备蛋白质结构，请将蛋白质PDB文件加载到MOE中。单击"选择"和"溶剂"，然后删除溶剂。从"计算"顶部菜单栏打开"结构准备"面板，然后单击"正确"自动更正所有结构项。通过单击质子 3D 来质子化结构。通过打开"部分电荷"面板并选择 AMBER 99 并根据需要调整氢气和孤对，向蛋白质添加部分电荷。然后保存结构文件。要构建基质肽和 TRIM14 的结构，请打开蛋白质构建器面板，输入基板序列，然后选择自动重新包装。接下来，将几何设置为"扩展"，然后单击"生成"。最后最小化结构并将其保存为 PDB 文件。使用 PyRx AudoDock 4.2 软件将基底肽与 VEEV-nsP2 对接。加载蛋白质，右键单击名称，然后选择"使宏分子"准备 PDBQT 停靠文件。然后加载基板分子并选择"使利贡"来准备配体对接文件。在底部的对接面板上启动"自动停靠"向导，然后选择准备好的配体和蛋白质文件。通过手动调整网格尺寸，然后运行 AuotGrid 来定义蛋白质结合口袋。接下来，运行自动多克并选择拉马克遗传算法方法。单击停靠参数，将 GA 运行数设置为 50，然后单击"前进"以启动停靠运行。自动停靠完成后，打开"分析结果"面板并检查所有预测的绑定姿势。选择预测约束能量最低的最佳模型，选择在裂解站点上的cis-477和基板之间的合理结合相互作用，然后将其保存为PDB文件，用于进一步的MD模拟。在阅读 AutoDock 的绑定姿势后，执行停靠后分析以识别使用 MD 模拟进行优化的似是而非绑定模型非常重要。该协议用于在寨卡病毒ns2B/3蛋白酶中查找短段同源宿主-病原体蛋白序列或SSHHPS。确定了四个宿主蛋白靶点。Foxgs， Sfrp1， 来自视网膜 cdna 库的 Gsalpha 亚单位， 和 Nt5m 线粒体 5'3' 核苷酸。SSHHPS 的序列对齐允许在裂解位点序列中存在物种特定的差异。SFRP1序列在人类和鸡中是相同的，这是值得注意的，因为寨卡病毒可以诱发死亡和鸡胚胎小头症。连续测定用于测量病毒多蛋白序列的稳定状态动力学参数和抑制常数，用于获取定性裂解信息，如特定序列的裂解或各种化合物抑制蛋白酶。用硅法制作了委内瑞拉马脑炎 nsP1-nsP2 结的模型。对于 nsP2 蛋白酶，延长基板序列并降低缓冲液的离子强度，导致 Semliki 森林病毒序列裂解的 Michaelis 常数显著降低。尝试此过程时，运行控件非常重要。在进行SSHHPS序列分析之前，应先测试含有病毒蛋白酶裂解位点序列的基底。如果观察到宿主蛋白的裂解，应进行后续实验，以确认宿主蛋白影响病毒复制。这可以通过过度表达或沉默蛋白质，然后检查对病毒复制的影响。第四组含有大量新的和正在出现的病原体。SSHHPS序列以非常可预测的方式将特定的宿主蛋白和通路与病毒蛋白酶联系起来。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3的HIV - 1取向的基因型推理使用人口为基础的测序

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

科研

免疫与感染

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

建立的液体覆盖的文化偏光人类呼吸道上皮的CALU-3细胞研究呼吸系统病原宿主细胞的反应<em在体外</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

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量<em在体外</em&gt;激活的主人微血管内皮细胞在静态条件下测量的检测，以中性粒细胞粘附

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

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总蛋白提取和二维凝胶电泳方法<em&gt;鼻疽</em&gt;物种

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

中性粒细胞分离和分析，以确定他们的淋巴瘤细胞的敏感性对治疗药物的作用

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

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使用的淋巴细胞外渗分析<em&gt;体外</em&gt;人类血脑屏障模型

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

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Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

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Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

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乙型肝炎体外感染形成的低拷贝数综合病毒 dna 的检测

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