Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Defense Threat reduktion Agency (DTRA) projektnumre CB-SEED-SEED09-2-0061 og CBCall4-CBM-05-2-0019, og delvis af Intramural/Extramural Research program af NCATS, NIH (XH) og Naval Research laboratorium base funds.

De udtalelser, der udtrykkes her, er de af forfatterne og ikke repræsenterer dem af U. S. Navy, U. S. Army, U. S. Department of Defense, eller den amerikanske regering.

Sekvens specifik ødelæggelse af et protein eller en nukleinsyre, der styres af en fremmed sekvens, ses kun i nogle få tilfælde i biologi. Mekanismerne vist i figur 1 er defensive mekanismer, der beskytter en vært fra en virus, eller en virus fra en vært.
Ved hjælp af bioinformatiske metoder kan vi identificere de mål, der ødelægges af disse systemer. I vores analyser af SSHHP-sekvenser opdagede vi, at mange af dem kunne findes i proteiner, der var nødvendige for at generere medfødte immunresponser. Nogle havde indlysende roller såsom Mavs og TRIF (TIR-domæne-holdige adapter-inducerende interferon-β), mens andre var relateret til immunitet selv om mere komplekse mekanismer (f. eks histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. De måloplysninger, der er lagret i SSHHP-sekvensen, har potentialet til at identificere veje, som har antivirale virkninger mod disse vira. Antivirale reaktioner in vivo er ofte virus specifikke26,43. For eksempel, undergrupper af trim proteiner har antiviral virkning på forskellige vira43,44,45, nogle er virale restriktions faktorer (f. eks, hiv og TRIM5α). Specificiteten af trim proteiner (~ 70 er blevet identificeret) stadig er ved at blive undersøgt44,45. Oplysningerne i SSHHPS kan bidrage til vores forståelse af, hvordan disse vira unddrage sig den medfødte immunrespons. Andre mønstre og sammenhænge kan blive afsløret, da flere SSHHPS undersøges.
Artsspecifikke forskelle var tydelige i vores analyser (figur 2, figur 10). Disse vira er kendt for at påvirke nogle arter mere end andre. Oplysninger om værtsområde, værts modtagelighed og værts forsvar kan være til stede i SSHHPS. For eksempel, heste, de mest modtagelige arter til equin encephalitis vira, manglede den region af human TRIM14, der var forbigående skåret af VEEV nsP2 protease. Mennesker dør sjældent af VEEV infektioner, men kan være inficeret24. Det humane TRIM14-protein bar en nsP2 proteasehæmmere-kavaler sekvens6. Tilstedeværelsen af kavaler sitet tyder på, at mennesker har en forsvarsmekanisme mod disse vira. Fugle er blevet anset for at være potentielle reservoirer af disse vira46. Den tilsvarende SSHHP-sekvens i TRIM14-proteinet fra kyllinger afveg fra de sekvenser, som findes i mennesker og andre arter. Subtile forskelle som disse kan gøre et mål vært protein ucleavable eller mere let spaltet. Aguirre et al.16 viste, at et uncleavable MUTERET streng protein inducerede højere niveauer af IFN efter dengue virus infektion, og at mus naturligvis bære en version af sting, der ikke skæres af dengue ns2B3 protease. Murine STING proteinet blev ikke skåret af ZIKV proteasehæmmere47. I vores SSHHPS-analyse observerede vi også forskelle i ZIKV proteasespaltningen på stedet, da vi sammenlignede de menneskelige proteiner med dem fra gnavere6 (figur 10D). Det kan være vigtigt at gengive de artsspecifikke proteolytiske kavaler af værts proteiner i dyremodeller, der anvendes til gruppe IV-vira. Hæmning af Host protein spaltning har også konsekvenser med hensyn til udviklingen af gruppe IV proteasehæmmere. I vores tidligere publikation, vi viste, at vi kunne hæmme TRIM14 spaltning af VEEV nsP2 proteasehæmmere ved hjælp af CA074 methyl ester6. Dette resultat tyder på, at små molekyle hæmmere af disse proteaser kan være i stand til at moduere den medfødte immunrespons, der er i stand til at undertrykke infektionen6,31.
Genetisk variation inden for en art har også potentiale til at producere forskelle i proteolytisk spaltning. Subtile forskelle i codon skik kan påvirke ribosom pauser48. Da nogle virale proteaser i gruppe IV er indlejret i ER-membranen, kan forskelle i disse pauser påvirke spalningen af et mål, hvis spaltning sker medtranslationelt. Nogle af de kavaler steder, som vi identificerede, var i forudsagte signal peptidsekvenser (f. eks. SFRP1), mens andre var interne.
SSHHPS analyse kan producere oplysninger, der afviger fra andre metoder til Host proteinanalyser. SSHHPS analyse var billig og nem at ansætte. Brugen af et bakterielt udtryks system tillod afprøvning af korte segmenter (~ 25 aminosyrer) af pattedyrs sekvenser uden brug af pattedyrscelle kultur. Vi konstaterede, at den fælles fiskeripolitiks-YFP-substrater var i stand til at tolerere alle de testede humane protein sekvenser; men udbyttet varierede. I lignende analyser, substrater indeholdende humane protein sekvenser, så længe 63 aminosyrer blev med succes udtrykt, renset, og udnyttet til kinetiske analyser og inhibitor screening49,50,51. Da der kun er behov for små mængder af substratet til den diskontinuerlig analyse, kan et stort antal mål udforskes. En af fordelene ved systemet er, at den fælles fiskeripolitiks/YFP-substrater kan anvendes til SDS-side analyser og til mere udførlige kinetiske analyser (dvs. IC50, ki, km, VMax). For Drug opdagelse, hæmmende forbindelser kan producere artefakter i fluorescerende assays. Således gør den diskontinuerlige analyse i kombination med en kontinuerlig analyse det muligt at bekræfte spaltning eller hæmning af spaltning. Prøverne til den diskontinuerlige SDS-Sideanalyse kan tages direkte ud af 96-brønd pladerne. Den fælles fiskeripolitiks/YFP-substrater er blevet anvendt til sammensatte Biblioteks screening52. Der kræves dog yderligere analyser for at fastslå, om et substrat egner sig til screening af høj hastighed, såsom beregning af en Z-faktor53.
En udfordring i at designe et substrat er at identificere regionen omkring scissile Bond, der er bundet og anerkendt af proteasen. I eksemplerne vist her begyndte vi med 12 rest sekvenser, der var centreret omkring scissile Bond. Efter at have analyseret sekvens justeringer af spaltningen sites homologi til rester N-terminalen af scissile obligation blev fundet for VEEV proteasehæmmere, mens for ZIKV proteasehomologi til flere af C-terminalen rester blev fundet. En i silico model af det dockede substrat kan bruges til at designe site-instrueret mutagenese eksperimenter, der sonde bindingssteder af substratet. Da substratet og enzym sekvenserne er på plasmider, kan enten muteret for at teste i silico modeller eller underordnet websted tolerancer. Dette kan være fordelagtigt, hvis en krystalstruktur af de bundne substrat (er) ikke er tilgængelig.
SSHHPS-analyse kan også give nye oplysninger om de mekanismer, hvormed virus inducerede fænotyper produceres af virale enzymer. Et af zikv-målene, SFRP1, er en del af WNT signalering pathway og har roller i både hjerne-og øjen udvikling og i immunrespons36,37,54,55,56,57. Vi fandt, at de andre protein sekvenser, der kunne skæres af ZIKV ns2B/ns3 proteasehæmmere var også i proteiner involveret i hjernen og øjet udvikling; abnormiteter i begge er observeret i medfødt Zika syndrom og menes at være en del af den virus inducerede fænotype58.
Forudsigeligheden af vært-patogen interaktioner kan udnyttes til en række anvendelser: Target-specifikke onkolytisk viral terapier; de-risikere levende virusvacciner; forfinelse, forudsigelse eller udvælgelse af dyremodeller forudsigelse af værtsområde eller modtagelighed forudsigelse af zoonotiske hændelser og forudsigelse af værts forsvar. Da de beskrevne metoder er sekvens-baserede, kan de være af værdi for at indarbejde i software i fremtiden.

Tegn på horisontal genoverførsel fra virus til vært, eller vært for virus, kan findes i en række genomer1,2,3,4. Eksempler på viral endogenization er CRISPR spacer sekvenser fundet i bakteriel Host genomer4. For nylig har vi fundet tegn på host protein sekvenser indlejret i materialer polyproteiner af (+) ssrna gruppe IV vira. Disse sekvenser inden for kodnings områderne af det virale genom kan udbredes generationelt. De korte strækninger af homologe Host-patogen protein sekvenser (sshhps) findes i virus og vært5,6. SSHHPS er de bevaret spaltningen motiv sekvenser anerkendt af virale proteaser, der har homologi til specifikke Host proteiner. Disse sekvenser direkte ødelæggelse af specifikke Host proteiner.
I vores tidligere publikation6udarbejdede vi en liste over alle de værts proteiner, der var rettet mod virale proteaser, og fandt ud af, at listen over mål ikke var tilfældig (tabel 1). To tendenser var tydelige. For det første tilhørte størstedelen af de virale proteaser, der afskårne værts proteiner, gruppe IV-vira (24 ud af 25 tilfælde involverede gruppe IV viral proteaser), og en proteasehæmmere tilhørte (+) ssRNA gruppe VI retrovira (HIV, humant immundefektvirus)7. For det andet var værts protein målene, der blev skåret af de virale proteaser, generelt involveret i at generere de medfødte immunresponser, der antyder, at spalten var beregnet til at antagonisere værtens immunrespons. Halvdelen af de værts proteiner, som de virale proteaser var rettet mod, var kendte bestanddele af signal kaskader, der genererer interferon (IFN) og proinflammatoriske cytokiner (tabel 1). Andre var involveret i Host Cell transkriptionen8,9,10 eller oversættelse11. Interessant, Shmakov et al.4 har vist, at mange crispr protospacer sekvenser svarer til gener, der er involveret i plasmid konjugering eller replikation4.
Gruppe IV omfatter blandt andet Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae og Togaviridae. Flere nye og spirende patogener tilhører gruppe IV, såsom zikavirus (ZIKV), West Nile (WNV), Chikungunya (CHIKV), svær Akut respiratorisk syndrom virus (SARS) og Mellemøsten respiratorisk syndrom virus (MERS). Den (+) ssRNA genom er hovedsagelig et stykke mRNA. For at producere de enzymer, der er nødvendige for genom-replikation, skal (+) ssrna-genom først oversættes. I alfa vira og andre gruppe IV-vira produceres de enzymer, der er nødvendige for replikation, i et enkelt polyprotein (dvs. nsP1234 for VEEV). Det ikke-strukturelle polyprotein (nsP) er proteolytisk behandlet (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) af den nsP2 proteasehæmmere til fremstilling af aktive enzymer12 (figur 1). Spaltning af polyprotein af nsP2 proteasehæmmere er afgørende for viral replikation; Dette er blevet påvist ved sletning og site-instrueret mutagenese af den aktive site cystein af nsP2 proteasehæmmere13,14. Især oversættelse af virale proteiner går forud for genomreplikation hændelser. For eksempel indeholder nsP4 den RNA-afhængige RNA-polymerase, der er nødvendig for at replikere (+) ssRNA-genomet. Genome-replikation kan producere dsRNA-mellemprodukter; disse mellemprodukter kan udløse værtens medfødte immunrespons. Således, disse vira kan Kløve vært medfødte immunrespons proteiner tidligt i infektion for at undertrykke deres virkninger15,16,17.
Der kan opstå lyddæmpnings niveauer for DNA, RNA og protein. Det, der er fælles for hver af de lyddæmpnings mekanismer, som er vist i figur 1 , er, at korte fremmede DNA-, RNA-eller protein sekvenser bruges til at styre ødelæggelsen af specifikke mål for at antagonisere deres funktion. Lyddæmpnings mekanismerne er analoge med "Søg og slet"-programmer, der er skrevet på tre forskellige sprog. Den korte spaltnings sidesekvens er analog med et "nøgleord". Hvert program har et enzym, der genkender match mellem den korte sekvens ("søgeord") og et ord i "fil", der skal slettes. Når en kamp er fundet, enzymet nedskæringer ("sletter") den større mål sekvens. De tre mekanismer, der er vist i figur 1 , bruges til at forsvare værten mod virus eller til at forsvare en virus mod en værts's immunsystem.
Virale proteaser genkende kort spaltning site Motif sekvenser mellem ~ 2-11 aminosyrer; i nukleotider svarer dette til 6-33 baser. Til sammenligning er crispr spacer-sekvenser ~ 26-72 nukleotider og RNAi er ~ 20-22 nukleotider18,19. Mens disse sekvenser er relativt korte, kan de genkendes specifikt. I betragtning af den højere mangfoldighed af aminosyrer, sandsynligheden for en tilfældig spaltning begivenhed er relativt lav for en viral proteasehæmmere genkende protein sekvenser af 6-8 aminosyrer eller længere. Forudsigelsen af SSHHP'ER i værts proteiner vil i høj grad afhænge af specificiteten af den virale proteasehæmmere, der undersøges. Hvis proteasen har strenge sekvens specificitetskrav, er chancen for at finde en kavaler plads sekvens 1/206 = 1 i 64.000.000 eller 1/208 = 1 i 25.600.000.000; de fleste proteaser har dog variable underordnet websted tolerancer (f. eks. kan R eller K tolereres på S1-stedet). Derfor er der ingen krav om sekvens identitet mellemsekvenser fundet i værten versus virus. For virale proteaser, der har løsere sekvens krav (såsom dem, der tilhører Picornaviridae) sandsynligheden for at finde en spaltning sted i en Host protein kan være højere. Mange af posterne i tabel 1 er fra Picornaviridae -familien.
Schechter & Berger notation20 er almindeligt anvendt til at beskrive rester i et proteasesubstrat og de underordnede websteder, som de binder, vi udnytter denne notation hele vejen igennem. Restkoncentrationerne i substratet, der er N-terminal for scissile-obligationen, betegnes som P3-P2-P1, mens de, der er C-terminal, betegnes som P1'-P2'-P3. De tilsvarende underordnede steder i proteasen, der binder disse aminosyre rester, er henholdsvis S3-S2-S1 og S1'-S2'-S3.
For at afgøre, hvilke Host proteiner der målrettes, kan vi identificere SSHHPS i de virale polyproteinkavaler områder og søge efter de værts proteiner, der indeholder dem. Heri skitserer vi procedurer for identificering af SSHHPS ved hjælp af kendte virale proteasespaltningen. De bioinformatiske metoder, proteaseassays og de beskrevne silico-metoder er beregnet til brug sammen med cellebaserede assays.
Sekvens justeringer af værts proteinerne, som er målrettet mod virale proteaser, har afsløret artsspecifikke forskelle inden for disse korte spaltnings sekvenser. For eksempel, den venezuelanske equin encephalitis virus (VEEV) nsP2 proteasehæmmere blev fundet at skære menneskelige TRIM14, en treparts motiv (TRIM) protein6. Nogle TRIM proteiner er viral restriktion faktorer (f. eks TRIM5α21), de fleste menes at være ubiquitin E3 ligaser. TRIM14 mangler en RING (virkelig interessant nyt gen) domæne og menes ikke at være en E3 ubiquitinligase22. TRIM14 er blevet foreslået at være en adapter i mitokondrie antiviral signalosome (MAVS)22, men kan have andre antivirale funktioner23. Justering af TRIM14 sekvenser fra forskellige arter viser, at Equine mangler kavaler pladsen og havnen en trunkeret version af TRIM14, der mangler C-Terminal PRY/SPRY domæne. Dette domæne indeholder et polyubiquitination-websted (figur 2). I Equine, disse vira er meget dødelig (~ 20-80% dødelighed) hvorimod hos mennesker kun ~ 1% dør fra VEEV infektioner24. Spaltning af PRY/SPRY domæne kan forbigående kortslutning MAVS signalering Cascade. Denne kaskade kan udløses af dsRNA og fører til produktion af interferon og pro-inflammatoriske cytokiner. Således kan tilstedeværelsen af SSHHPS være nyttig til at forudsige, hvilke arter der har forsvarssystemer mod specifikke gruppe IV vira.
I gruppe IV vira menes IFN antagonisme mekanismer at være multiplicere redundante25. Host protein spaltning kan være forbigående under infektion og koncentrationer kan restituere sig over tid. Vi fandt i celler, der TRIM14 spaltning produkter kunne påvises meget tidligt efter transfektering (6 h) med en plasmid kodning proteasehæmmere (Cytomegalovirus promotor). I længere perioder blev spaltningen dog ikke påvist. I virusinficerede celler, kinetikken var forskellige og spaltning produkter kunne påvises mellem 6-48 h6. Andre har rapporteret udseendet af Host protein spaltning produkter så tidligt som 3-6 h post infektion9,11.
Proteolytisk aktivitet i celler er ofte vanskeligt at fange; spaltning produkter kan variere i deres opløselighed, koncentration, stabilitet, og levetid. I cellebaserede analyser kan det ikke antages, at spaltningen vil ophobes i en celle, eller at bånd intensiteterne for skåret og ubeskåret protein vil vise kompenserende stigninger og fald, da det afskårne protein kan nedbrydes meget hurtigt og ikke kan påvises i en Western blot ved en forventet molekylvægt (MW) (f. eks. den region, der indeholder epitop kunne spaltet af andre vært proteaser eller kunne være allestedsnærværende). Hvis substratet for den virale proteasehæmmere er et medfødte immunrespons protein, kan dets koncentration variere under infektion. For eksempel er nogle medfødte immunrespons proteiner til stede før virus infektion og induceres yderligere af interferon26. Koncentrationen af målproteinet kan derfor svinge under infektion og sammenligning af ikke-inficerede vs. inficerede celle lysater kan være vanskeligt at fortolke. Derudover kan alle celler ikke være ensartet transficeret eller inficeret. In vitro proteaseassays ved hjælp af renset proteiner fra E. coli på den anden side har færre variabler for at kontrollere og sådanne analyser kan gøres ved hjælp af SDS-side snarere end immunoblots. Kontaminerende proteaser kan hæmmes i de tidlige trin af protein rensningen af den fælles fiskeripolitiks/YFP-substratet, og muterede virale proteaser kan renses og testes som kontrol for at afgøre, om spalningen skyldes den virale proteasehæmmere eller en forurenende bakteriel proteasehæmmere.
En begrænsning af in vitro proteaseassays er, at de mangler kompleksiteten af en pattedyrscelle. For et enzym til at skære sit substrat, skal de to være co-lokaliseret. Gruppe IV virale proteaser adskiller sig i struktur og lokalisering. For eksempel er zikv proteasehæmmere indlejret i endoplasmatiske reticulum (er) membranen og vender mod cytosol, mens veev nsP2 proteasehæmmere er et opløseligt protein i cytoplasmaet og Nucleus27. Nogle af spaltningen site sekvenser fundet i ZIKV SSHHPS analyse var i signal peptider tyder på, at spaltning kan forekomme Co-translationelt for nogle mål. Således skal placeringen af proteasen og substratet i cellen også tages i betragtning i disse analyser.
Cellebaserede analyser kan være værdifulde for at fastslå en rolle for de identificerede værts proteiner i infektionen. Metoder, der har til formål at standse viral proteasespaltning af værts proteiner, såsom tilsætning af en proteasehæmmer6 eller en mutation i værts målet16 , kan anvendes til at undersøge deres virkninger på viral replikation. Over ekspression af det målrettede protein kan også påvirke viral replikation28. Plaque-assays eller andre metoder kan anvendes til at kvantificere viral replikation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

Alfa virale enzymer syntetiseres i et enkelt polypeptid. Det ikke-strukturelle polyprotein (nsP) behandles af dets nsP2 cystein proteasehæmmere for at producere aktive enzymer, der er essentielle for viral replikation. Virale proteaser er meget specifikke og genkender bevaret spaltningen motiv sekvenser (~ 6-8 aminosyrer). I flere gruppe IV vira, den nsP protease (s) spaltning site Motif sekvenser kan findes i specifikke vært proteiner involveret i at generere den medfødte immunrespons og, i nogle tilfælde, de målrettede proteiner synes at være knyttet til den virus-induceret fænotype. Disse vira udnytter korte strækninger af homologe vært-patogen protein sekvenser (SSHHPS) for målrettet destruktion af Host proteiner. For at identificere SSHHPS kan de virale proteasespaltende motiv sekvenser indlægges i BLAST, og der kan søges efter værts genom (s). Spaltning i første omgang kan testes ved hjælp af renset nsP viral proteasehæmmere og fluorescens resonans energioverførsel (FRET) substrater fremstillet i E. coli. FRET-substrater indeholder cyan og gult fluorescerende protein og spaltningen på sprækken (CFP-sekvens-YFP). Denne proteaseanalyse kan anvendes kontinuerligt i en plade læser eller diskontoert i SDS-side gels. Modeller af de bundne peptidsubstrater kan genereres i silico for at vejlede substrat udvælgelse og mutagenese undersøgelser. Den fælles fiskeripolitiks/YFP-substrater er også blevet udnyttet til at identificere proteasehæmmere. Disse in vitro-og silico-metoder kan anvendes i kombination med cellebaserede analyser for at afgøre, om det målrettede værts protein påvirker viral replikation.

SSHHPS analyse af ZIKV ns2B/3 proteasehæmmere identificeret 4 Host protein Targets: FOXG1, SFRP1, en Gs Alpha underenhed fra et retinal cDNA bibliotek, og NT5M mitokondrie 5 ', 3 '-nukleotidase (figur 10)6. Især, ingen anden metode forudsagt disse proteiner som potentielle mål for ZIKV protease. Mutationer i FOXG1 genet har været forbundet med et medfødt syndrom karakteriseret ved nedsat udvikling og strukturelle hjerne abnormiteter såsom microcephaly. SFRP1 er et udskillet frizzled-relateret protein (SFRP); disse opløselige receptorer kan kompetitivt binde WNT ligander at irritere og hæmme WNT signalering. WNT signalering pathway er involveret i reguleringen af IFN respons under flavivirus infektion36. Kløvningen af SFRP1 forventes at forbedre flavivirus replikation. SFRP1 er også involveret i Th17 Celledifferentiering37. Sekvens justeringer af SSHHPS viste artsspecifikke forskelle i sekvenserne for spaltningen (figur 10D). Spaltningen site sekvens i SFRP1 var identisk i mennesker og kyllinger; ZIKV kan inducere dødelighed og microcephaly i kyllinge embryoner38. I gnavere erstattes den stærkt konserverede P1-rest (K/R) R ↓ G med en glycin (RGG). Immunkompetente stammer af mus er generelt resistente over for ZIKV infektion og sygdom39.
Steady State kinetiske parametre og hæmning konstanter kan måles for viral polyprotein sekvenser og for Host protein sekvenser ved hjælp af kontinuerlig analyse i en plade læser31,40,41 (Figur 11a). For kvalitativ spaltning information, såsom spaltning af en bestemt sekvens eller hæmning af proteasehæmmere af forskellige forbindelser, den diskontinuerlige analyse kan anvendes (Figur 11B).
Det kan være nødvendigt at optimere antallet af rester mellem den fælles fiskeripolitik og YFP. En substrat-bundet model kan laves ved hjælp af in silico metoder. En repræsentativ forankret model af nsP1/nsP2-krydset er vist i figur 9. For VEEV nsP2 protease var spaltning af en 12-aminosyre Semliki Forest virus (SFV) sekvens blevet rapporteret (Km = 0,58 mM)33. Forlængelse af substrat sekvensen til 19, 22 og 25 rester og reduktion af den ioniske styrke af bufferen førte til en signifikant reduktion i Km. Undersøgelsen af VEEV nsP2 Crystal-strukturen og krystal pakningen viste også, at en del af et af vejkryds var pakket mod proteasedomænet og var spiralformet. Således kan de længere VEEV-substrater binde bedre på grund af anerkendelsen af et sekundært strukturelt motiv.
For TRIM14 fik vi en Km = 21 μM6,33. Km for det substrat, der bærer værts protein sekvensen, var sammenlignelig med km -værdierne af de substrater, der indeholdt de virale polyproteinspaltningen (km(V12) = 12 μm og km(V34) = 21 μm). Spaltningen på nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 og nsP3/nsP4 vejkryds blev skåret med forskellige effektivitetsgevinster. I cellen menes dette at give mulighed for sekventiel spaltning af polyprotein42.
Der bør udvises forsigtighed ved tolkning af negative resultater. Hvis der ikke opstår spaltning, kan spaltnings stedet være for kort, eller den oprensede proteasehæmmere kan være inaktiv. For substrater, der skæres, yderligere eksperimenter er nødvendige for at bekræfte spaltning af fuld længde protein eller spaltning i virus-inficerede celler. Der bør vælges passende opfølgende eksperimenter. Virkningerne af overekspression eller hæmning af målproteinet på viral replikation kan også testes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Figur 1: tre mekanismer til lyddæmpningen. Der kan opstå lyddæmpnings niveauer på DNA-, RNA-eller Proteinniveau. Disse "Søg og slet" algoritmer hver bruger et "søgeord" til at dirigere spaltning af en fil, der indeholder ordet. Dette tal er blevet ændret fra Morazzani et al.32 og henvisningerne deri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Figur 2: artsspecifikke forskelle i sekvenser af kavalergang. C-terminalen PRY/SPRY domæner af TRIM14 homologer er vist i tilpasningen. PRY/SPRY-domænet kan identificeres af de bevaret motiver, der er fremhævet med gråt. Human TRIM14 skæres ved QEAGA ↓ G ved VEEV nsP2 cystein protease. SSHHP-sekvensen vises i farver. Restkoncentration i grøn er P1 ' rest. i blåt er P4 rest, og i rødt er andre bevaret rester inden for spaltnings stedet motiv sekvens. Equine Harbor en afkortet version af TRIM14 mangler PRY/SPRY domæne. Lysin fremhævet i cyan er poly-allestedsnærværende og er vigtig for samlingen af MAVS signalosome. C-terminalen PRY/SPRY domæne kan være forbigående skåret af nsP2 proteasehæmmere at forringe værtens antiviral respons intracellulært under en akut viral infektion. I Equine, dette domæne er altid fraværende. Dette tyder på, at PRY/SPRY domæne af TRIM14 kan have en beskyttende funktion mod VEEV infektioner. Dette tal er blevet gengivet fra Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Figur 3: identifikation af SSHHPS ved hjælp af blast. Den spaltende motiv sekvens ved VEEV nsP1/nsP2-krydset er justeret med SSHHP-sekvensen i Host-protein TRIM14. Rest farve i grøn er P1 ' rest. i blåt er P4 rest og i rødt andre bevaret rester af spaltnings stedet motiv sekvens. De fleste justeringer indeholdt homologi til regioner uden for det konserverede spaltningen motiv eller omfattede ikke P1/P1 ' scissile obligations rester. TRIM14 viste en match til 6 rester i sekventiel rækkefølge, der omfattede P1 og P1 '. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Figur 4: protein-og DNA-sekvenser i den fælles fiskeripolitik-V12-YFP-substrat for VEEV nsP2 cystein protease. Begrænsnings stederne NdeI (CATATG) og XhoI (CTCGAG) er vist med store bogstaver. I rødt er spaltningen site sekvens fra viral polyprotein, der er i mellem nsP1 og nsP2. Remanensen i grøn er P1 ' rest og i blåt er P4 resterne af spaltnings stedet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Figur 5: protein sekvens af TRX-VEEV-nsP2 cystein-proteasekonstruktionen. Thioredoxin (TRX) er vist med gult. Trombin-kavaler pladsen og hans-tag vises i cyan. Cys-hans DYAD er mærket med rødt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Figur 6: Peptidstrukturer i Moe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Figur 7: forankring af substrat peptid ved hjælp af PyRx/autodock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Figur 8: job, der kører på Biowulf-klyngen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Figur 9: model af VEEV P12-substrat, der indeholder spaltings stedets sekvens ved nsP1/nsP2-krydset. Cys-477/His-546 katalytiske DYAD er vist med blåt. Figuren blev foretaget ved hjælp af PyMOL (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Figur 10: SSHHPS-analyse af Zikavirus ns2B/ns3-protease. (A) forventet Host protein mål for Zikv ns2B/ns3 protease. Rester i rødt svarer til en enkelt spaltning. Rester i grøn tolereres på det underordnede sted og matcher rester på andre kavaler steder. SFRP1 havde det højeste antal identiske rester i fortløbende rækkefølge. (B) den fælles fiskeripolitik-substrat-yfp proteiner (~ 50-60 kDa) blev udtrykt og renset indeholdende den forventede SSHHP sekvens fra hver Host protein (Human). ZIKV proteasehæmmere skar Human FOXG1, SFRP1, NT5M og en GsAlpha underenhed isoleret fra et retinal cDNA-bibliotek. Spaltning produkterne er ca. 28-30 kDa. Substrat sekvenserne er tilgængelige i morazzani et al.6 (C), mens ns2B/ns3 proteasehæmmere cut SFRP1, det skar ikke sine homologer (SFRP2 og SFRP4). D) tilpasningen af spaltnings stederne fra forskellige dyrearter kan være nyttig ved udvælgelsen af en dyremodel for et gruppe IV-virus. Bemærk, at den konserverede R ↓ G-sekvens varierer mellem mennesker og gnavere i SFRP1. Figur gengivet fra Morazzani et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Figur 11: steady state kinetisk analyse ved hjælp af kontinuerlige og diskontinuerlig assays. A) de kinetiske data, der er vist i tabel 5, er afbildet i GraFit. Justerings viser lineweaver-Burk plot. B) SDS-side gel, der viser spaltningen af den fælles fiskeripolitiks-V12-yfp-substrat. I Lane 1 er "UNCUT" substrat (48 kDa). I Lane 2 er "CUT" substrat (31 kDa og 27 kDa). I Lanes 3-9 blev forskellige forbindelser inkluderet for at teste deres hæmmende aktivitet. Lane 4 indeholder den E64d kovalente hæmmer. Disse reaktioner blev kørt natten over i ~ 17 timer ved stuetemperatur. Kogning af prøverne var nødvendig for at opnå den skarpe banding mønster. NsP2 proteasehæmmere er synlig (56 kDa) i de reaktioner, der indeholder enzymet, men ikke i Lane 1. Lane 1 er "ingen enzym" kontrol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Vi præsenterer en generel protokol til at identificere korte strækninger af homologe Host-patogen protein sekvenser (SSHHPS) indlejret i viral polyprotein. SSHHPS er anerkendt af virale proteaser og direkte den målrettede ødelæggelse af specifikke Host proteiner af flere gruppe IV vira.

Analyse af gruppe IV-virale SSHHP'ER ved anvendelse af in vitro-og silico-metoder

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Vi har vist, at gruppe IV virale genomer indkode korte strækninger af vært protein sekvenser. Disse sekvenser kan findes inden for den virale protease spaltning steder. De bliver brugt til målrettet ødelæggelse af værtsproteiner, typisk proteiner involveret i at generere immunrespons.En stor fordel ved at bruge protease assays er, at det fjerner kompleksiteten af en celle og viser, hvorvidt en viral protease kan kløve en bestemt sekvens. Så da vi analyserede Zika SSHHPS sekvenser, fandt vi, at protease kunne skære sekvenser i proteiner, der er involveret i at generere immunrespons, og at nogle af disse proteiner også havde roller i hjernen og øjet udvikling. Når du udfører denne teknik for første gang, skal man huske, at hvis spaltning ikke overholdes, at det kan skyldes en række faktorer, såsom aktiviteten af protease.Demonstrationen af proceduren vil være Jaimee Compton, en tekniker fra mit laboratorium. Start med at åbne Protein BLAST og sætte de 20 aminosyrer omkring scissile binding og viralpolyprotein og vælg ikke-overflødige proteinsekvenser og skriv derefter i værtsgenomet, der skal søges. Hvis det er nødvendigt, skal du vælge PHI-BLAST og skrive i en mønstersekvens, hvor kantede parenteser angiver, at enten aminosyren i beslagene kan være på erstatningspositionen, og tryk derefter på BLAST.Rang for BLAST-hitsene baseret på antallet af på hinanden følgende identiske eller tolererede rester, der matcher en spaltningssekvens. På listen udvælges de proteiner, der indeholder seks eller flere identiske eller lignende restkoncentrationer til analyse i proteaseanalyserne. Konstruere en plasmid kodning cyan fluorescerende protein, op til 25 aminosyrer i spaltning sekvens, og den gule fluorescerende protein.Dernæst forberede den fælles fiskeripolitik og YFP substrater ved at vaccinere fire fire liters kolber med 25 milliliter af en overnight kultur. Ryst kulturerne ved 37 grader Celsius og overvåge væksten hver time ved UV-Vis spektroskopi ved 600 nanometer. Når bakterierne når en absorbans på omkring en, fremkalde protein udtryk ved at tilføje 0,5 milliliter af en molar IPTG til hver kolbe, derefter sænke temperaturen af rystende inkubator til 17 grader Celsius og lad udtrykket fortsætte natten over i 17 til 20 timer.På den næste dag, pellet bakterierne ved centrifugering ved 7000 gange g i 10 minutter ved 4 grader Celsius. Fjern og kassér de flydende medier derefter gemme pellets på minus 80 grader Celsius eller fortsætte med celle lysis. For at lyse cellerne skal der forberedes 100 milliliter lysisbuffer i henhold til manuskriptretninger, opslænge pellets i bufferen og overføres 25 til 25 milliliter af suspensionen til 50 milliliter engangskonicalrør.Læg rørene i et plastikbæger med isvand, og sæt derefter sonikatorspidsen ind i røret, så spidsen er omkring en centimeter fra bunden af røret og sonikerer lysatet 10 til 20 gange, indtil det bliver flydende og flydende. Efter sonikering overføres lysatet til centrifugerør med høj hastighed og centrifugeres ved 20, 500 x g i 30 minutter ved 4 grader Celsius. Overfør supernatanten til en ren flaske og kassér pillerne.Lysatet indlæses på nikkelkolonnen, og vask derefter kolonnen med to kolonnemængder af buffer A efterfulgt af fem kolonnemængder på 20%buffer B.Absorbans ved 280 nanometer øges under vasken, da forurenende stoffer fremkaldes fra kolonnen. Fortsæt med at vaske, indtil A280 vender tilbage til basisværdier. Derefter eluterer proteinet med to til tre kolonnevolumener på 100%buffer B og opsaml 10 milliliterfraktioner, og sørg for at måle A280 for hver fraktion.Forbered otte reaktioner blander i henhold til manuskript retninger og pipette 45 mikroliter af hver blanding i de første tre brønde i hver række af en sort halv-område 96-godt plade. Opsæt pladelæseren til samtidig detektering af lysstofrør ved to bølgelængder med fast indstilling af fotomultiplierrør. Program læsetid til 20 til 30 minutter med en læse per minut og vælge de brønde, der skal læses.Sæt pladen i maskinen og start aflæs, overvågning af emissionsforholdet over tid. Der skal afsendes et slutpunkt af pladen med det uskåret underlag. Fjern pladen og pipetter fem mikroliter af enzym i hver brønd.Man kan gemme den første kolonne som et uklippet kontrolelement. Læs derefter pladen igen i 20 til 30 minutter, og sørg for at indstille pladelæseren til output absolutte værdier. Når afningen er færdig, forsegles pladen med film for at forhindre fordampning og lade den overnatte ved stuetemperatur, så enzymet kan skære underlaget helt.Efter 24 timer skal du fjerne filmen og udføre en slutpunktslæsning af pladen. Gennemsnitlige emissionsforhold og registrere dem som snit. Bekræft substratets spaltning ved hjælp af SDS-PAGE.Læg en molekylvægtmarkør i den første eller sidste vognbane, og indlæs fem mikroliter af hver reaktionsblanding i en vognbane af gelen, begyndende med den uslebne reaktion. Fastgør geltankens elektroder til strømforsyningen og kør produkterne ved 110 volt i 60 minutter. Fjern gelen fra kassetten ved hjælp af et sprækker værktøj og nedsænkes i fem til 10 milliliter farvning løsning.Efter en til 24 timer, fjerne den overskydende plet og nedsænkes gelen i vand. Tag derefter et billede af gelen ved hjælp af en gel imager. For at forberede proteinstrukturen skal proteinets PDB-fil indlæses i MOE.Klik på Vælg og Opløsningsmiddel, og slet derefter opløsningsmidlet. Åbn panelet Struktur pPreparation fra menulinjen Beregn øverste, og ret automatisk alle strukturelle elementer ved at klikke på Ret. Protonate strukturen ved at klikke protonat 3D.Tilføj delvise gebyrer til proteinet ved at åbne panelet Delvise gebyrer og vælge AMBER 99 og Juster brinter og enlige par efter behov. Gem derefter strukturfilen. Hvis du vil opbygge strukturen for substrate peptider og TRIM14, skal du åbne panelet Protein Builder, indtaste underlagets sekvens og vælge Auto ompakning.Derefter skal du indstille Geometri som Udvidet og klikke på Byg. Endelig minimere strukturen og gemme det som en PDB fil. Dock substrate peptider til VEEV-nsP2 ved hjælp af PyRx AudoDock 4.2 software.Indlæs proteinet, højreklik på navnet, og vælg Gør makromolekyle for at forberede dockingfilen PDBQT. Indlæs derefter substratmolekylet, og vælg Make Ligand for at forberede liganddockingfilen. Start guiden Autodock på dockingpanelet nederst, og vælg de forberedte ligand- og proteinfiler.Definer den proteinbindende lomme ved manuelt at justere gitterdimensionen og derefter køre AuotGrid. Kør derefter AutoDock, og vælg den Lamarckian genetiske algoritmemetode. Klik på Docking Parametre og indstille antallet af GA kører til 50 og klik derefter på Fremad for at starte docking køre.Når AutoDock er fuldført, skal du åbne panelet Analysér resultater og undersøge alle forudsagte bindingsstillinger. Vælg den bedste model med den laveste forudsagte bindende energi og rimelige bindende interaktioner mellem cis-477 og substrat på spaltningsstedet, og gem den derefter som en PDB-fil til yderligere MD-simuleringer. Efter at have læst bindingen udgør med AutoDock, er det vigtigt at udføre post-docking analyse for at identificere den plausible bindende model for raffinement med MD simuleringer.Denne protokol blev brugt til at finde korte strækninger af homologe vært-patogen protein sekvenser eller SSHHPS i Zika virus ns2B/3 protease. Der blev identificeret fire værtsproteinmål. FOXGS, SFRP1, en Gsalpha underenhed fra et retinalt cDNA bibliotek, og NT5M mitokondrielle 5'3'nukleotidase.Sekvensjusteringer af SSHHPS tillod artsspecifikke forskelle i spaltningsstedets sekvenser. SFRP1-sekvensen var identisk hos mennesker og kyllinger, hvilket er bemærkelsesværdigt, fordi Zika-virus kan fremkalde dødelighed og microcephaly i kyllingembryoner. Den kontinuerlige analyse blev anvendt til at måle steady state kinetiske parametre og hæmning konstanter for viralpolyprotein sekvenser og diskontinuerlig analyse blev brugt til at opnå kvalitative spaltning oplysninger, såsom spaltning af en bestemt sekvens eller hæmning af protease af forskellige forbindelser.En model af den venezuelanske heste encephalitis nsP1-nsP2 krydset blev foretaget ved hjælp af i silico metoder. For nsP2 protease, forlængelse af substrat sekvens og reducere ioniske styrke buffer førte til en betydelig reduktion i Michaelis konstant spaltning af en Semliki Forest virus sekvens. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at køre kontrolelementerne.Substrater, der indeholder sekvenserne af virale proteasespaltningsstedssekvenser, skal testes, før SSHHPS-sekvensanalyse fortsættes. Hvis der observeres spaltning af et værtsprotein, skal der udføres opfølgende forsøg for at bekræfte, at værtsproteinet påvirker viral replikation. Dette kan gøres ved at overudse eller lukke munden på proteinet, og derefter undersøge virkningerne på viral replikation.Gruppe IV indeholder et stort antal nye og fremspirende patogener. SSHHPS sekvenser forbinder specifikke værtsproteiner og veje med de virale proteaser på en meget forudsigelig måde.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering af en Liquid-dækket kultur Polarized humane luftveje Epitelial Calu-3-celler til at studere Host celle respons på luftvejspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til måling neutrofiladhæsion til Aktiverede primære humane mikrovaskulære endotelceller under statiske forhold

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total protein Udvinding og 2-D gelelektroforese Metoder til<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In vitro- metoder til sammenligning af målbinding og CDC-induktion mellem terapeutiske antistoffer: applikationer i biosimilaritetsanalyse

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro metoder til bestemmelse af Viral kapsid strukturelle integritet

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Påvisning af lav kopi nummer integreret Viral DNA dannet af In Vitro Hepatitis B infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...