Analyse van virale SSHHP'S in groep IV met gebruikmaking van in vitro en silico-methoden

We hebben aangetoond dat virale genomen van groep IV korte stukken gastheereiwitsequenties coderen. Deze sequenties zijn te vinden in de virale protease decolleté sites. Ze worden gebruikt voor de gerichte vernietiging van gastheer-eiwitten, meestal eiwitten die betrokken zijn bij het genereren van de immuunreacties.

Een groot voordeel van het gebruik van protease tests is dat het de complexiteit van een cel verwijdert en laat zien of een virale protease een bepaalde sequentie kan splijten. Dus toen we Zika SSHHPS sequenties analyseerden, ontdekten we dat de protease sequenties kon snijden in eiwitten die betrokken zijn bij het genereren van immuunreacties en dat sommige van deze eiwitten ook rollen hadden in de ontwikkeling van de hersenen en het oog. Bij het uitvoeren van deze techniek voor de eerste keer, moet men niet vergeten dat als decolleté niet wordt waargenomen, dat het kan te wijten zijn aan een verscheidenheid van factoren, zoals de activiteit van de protease.

Het aantonen van de procedure zal Jaimee Compton zijn, een technicus van mijn laboratorium. Begin met het openen van Protein BLAST en zet de 20 aminozuren rond de scissile binding en de virale polyproteïne en selecteer niet-redundante eiwitsequenties en typ vervolgens het gastheergenoom om te zoeken. Selecteer indien nodig PHI-BLAST en typ in een patroonreeks waarbij vierkante haakjes aangeven dat aminozuur binnen de haakjes op de vervangende positie kan staan en vervolgens op BLAST kan worden geslagen.

Rangorde de BLAST-hits op basis van het aantal opeenvolgende identieke of getolereerde residuen die overeenkomen met een decolletésitereeks. Selecteer in de lijst de eiwitten die zes of meer identieke of soortgelijke residuen bevatten voor analyse in de proteasetesten. Bouw een plasmide codering van de cyaan fluorescerende eiwit, tot 25 aminozuren van de decolleté sequentie, en de gele fluorescerende eiwit.

Bereid vervolgens de GVB- en YFP-substraten voor door vier vier liter kolven te inenten met 25 milliliter van een nachtcultuur. Schud de culturen op 37 graden Celsius en monitor de groei per uur door UV-Vis spectroscopie op 600 nanometer. Wanneer de bacteriën een absorptie van ongeveer één bereiken, induceren eiwitexpressie door 0,5 milliliter van één molaire IPTG aan elke kolf toe te voegen, verlaag dan de temperatuur van de schuddende incubator tot 17 graden Celsius en laat de expressie 's nachts 17 tot 20 uur doorgaan.

Op de volgende dag, pellet de bacteriën door centrifugatie op 7000 keer g gedurende 10 minuten op 4 graden Celsius. Verwijder en gooi de vloeibare media weg en bewaar de pellets op min 80 graden Celsius of ga verder met cellyse. Om de cellen te lyse, bereid 100 milliliter lyse buffer volgens manuscript richtingen, resuspend de pellets in de buffer, en breng 25 tot 25 milliliter van de suspensie tot 50 milliliter wegwerp conische buizen.

Plaats de buizen in een plastic bekerglas met ijswater en steek de sonicatortip in de buis zodat de punt ongeveer een centimeter van de onderkant van de buis ligt en het lysaat 10 tot 20 keer sonisch maakt totdat deze vloeibaar en vloeibaar wordt. Breng na het soonen het lysaat over op hoge snelheid centrifugebuizen en verhoog het op 20, 500 x g gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius. Breng de supernatant naar een schone fles en gooi de pellets weg.

Laad het lysaat op de nikkelkolom en was vervolgens de kolom met twee kolomvolumes buffer A, gevolgd door vijf kolomvolumes van 20%buffer B.Absorbantie op 280 nanometer zal tijdens de was nemen als verontreinigingen uit de kolom. Doorgaan met wassen totdat A280 terugkeert naar basiswaarden. Dan ontwijk het eiwit met twee tot drie kolomvolumes van 100%buffer B en verzamel 10 milliliter fracties, ervoor zorgen dat de A280 van elke fractie te meten.

Bereid acht reacties mixen volgens manuscript aanwijzingen en pipet 45 microliters van elke mix in de eerste drie putten van elke rij van een zwarte half-gebied 96-put plaat. Stel de plaatlezer in voor gelijktijdige detectie van florescentie op twee golflengten met een vaste fotomultiplierbuisinstelling. Programmeer de leestijd tot 20 tot 30 minuten met één lezen per minuut en selecteer de te lezen putten.

Steek de plaat in de machine en start het lezen, het toezicht op de emissieverhoudingen na verloop van tijd. Voer een eindpunt lezen van de plaat met de ongesneden substraat. Verwijder de plaat en pipet vijf microliter van enzym in elke put.

Men kan de eerste kolom opslaan als een onbesneden besturingselement. Lees vervolgens de plaat opnieuw voor 20 tot 30 minuten, zorg ervoor dat de plaatlezer in te stellen op de output absolute waarden. Zodra het lezen is voltooid, verzegel de plaat met folie om verdamping te voorkomen en laat het 's nachts op kamertemperatuur om het enzym volledig te snijden het substraat.

Verwijder na 24 uur de film en voer een eindpunt uit van de plaat. Gemiddeld de emissieverhoudingen en record ze als cut. Bevestig het decolleté van het substraat met behulp van SDS-PAGE.

Laad een moleculaire gewichtsmarkering in de eerste of laatste rijstrook en laad vijf microliters van elk reactiemengsel in een rijstrook van de gel, te beginnen met de ongesneden reactie. Bevestig de elektroden van de geltank aan de voeding en voer de producten gedurende 60 minuten op 110 volt. Haal de gel uit de cassette met behulp van een scheurgereedschap en dompel deze onder in vijf tot 10 milliliter kleuroplossing.

Na een tot 24 uur, verwijder de overtollige vlek en dompel de gel onder in water. Maak vervolgens een foto van de gel met behulp van een gel imager. Om de eiwitstructuur voor te bereiden, laadt u het eiwit PDB-bestand in MOE.

Klik op Selecteren en oplosmiddel en verwijder het oplosmiddel. Open het deelvenster Structuur pPreparatie op de bovenste menubalk van Compute en corrigeer automatisch alle structurele items door op Correct te klikken. Protonate de structuur door te klikken op Protonate 3D.

Voeg gedeeltelijke ladingen toe aan het eiwit door het paneel Gedeeltelijke ladingen te openen en AMBER 99 te selecteren en waterstof en eenzame paren aan te passen zoals vereist. Sla vervolgens het structuurbestand op. Als u de structuur voor het substraat peptiden en TRIM14 wilt bouwen, opent u het Protein Builder-paneel, voert u de substraatsequentie in en selecteert u Auto Repack.

Stel vervolgens Geometrie in als Verlengd en klik op Bouwen. Minimaliseer ten slotte de structuur en sla deze op als een PDB-bestand. Dok de substraatpeptiden aan op VEEV-nsP2 met PyRx AudoDock 4.2-software.

Laad het eiwit, klik met de rechtermuisknop op de naam en selecteer Macromolecule maken om het PDBQT-dockingbestand voor te bereiden. Laad vervolgens het substraatmolecuul en selecteer Maak Ligand om het ligand docking-bestand voor te bereiden. Start de wizard AutoDock op het dockingpaneel onderaan en selecteer de voorbereide ligand- en eiwitbestanden.

Definieer de eiwitbindende zak door de rasterafmeting handmatig aan te passen en vervolgens AuotGrid uit te voeren. Voer vervolgens AutoDock uit en selecteer de Lamarckiaanse genetische algoritmemethode. Klik op Docking parameters en stel het aantal GA-runs in op 50 en klik op Doorsturen om de dockingrun te starten.

Wanneer AutoDock is voltooid, opent u het deelvenster Resultaten analyseren en inspecteer u alle voorspelde bindingsposes. Selecteer het beste model met de laagst voorspelde bindingsenergie en redelijke bindende interacties tussen de cis-477 en het substraat op de decolletésite en sla het op als een PDB-bestand voor verdere MD-simulaties. Na het lezen van de bindingsposes met AutoDock is het belangrijk om post-docking analyse uit te voeren om het plausibele bindingsmodel voor verfijning te identificeren met MD-simulaties.

Dit protocol werd gebruikt om korte stukken van homologe gastheer-pathogene eiwitopeenvolgingen of SSHHPS in het Zika virus ns2B/3 protease te vinden. Er werden vier gastheer-eiwitdoelen geïdentificeerd. FOXGS, SFRP1, een Gsalpha subunit uit een retinale cDNA bibliotheek, en de NT5M mitochondriale 5'3'nucleotidase.

Sequentie uitlijningen van de SSHHPS toegestaan soort-specifieke verschillen in de decolleté site sequenties. De SFRP1-sequentie was identiek bij mensen en kippen, wat opmerkelijk is omdat het Zika-virus mortaliteit en microcefalie in kippenembryo's kan veroorzaken. De continue test werd gebruikt om steady state kinetische parameters en remmingsconstanten voor de virale polyproteïne sequenties te meten en de discontinu test werd gebruikt om kwalitatieve decolleté-informatie te verkrijgen, zoals decolleté van een bepaalde sequentie of de remming van de protease door verschillende verbindingen.

Een model van de Venezolaanse paardenencefalitis nsP1-nsP2 knooppunt werd gemaakt met behulp van silico methoden. Voor de nsP2 protease, verlenging van het substraat sequentie en het verminderen van de ionische sterkte van de buffer leidde tot een aanzienlijke vermindering van de Michaelis constante van decollete van een Semliki Forest virus sequentie. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de besturingselementen uit te voeren.

Substraten die de virale protease decolletésitesequenties bevatten, moeten worden getest voordat ze verder gaan met SSHHPS-sequentieanalyse. Als het decolleté van een gastheereiwit wordt waargenomen, moeten vervolgexperimenten worden uitgevoerd om te bevestigen dat dat gastheereiwit virale replicatie beïnvloedt. Dit kan worden gedaan door het eiwit uit te uitdrukking of uit te kuilen en vervolgens de effecten op virale replicatie te onderzoeken.

Groep IV bevat een groot aantal nieuwe en opkomende ziekteverwekkers. De SSHHPS sequenties koppelen specifieke gastheereiwitten en -paden op een zeer voorspelbare manier aan de virale proteases.