Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Defense Threat reductie Agency (DTRA) projectnummers CB-SEED-SEED09-2-0061 en CBCall4-CBM-05-2-0019, en deels door de Intramural/Extramural onderzoeksprogramma van de NCATS, NIH (XH) en Naval Research Laboratory basis fondsen.

De meningen die hier worden geuit zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet die van de u. S. Navy, U. S. Army, U. S. Department of Defense, of de regering van de U. S.

Sequentie-specifieke vernietiging van een eiwit of een nucleïnezuur geleid door een vreemde sequentie wordt alleen gezien in een paar gevallen in de biologie. De in Figuur 1 getoonde mechanismen zijn defensieve mechanismen die een host beschermen tegen een virus of een virus van een host.
Met behulp van bioinformatica methoden kunnen we de doelstellingen identificeren die door deze systemen worden vernietigd. In onze analyses van SSHHP-sequenties ontdekten we dat velen van hen gevonden konden worden in eiwitten die nodig waren om aangeboren immuunresponsen te genereren. Sommige hadden duidelijke rollen zoals Mavs en trif (TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β), terwijl andere waren gerelateerd aan immuniteit hoewel complexere mechanismen (bijv. histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. De doel informatie die is opgeslagen in de SSHHP-reeks heeft de potentie om trajecten te identificeren die antivirale effecten tegen deze virussen hebben. Antivirale reacties in vivo zijn vaak virus-specifieke26,43. Subsets van trim proteïnen hebben bijvoorbeeld antivirale effecten op verschillende virussen43,44,45, sommige zijn virale restrictie factoren (bijv. HIV en TRIM5α). De specificiteit van de trim eiwitten (~ 70 zijn geïdentificeerd) nog steeds wordt onderzocht44,45. De informatie binnen SSHHP'S kan bijdragen aan ons begrip van hoe deze virussen de aangeboren immuunresponsen omzeilen. Andere patronen en correlaties kunnen worden ontdekt naarmate meer SSHHP'S worden onderzocht.
In onze analyses zijn soortspecifieke verschillen zichtbaar (Figuur 2, Figuur 10). Het is bekend dat deze virussen sommige soorten meer beïnvloeden dan andere. Informatie over het hostbereik, de gevoeligheid van de host en de verdediging van de host kunnen aanwezig zijn in SSHHPS. Bijvoorbeeld, paarden, de meest vatbare soort voor paardachtigen encefalitis virussen, ontbrak de regio van de menselijke TRIM14 die transitief werd gesneden door de VEEV nsP2 protease. Mensen sterven zelden aan VEEV-infecties, maar kunnen24worden geïnfecteerd. De Human TRIM14 Protein droeg een nsP2 protease decolleté sequentie6. De aanwezigheid van de splijting site suggereren dat mensen hebben een afweermechanisme tegen deze virussen. Vogels zijn gedacht te zijn potentiële reservoirs van deze virussen46. De corresponderende SSHHP-sequentie in het TRIM14-eiwit van kippen verschaf van de sequenties gevonden bij mensen en andere soorten. Subtiele verschillen zoals deze kunnen een doelhost eiwit oncleavable of gemakkelijker gespleten maken. Aguirre et al.16 toonde aan dat een oncleavable gemuleerd snaar eiwit hogere niveaus van IFN veroorzaakte na infectie met het Denguevirus en dat muizen natuurlijk een versie van Sting dragen die niet door de dengue ns2B3 protease wordt gesneden. De Murine STING eiwit werd niet gesneden door de ZIKV protease47. In onze SSHHPS-analyse observeerden we ook verschillen in de sequenties van de ZIKV-protease-decolleté op de site toen we de menselijke eiwitten vergeleken met die van knaagdieren6 (Figuur 10D). Het reproduceren van de soortspecifieke Proteolytische splijting van gastheer eiwitten kan belangrijk zijn in diermodellen die worden gebruikt voor groep IV-virussen. De remming van host Protein decolleté heeft ook implicaties met betrekking tot de ontwikkeling van groep IV proteaseremmers. In onze vorige publicatie toonden we aan dat we TRIM14 decolleté konden remmen door de VEEV nsP2 protease met behulp van CA074 methyl ester6. Dit resultaat suggereert dat kleine molecuul remmers van deze proteasen in staat zijn om de aangeboren immuunresponsen te moduleren die de infectie kunnen onderdrukken6,31.
Genetische variatie binnen een soort heeft ook de potentie om verschillen in Proteolytische splijting te produceren. Subtiele verschillen in het gebruik van codon kunnen invloed hebben op ribosoom onderbreken van48. Omdat sommige groep IV virale proteasen zijn ingebed in het ER membraan, verschillen in deze pauzes kunnen invloed hebben op decolleté van een doelwit als decolleté co-translationally optreedt. Sommige van de decolleté sites die we identificeerden waren in voorspelde signaal peptide sequenties (bijv., SFRP1) terwijl anderen intern waren.
SSHHPS-analyse kan informatie produceren die verschilt van andere methoden voor het hosten van eiwit analyses. SSHHPS-analyse was goedkoop en eenvoudig in gebruik. Het gebruik van een bacteriële expressie systeem toegestaan het testen van korte segmenten (~ 25 aminozuren) van zoogdier sequenties zonder het gebruik van zoogdier celcultuur. We constateerden dat de GVB-YFP-substraten alle geteste menselijke eiwit sequenties konden tolereren; echter, de rendementen varieerden. In vergelijkbare assays, substraten met menselijke eiwit sequenties zolang 63 aminozuren werden met succes uitgedrukt, gezuiverd, en gebruikt voor kinetische analyses en remmer screening49,50,51. Aangezien slechts kleine hoeveelheden van het substraat nodig zijn voor de discontinue Assay, kan een groot aantal doelwitten worden verkend. Een voordeel van het systeem is dat de CFP/YFP-substraten kunnen worden gebruikt voor SDS-PAGE-analyses en voor uitgebreidere kinetische analyses (d.w.z. IC50, ki, km, VMax). Voor de opsporing van geneesmiddelen, remmende verbindingen kunnen produceren artefacten in fluorescerende assays. Zo kan de discontinue assay in combinatie met een continue test een decolleté of remming van decolleté bevestigen. De monsters voor de discontinue SDS-PAGE assay kunnen direct uit de 96-well platen worden genomen. CFP/YFP substraten zijn gebruikt voor samengestelde bibliotheek screening52. Er zijn echter aanvullende analyses nodig om te bepalen of een substraat geschikt is voor screening met een hoge doorvoer, zoals de berekening van een Z-factor53.
Een uitdaging bij het ontwerpen van een substraat is het identificeren van de regio rond de scissile binding die is gebonden en herkend door de protease. In de hier getoonde voorbeelden begonnen we met 12 residu sequenties die gecentreerd waren rond de scissile binding. Na het analyseren van sequentie overeenstemmingen van de decolleté sites werd homologie op de residuen N-terminal van de scissile binding gevonden voor de VEEV protease, terwijl voor de ZIKV protease homologie aan verschillende van de C-terminale residuen werd aangetroffen. Een in silico-model van het gedockte substraat kan worden gebruikt voor het ontwerpen van door de site geleide mutagenese experimenten die de bindingsplaatsen van het substraat sonde. Aangezien de substraat-en enzym sequenties op plasmiden staan, kan worden gemuleerd om de in silico-modellen of subsite toleranties te testen. Dit kan voordelig zijn als er geen kristalstructuur van het gebonden substraat (s) beschikbaar is.
SSHHPS-analyse kan ook nieuwe informatie opleveren over de mechanismen waarmee door virussen geïnduceerde fenotypes worden geproduceerd door virale enzymen. Een van de zikv targets, SFRP1, maakt deel uit van de Wnt signalering traject en heeft rollen in zowel hersenen en oog ontwikkeling en in de immuunresponsen36,37,54,55,56,57. We constateerden dat de andere eiwit sequenties die door de ZIKV ns2B/ns3 protease konden worden gesneden ook in eiwitten waren die betrokken waren bij de ontwikkeling van hersenen en ogen; afwijkingen in beide zijn waargenomen bij congenitale Zika syndroom en worden verondersteld deel uit te maken van het virus-geïnduceerde fenotype58.
De voorspelbaarheid van gastheer-pathogen interacties kunnen worden misbruikt voor een verscheidenheid van toepassingen: target-specifieke oncolytic virale therapieën; het-riskeren van levende virusvaccins; verfijning, voorspellen of selecteren van diermodellen; voorspelling van het hostbereik of de gevoeligheid; voorspelling van zoönotische gebeurtenissen; en voorspelling van de host-verdediging. Aangezien de beschreven methoden op volgorde gebaseerd zijn, kunnen ze van waarde zijn om in de toekomst in software te integreren.

Bewijs van horizontale genoverdracht van virus naar host, of host to virus, kan worden gevonden in een verscheidenheid van genomen1,2,3,4. Voorbeelden van virale endogenisatie zijn de crispr spacer sequenties gevonden in bacteriële gastheer genomen4. Onlangs hebben we bewijs gevonden van gastheer eiwit sequenties ingebed in de niet-structurele poly proteïnen van (+) ssRNA groep IV virussen. Deze sequenties binnen de codeer gebieden van het virale genoom kunnen generationeel worden vermeerderd. De korte stukken van homologeuze gastheer-pathogen eiwit sequenties (sshhp's) zijn te vinden in het virus en gastheer5,6. Sshhp's zijn de gekligeerde decolleté-site-Motif sequenties die worden herkend door virale proteasen die homologie hebben aan specifieke gastheer eiwitten. Deze sequenties direct de vernietiging van specifieke gastheer eiwitten.
In onze vorige publicatie6hebben we een lijst samengesteld van alle gastheer eiwitten die werden doelwit van virale proteasen en ontdekten dat de lijst met doelen niet-willekeurig was (tabel 1). Er waren twee trends zichtbaar. Ten eerste behoorde het merendeel van de virale proteasen die gastheer eiwitten knippen tot groep IV virussen (24 van de 25 gevallen betrokken groep IV virale proteasen), en een protease behoorde tot de (+) ssRNA groep VI retrovirussen (HIV, humaan immunodeficiëntie virus)7. Ten tweede waren de eiwit doelen van de gastheer die door de virale proteasen werden gesneden in het algemeen betrokken bij het genereren van de aangeboren immuunresponsen die suggereerden dat de decolleté bedoeld waren om de immuunresponsen van de gastheer te antagoniseren. De helft van de gastheer eiwitten doelwit van de virale proteasen waren bekende componenten van signalering van Cascades die interferon (IFN) en proinflammatoire cytokines genereren (tabel 1). Anderen waren betrokken bij de transcriptie van host cellen8,9,10 of vertaling11. Belangwekkend, Shmakov et al.4 hebben aangetoond dat veel crispr protospacer sequenties corresponderen met genen die betrokken zijn bij plasmide conjugatie of replicatie4.
Groep IV omvat onder andere de Flaviviridae, de Picornaviridae, de Coronaviridae, de Calciviridae en de togaviridae. Verschillende nieuwe en opkomende pathogenen behoren tot groep IV zoals het Zikavirus (ZIKV), West Nile (WNV), chikungunya (CHIKV), ernstig acuut respiratoir syndroom virus (SARS) en Middle East respiratoir syndroom (MERS). Het (+) ssRNA genoom is in wezen een stukje mRNA. Om de enzymen te produceren die nodig zijn voor genoom replicatie moet het (+) ssRNA genoom eerst worden vertaald. In alphavirussen en andere groep IV virussen, de enzymen die nodig zijn voor de replicatie worden geproduceerd in een enkel poly eiwit (dat wil zeggen, nsP1234 voor VEEV). De niet-structurele poly proteïne (nsP) is proteolytisch verwerkt (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) door de nsP2 protease voor de productie van actieve enzymen12 (Figuur 1). Decolleté van de poly proteïne door de nsP2 protease is essentieel voor virale replicatie; Dit is aangetoond door verwijdering en op de site gerichte mutagenese van de actieve site cysteïne van de nsP2 protease13,14. Met name de vertaling van virale eiwitten voorafgaat aan genoom replicatiegebeurtenissen. NsP4 bevat bijvoorbeeld de RNA-afhankelijke RNA-polymerase die nodig is om het (+) ssRNA-genoom te repliceren. Genoom replicatie kan dsRNA-Intermediates produceren; deze tussen producten kunnen de aangeboren immuunresponsen van de gastheer activeren. Dus, deze virussen kunnen klieven gastheer aangeboren immuunrespons eiwitten vroeg in de infectie om hun effecten te onderdrukken15,16,17.
Silencing kan optreden op het niveau van DNA, RNA en eiwitten. Wat voor elk van de in Figuur 1 getoonde geluids dempings mechanismen gebruikelijk is, is dat korte vreemde DNA-, RNA-of eiwit sequenties worden gebruikt om de vernietiging van specifieke doelen te begeleiden om hun functie te antagoniseren. De geluidsdempende mechanismen zijn analoog aan Programma's voor zoeken en verwijderen die in drie verschillende talen zijn geschreven. De korte decolleté site sequentie is analoog aan een "keyword". Elk programma heeft een enzym dat de overeenkomst herkent tussen de korte reeks (het "trefwoord") en een woord in het "bestand" dat moet worden verwijderd. Zodra een overeenkomst wordt gevonden, het enzym snijdt ("verwijdert") de grotere doel volgorde. De drie in Figuur 1 getoonde mechanismen worden gebruikt om de gastheer te verdedigen tegen virussen, of om een virus te verdedigen tegen het immuunsysteem van een gastheer.
Virale proteasen herkennen korte decolleté site Motif sequenties tussen ~ 2-11 aminozuren; in nucleotiden komt dit overeen met 6-33 basissen. Ter vergelijking, crispr spacer sequenties zijn ~ 26-72 nucleotiden en RNAi zijn ~ 20-22 nucleotiden18,19. Hoewel deze sequenties relatief kort zijn, kunnen ze specifiek worden herkend. Gezien de hogere diversiteit van aminozuren, is de waarschijnlijkheid van een willekeurig decolleté-evenement relatief laag voor een virale protease die eiwit sequenties van 6-8 aminozuren of langer herkent. De voorspelling van SSHHP'S in gastheer eiwitten zal grotendeels afhangen van de specificiteit van de virale protease die wordt onderzocht. Als de protease strikte sequentie specificiteits vereisten heeft, is de kans op het vinden van een decolleté site sequentie 1/206 = 1 in 64.000.000 of 1/208 = 1 in 25.600.000.000; de meeste proteasen hebben echter variabele subsite toleranties (bijvoorbeeld R of K kan worden getolereerd op de S1-site). Daarom is er geen vereiste voor de sequentie-identiteit tussen de reeksen gevonden in de host versus het virus. Voor virale proteasen met lossere sequentie vereisten (zoals die van Picornaviridae) kan de kans op het vinden van een decolleté plaats in een gastheer eiwit hoger zijn. Veel van de vermeldingen in tabel 1 zijn afkomstig uit de familie Picornaviridae .
Schechter & Berger notatie20 wordt vaak gebruikt om de residuen in een protease substraat en de subsites waaraan ze binden te beschrijven, we gebruiken deze notatie overal. De residuen in het substraat die N-terminal van de scissile binding zijn worden aangeduid als P3-P2-P1 terwijl die C-terminal worden aangeduid als P1'-P2'-P3 '. De corresponderende subsites in de protease die deze aminozuurresiduen binden zijn S3-S2-S1 en S1'-S2'-S3 ', respectievelijk.
Om te bepalen welke host-eiwitten worden getarget, kunnen we SSHHP'S identificeren in de decolleté van virale polyprotein-sites en zoeken naar de gastheer eiwitten die ze bevatten. Hierin schetsen we procedures voor het identificeren van sshhp's met behulp van bekende virale protease decolleté site sequenties. De bioinformatische methoden, protease-assays en in de beschreven silico-methoden zijn bedoeld om te worden gebruikt in combinatie met assays op basis van cellen.
Sequentie-overeenstemmingen van de gastheer eiwitten die worden getarget door virale proteasen hebben soortspecifieke verschillen onthuld binnen deze korte decolleté site sequenties. Bijvoorbeeld, het Venezolaanse Equine encefalitis virus (veev) nsP2 protease bleek te snijden menselijke TRIM14, een tripartiete motief (Trim) eiwit6. Sommige TRIM proteïnen zijn virale restrictie factoren (bijv. TRIM5α21), de meeste worden verondersteld ubiquitine E3 ligases te zijn. TRIM14 mist een RING (echt interessant nieuw gen) domein en wordt niet beschouwd als een E3 ligase22. TRIM14 is voorgesteld een adapter te zijn in de mitochondriale antivirale signalosome (MAVS)22, maar kan andere antivirale functies hebben23. Uitlijning van TRIM14 sequenties van verschillende soorten toont aan dat paarden niet de decolleté site en haven een afgeknotte versie van TRIM14 die het C-Terminal PRY/SPRY-domein mist. Dit domein bevat een polyubiquitination site (afbeelding 2). In paardachtigen zijn deze virussen zeer dodelijk (~ 20-80% sterfte) terwijl bij mensen slechts ~ 1% sterven aan VEEV-infecties24. Decolleté van het PRY/SPRY-domein kan de MAVS-signalerings Cascade transitief kortsluiting. Deze Cascade kan worden geactiveerd door dsRNA en leidt tot de productie van interferon en pro-inflammatoire cytokines. De aanwezigheid van de SSHHP'S kan dus nuttig zijn om te voorspellen welke soorten verdedigingssystemen hebben tegen specifieke groep IV-virussen.
In groep IV virussen, IFN antagonisme mechanismen worden verondersteld te vermenigvuldigen redundant25. Host Protein decolleté kan van voorbijgaande aard zijn tijdens infectie en concentraties kunnen na verloop van tijd herstellen. We vonden in cellen dat TRIM14 decolleté producten zeer vroeg kunnen worden gedetecteerd na trans fectie (6 h) met een plasmide coderen van de protease (cytomegalovirus promotor). Bij langere periodes werden de splijting producten echter niet gedetecteerd. In virus geïnfecteerde cellen waren de kinetiek verschillend en konden decolleté producten worden gedetecteerd tussen 6-48 h6. Anderen hebben het uiterlijk van gastheer eiwit splijting producten gemeld al in 3-6 h post infectie9,11.
Proteolytische activiteit in cellen is vaak moeilijk te vangen; de splijting producten kunnen variëren in hun oplosbaarheid, concentratie, stabiliteit en levensduur. In op cellen gebaseerde testen kan niet worden aangenomen dat splijting producten zich in een cel zullen ophopen of dat de band intensiteiten van cut en Onbesneden proteïne compenserende verhogingen en dalingen zullen vertonen, aangezien het snij eiwit zeer snel kan worden afgebroken en mogelijk niet detecteerbaar is in een Western-Blot met een verwacht molecuulgewicht (MW) (bijv. de regio met de epitoop kan worden gespleten door andere gastheer proteasen of kunnen worden alomtegenwoordig). Als het substraat van de virale protease een aangeboren immuunrespons-eiwit is, kan de concentratie ervan variëren tijdens infectie. Bijvoorbeeld, sommige aangeboren immuunrespons eiwitten zijn aanwezig vóór virale infectie en worden verder geïnduceerd door interferon26. De concentratie van het doeleiwit kan daarom fluctueren tijdens infectie en vergelijking van niet-geïnfecteerde vs. geïnfecteerde cellysaten kan moeilijk te interpreteren zijn. Bovendien zijn alle cellen mogelijk niet gelijkmatig getransfuneerd of geïnfecteerd. In vitro protease assays met behulp van gezuiverde eiwitten van E. coli aan de andere kant hebben minder variabelen waarvoor te controleren en dergelijke testen kunnen worden gedaan met behulp van SDS-page in plaats van immunoblots. Contaminerende proteasen kunnen worden geremd in de vroege stappen van de eiwit zuivering van het GVB/YFP substraat, en gemuleerde virale proteasen kunnen worden gezuiverd en getest als controles om te bepalen of het decolleté te wijten is aan het virale protease of een contaminerende bacteriële protease.
Een beperking van in vitro protease-assays is dat ze de complexiteit van een zoogdier cel missen. Voor een enzym om zijn substraat te snijden, moeten de twee worden co-gelokaliseerd. Groep IV virale proteasen verschillen in structuur en lokalisatie. Bijvoorbeeld, de ZIKV protease is ingebed in het endoplasmisch reticulum (ER) membraan en kijkt naar de cytosol, terwijl de VEEV nsP2 protease is een oplosbare proteïne in het cytoplasma en Nucleus27. Sommige van de decolleté site sequenties gevonden in de ZIKV SSHHPS analyse waren in signaal peptiden suggereren dat decolleté co-translationally voor sommige doelen optreden kan. In deze analyses moet dus ook rekening worden gehouden met de locatie van het protease en het substraat in de cel.
Assays op basis van cellen kunnen waardevol zijn voor het vaststellen van een rol voor de geïdentificeerde gastheer-eiwit (en) in infectie. Methoden die erop gericht zijn virale protease splitsing van gastheer proteïnen te stoppen, zoals de toevoeging van een proteaseremmer6 of een mutatie in het hostdoel16 , kunnen worden gebruikt om de effecten ervan op virale replicatie te onderzoeken. Overexpressie van het beoogde eiwit kan ook invloed hebben op virale replicatie28. Plaque-assays of andere methoden kunnen worden gebruikt om virale replicatie te kwantificeren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

Alphavirale enzymen worden gesynthetiseerd in één polypeptide. De niet structureel poly protein (NSP) wordt verwerkt door zijn nsP2 cysteïne protease om actieve enzymen te produceren die essentieel zijn voor virale replicatie. Virale proteasen zijn zeer specifiek en herkennen gekonveerde decolleté site motief sequenties (~ 6-8 aminozuren). In verschillende groep IV virussen, de nsP protease (s) decolleté site Motif sequenties kunnen worden gevonden in specifieke gastheer eiwitten die betrokken zijn bij het genereren van de aangeboren immuunresponsen en, in sommige gevallen, de beoogde eiwitten lijken te worden gekoppeld aan het virus-geïnduceerde fenotype. Deze virussen maken gebruik van korte stukken van homologeuze gastheer-pathogen-eiwit sequenties (SSHHP'S) voor gerichte vernietiging van gastheer eiwitten. Om sshhp's te identificeren kan de virale protease decolleté site Motif sequenties worden ingevoerd in blast en de gastheer genoom (s) kan worden doorzocht. Decolleté kan in eerste instantie worden getest met behulp van de gezuiverde nsP virale protease en fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET) substraten gemaakt in E. coli. De FRET substraten bevatten cyaan en gele fluorescerende eiwitten en de decolleté site sequentie (CFP-sequentie-YFP). Deze protease test kan continu worden gebruikt in een plaat lezer of discontinu in SDS-PAGE gels. Modellen van de gebonden peptide substraten kunnen in silico worden gegenereerd om substraat selectie en mutagenese studies te begeleiden. CFP/YFP substraten zijn ook gebruikt om te identificeren van proteaseremmers. Deze in vitro en in silico-methoden kunnen worden gebruikt in combinatie met assays op basis van cellen om te bepalen of de beoogde host-proteïne van invloed is op virale replicatie.

SSHHPS analyse van de ZIKV ns2B/3 protease geïdentificeerd 4 host eiwit targets: FOXG1, SFRP1, een Gs alpha subeenheid van een retinale cDNA Library, en de NT5M mitochondriale 5 ', 3 '-nucleotidase (Figuur 10)6. Met name voorspelde geen andere methode deze eiwitten als potentiële doelen van de ZIKV protease. Mutaties in het FOXG1-gen zijn gekoppeld aan een aangeboren syndroom dat wordt gekenmerkt door verminderde ontwikkeling en structurele hersenafwijkingen zoals microcefalie. SFRP1 is een afgescheiden, frizzled-gerelateerd eiwit (SFRP); Deze oplosbare receptoren kunnen op competitieve wijze WNT-liganden binden aan antagoniseert en WNT-signalering remmen. De Wnt signalering traject is betrokken bij de regulering van de IFN reactie tijdens Flavivirus infectie36. Het decolleté van SFRP1 zou naar verwachting de Flavivirus-replicatie verbeteren. SFRP1 is ook betrokken bij Th17-celdifferentiatie37. Sequentie-overeenstemmingen van de SSHHP'S toonden soortspecifieke verschillen in de decolleté site sequenties (Figuur 10D). De decolleté site sequentie in SFRP1 was identiek bij mensen en kippen; ZIKV kan mortaliteit en microcefalie veroorzaken in kippen embryo's38. Bij knaagdieren wordt de sterk gecondengeerde P1-residu (K/R) R ↓ G vervangen door een Glycine (RGG). Immunocompetente muizenstammen zijn over het algemeen resistent tegen ZIKV infectie en ziekte39.
Steady State kinetische parameters en remming constanten kunnen worden gemeten voor de virale polyproteïne sequenties en voor de gastheer eiwit sequenties met behulp van de continue assay in een plaat lezer31,40,41 (Figuur 11a). Voor kwalitatieve decolleté informatie, zoals decolleté van een bepaalde sequentie of de remming van de protease door verschillende verbindingen, kan de discontinue test worden gebruikt (Figuur 11B).
De optimalisering van het aantal residuen tussen GVB en YFP kan nodig zijn. Een substraat gebonden model kan worden gemaakt met behulp van de in silico methoden. Een representatief gedockt model van de kruising nsP1/nsP2 wordt weergegeven in afbeelding 9. Voor de VEEV nsP2 protease was een decolleté van een 12-amino acid Semliki forest virus (SFV) sequentie gerapporteerd (Km = 0,58 mM)33. Het verlengen van de substraat volgorde tot 19, 22 en 25 residuen en het verminderen van de Ionische sterkte van de buffer leidde tot een significante reductie in Km. Onderzoek van de VEEV nsP2 kristalstructuur en kristal verpakking toonde ook aan dat een deel van een van de knooppunten was verpakt tegen het protease domein en was helical. Zo kunnen de langere VEEV-substraten beter binden door de herkenning van een secundair structureel motief.
Voor TRIM14, we verkregen een Km = 21 μM6,33. De Km voor het substraat met de host-eiwitsequentie was vergelijkbaar met de km -waarden van de substraten met de sequenties van de virale polyprotein decolleté site (km(V12) = 12 μm en Km(V34) = 21 μm). De splitsings site sequenties op de nsP1/nsP2, nsP2/nsP3, en nsP3/nsP4 knooppunten werden met verschillende efficiënties gesneden. In de cel, dit wordt gedacht om toe te staan voor sequentiële splitsing van de poly proteïne42.
Voorzichtigheid moet worden betracht bij het interpreteren van negatieve resultaten. Als er geen decolleté optreedt, kan de decolleté plaats te kort zijn of kan de gezuiverde protease inactief zijn. Voor substraten die geknipt worden, zijn extra experimenten nodig om het splijting van het volledige eiwit of decolleté in virus geïnfecteerde cellen te bevestigen. Er moeten passende follow-on-experimenten worden gekozen. De effecten van overexpressie of uitschakeling van het doeleiwit op virale replicatie kunnen ook worden getest.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Figuur 1: drie mechanismen van uitschakeling. Silencing kan optreden op het niveau van DNA, RNA, of eiwitten. Deze algoritmen ' zoeken en verwijderen ' gebruiken elk een ' trefwoord ' om het decolleté van een bestand met het woord te richten. Dit cijfer is gewijzigd van Morazzani et al.32 en de verwijzingen daarin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Figuur 2: soortspecifieke verschillen in de decolleté van de site sequenties. De C-Terminal PRY/SPRY-domeinen van TRIM14-homologen worden in de uitlijning weergegeven. Het PRY/SPRY-domein kan worden geïdentificeerd door de geaccentueerde motieven die grijs zijn gemarkeerd. Human TRIM14 wordt gesneden in QEAGA ↓ G door de VEEV nsP2 cysteïne protease. De SSHHP-sequentie wordt in kleur weergegeven. Het residu in het groen is het P1-residu; blauw is de P4 residu, en in het rood zijn andere behouden residuen binnen de decolleté site Motif sequentie. Paarden haven een afgeknotte versie van TRIM14 zonder het PRY/SPRY-domein. De lysine gemarkeerd in cyaan is poly-alomtegenwoordige en is belangrijk voor de assemblage van de MAVS signalosome. De C-Terminal PRY/SPRY-domein kan transitief worden afgesneden door de nsP2 protease om de antivirale respons van de gastheer te schaden tijdens een acute virale infectie. In paardachtigen is dit domein altijd afwezig. Dit suggereert dat het PRY/SPRY-domein van TRIM14 een beschermende functie kan hebben tegen VEEV-infecties. Dit cijfer is gereproduceerd van Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Figuur 3: SSHHPS-identificatie met behulp van blast. De volgorde van de decolleté-site op de veev nsP1/nsP2 Junction is afgestemd op de sshhp-sequentie in de host Protein TRIM14. Het residu groen gekleurd is het P1-residu; in blauw is de P4 residu en in het rood zijn andere geconcongeerde resten van de decolleté site Motif sequentie. De meeste harmoniseringen bevatten homologie aan gebieden buiten het gediende decolleté site motief of omvatten niet de P1/P1 ' scissile obligatie residuen. TRIM14 toonde een match met 6 residuen in sequentiële volgorde die P1 en P1 omvatte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Figuur 4: eiwit-en DNA-sequenties van het GVB-V12-YFP substraat voor de VEEV nsP2 cysteïne protease. De beperkings sites NdeI (CATATG) en XhoI (CTCGAG) worden in hoofdletters weergegeven. In het rood is de decolleté site sequentie van de virale poly proteïne die zich tussen nsP1 en nsP2. Het residu in het groen is de P1 ' residu en in blauw is de P4 residu van de decolleté site. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Figuur 5: eiwitsequentie van de TRX-VEEV-nsP2 cysteïne protease construct. Thioredoxine (TRX) wordt geel weergegeven. De trombine decolleté site en zijn-tag worden in cyaan weergegeven. De CYS-zijn dyad zijn rood gelabeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Figuur 6: Peptide structuren in moe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Afbeelding 7: docking van substraat peptide met behulp van PyRx/AutoDock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Figuur 8: taken die op het Biowulf-cluster worden uitgevoerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Figuur 9: model van het VEEV P12 substraat dat de decolleté site sequentie op de nsP1/nsP2 Junction bevat. De CYS-477/his-546 katalytische dyade wordt blauw weergegeven. Figuur werd gemaakt met behulp van pymol (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Figuur 10: SSHHPS-analyse van het zikavirus ns2B/ns3 protease. A) voorspelde eiwit doelstellingen voor de host van de Zikv ns2B/ns3 protease. Residuen in het rood komen overeen met één enkele decolleté site sequentie. Residuen in het groen worden getolereerd op de subsite en komen overeen met residuen op andere decolleté plaatsen. SFRP1 had het hoogste aantal identieke residuen in opeenvolgende volgorde. (B) GVB-substraat-yfp-eiwitten (~ 50-60 kDa) werden uitgedrukt en gezuiverd met de voorspelde sshhp-sequentie van elk gastheer eiwit (menselijk). De ZIKV protease cut Human FOXG1, SFRP1, NT5M en een Gsalpha subeenheid geïsoleerd uit een retinale cDNA Library. De decolleté producten zijn ongeveer 28-30 kDa. De substraat sequenties zijn beschikbaar in morazzani et al.6 (C) terwijl de ns2B/ns3 protease cut SFRP1, het heeft zijn homologen niet gesneden (SFRP2 en SFRP4). D) de uitlijning van de decolleté van verschillende diersoorten kan nuttig zijn bij de keuze van een diermodel voor een groep IV-virus. Merk op dat de gecondengeerde R ↓ G-sequentie verschilt tussen mensen en knaagdieren in SFRP1. Figuur gereproduceerd van Morazzani et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Figuur 11: kinetische analyse van steady state met behulp van de continue en discontinue assays. A) de in tabel 5 getoonde kinetische gegevens zijn in grafit uitgezet. De inzet toont de lineweaver-Burk plot. B) SDS-page gel die de splijting producten van het GVB-V12-yfp-substraat weergeeft. In Lane 1 is de "ONBESNEDEN" substraat (48 kDa). In Lane 2 is het "CUT" substraat (31 kDa en 27 kDa). In Lanes 3-9 werden verschillende verbindingen opgenomen om hun remmende activiteit te testen. Lane 4 bevat de E64d covalente remmer. Deze reacties werden 's nachts uitgevoerd voor ~ 17 h bij kamertemperatuur. Het koken van de monsters was nodig om het scherpe banding patroon te bereiken. De nsP2 protease is zichtbaar (56 kDa) in de reacties die enzym bevatten, maar niet in Lane 1. Lane 1 is de "No enzyme" controle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

We presenteren een algemeen protocol voor het identificeren van korte stukken van homologe gastheer-pathogen eiwit sequenties (SSHHP'S) ingebed in de virale poly eiwit. SSHHP'S worden herkend door virale proteasen en richten de gerichte vernietiging van specifieke gastheer proteïnen op door verschillende groep IV virussen.

Analyse van virale SSHHP'S in groep IV met gebruikmaking van in vitro en silico-methoden

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

We hebben aangetoond dat virale genomen van groep IV korte stukken gastheereiwitsequenties coderen. Deze sequenties zijn te vinden in de virale protease decolleté sites. Ze worden gebruikt voor de gerichte vernietiging van gastheer-eiwitten, meestal eiwitten die betrokken zijn bij het genereren van de immuunreacties.Een groot voordeel van het gebruik van protease tests is dat het de complexiteit van een cel verwijdert en laat zien of een virale protease een bepaalde sequentie kan splijten. Dus toen we Zika SSHHPS sequenties analyseerden, ontdekten we dat de protease sequenties kon snijden in eiwitten die betrokken zijn bij het genereren van immuunreacties en dat sommige van deze eiwitten ook rollen hadden in de ontwikkeling van de hersenen en het oog. Bij het uitvoeren van deze techniek voor de eerste keer, moet men niet vergeten dat als decolleté niet wordt waargenomen, dat het kan te wijten zijn aan een verscheidenheid van factoren, zoals de activiteit van de protease.Het aantonen van de procedure zal Jaimee Compton zijn, een technicus van mijn laboratorium. Begin met het openen van Protein BLAST en zet de 20 aminozuren rond de scissile binding en de virale polyproteïne en selecteer niet-redundante eiwitsequenties en typ vervolgens het gastheergenoom om te zoeken. Selecteer indien nodig PHI-BLAST en typ in een patroonreeks waarbij vierkante haakjes aangeven dat aminozuur binnen de haakjes op de vervangende positie kan staan en vervolgens op BLAST kan worden geslagen.Rangorde de BLAST-hits op basis van het aantal opeenvolgende identieke of getolereerde residuen die overeenkomen met een decolletésitereeks. Selecteer in de lijst de eiwitten die zes of meer identieke of soortgelijke residuen bevatten voor analyse in de proteasetesten. Bouw een plasmide codering van de cyaan fluorescerende eiwit, tot 25 aminozuren van de decolleté sequentie, en de gele fluorescerende eiwit.Bereid vervolgens de GVB- en YFP-substraten voor door vier vier liter kolven te inenten met 25 milliliter van een nachtcultuur. Schud de culturen op 37 graden Celsius en monitor de groei per uur door UV-Vis spectroscopie op 600 nanometer. Wanneer de bacteriën een absorptie van ongeveer één bereiken, induceren eiwitexpressie door 0,5 milliliter van één molaire IPTG aan elke kolf toe te voegen, verlaag dan de temperatuur van de schuddende incubator tot 17 graden Celsius en laat de expressie 's nachts 17 tot 20 uur doorgaan.Op de volgende dag, pellet de bacteriën door centrifugatie op 7000 keer g gedurende 10 minuten op 4 graden Celsius. Verwijder en gooi de vloeibare media weg en bewaar de pellets op min 80 graden Celsius of ga verder met cellyse. Om de cellen te lyse, bereid 100 milliliter lyse buffer volgens manuscript richtingen, resuspend de pellets in de buffer, en breng 25 tot 25 milliliter van de suspensie tot 50 milliliter wegwerp conische buizen.Plaats de buizen in een plastic bekerglas met ijswater en steek de sonicatortip in de buis zodat de punt ongeveer een centimeter van de onderkant van de buis ligt en het lysaat 10 tot 20 keer sonisch maakt totdat deze vloeibaar en vloeibaar wordt. Breng na het soonen het lysaat over op hoge snelheid centrifugebuizen en verhoog het op 20, 500 x g gedurende 30 minuten bij 4 graden Celsius. Breng de supernatant naar een schone fles en gooi de pellets weg.Laad het lysaat op de nikkelkolom en was vervolgens de kolom met twee kolomvolumes buffer A, gevolgd door vijf kolomvolumes van 20%buffer B.Absorbantie op 280 nanometer zal tijdens de was nemen als verontreinigingen uit de kolom. Doorgaan met wassen totdat A280 terugkeert naar basiswaarden. Dan ontwijk het eiwit met twee tot drie kolomvolumes van 100%buffer B en verzamel 10 milliliter fracties, ervoor zorgen dat de A280 van elke fractie te meten.Bereid acht reacties mixen volgens manuscript aanwijzingen en pipet 45 microliters van elke mix in de eerste drie putten van elke rij van een zwarte half-gebied 96-put plaat. Stel de plaatlezer in voor gelijktijdige detectie van florescentie op twee golflengten met een vaste fotomultiplierbuisinstelling. Programmeer de leestijd tot 20 tot 30 minuten met één lezen per minuut en selecteer de te lezen putten.Steek de plaat in de machine en start het lezen, het toezicht op de emissieverhoudingen na verloop van tijd. Voer een eindpunt lezen van de plaat met de ongesneden substraat. Verwijder de plaat en pipet vijf microliter van enzym in elke put.Men kan de eerste kolom opslaan als een onbesneden besturingselement. Lees vervolgens de plaat opnieuw voor 20 tot 30 minuten, zorg ervoor dat de plaatlezer in te stellen op de output absolute waarden. Zodra het lezen is voltooid, verzegel de plaat met folie om verdamping te voorkomen en laat het 's nachts op kamertemperatuur om het enzym volledig te snijden het substraat.Verwijder na 24 uur de film en voer een eindpunt uit van de plaat. Gemiddeld de emissieverhoudingen en record ze als cut. Bevestig het decolleté van het substraat met behulp van SDS-PAGE.Laad een moleculaire gewichtsmarkering in de eerste of laatste rijstrook en laad vijf microliters van elk reactiemengsel in een rijstrook van de gel, te beginnen met de ongesneden reactie. Bevestig de elektroden van de geltank aan de voeding en voer de producten gedurende 60 minuten op 110 volt. Haal de gel uit de cassette met behulp van een scheurgereedschap en dompel deze onder in vijf tot 10 milliliter kleuroplossing.Na een tot 24 uur, verwijder de overtollige vlek en dompel de gel onder in water. Maak vervolgens een foto van de gel met behulp van een gel imager. Om de eiwitstructuur voor te bereiden, laadt u het eiwit PDB-bestand in MOE.Klik op Selecteren en oplosmiddel en verwijder het oplosmiddel. Open het deelvenster Structuur pPreparatie op de bovenste menubalk van Compute en corrigeer automatisch alle structurele items door op Correct te klikken. Protonate de structuur door te klikken op Protonate 3D.Voeg gedeeltelijke ladingen toe aan het eiwit door het paneel Gedeeltelijke ladingen te openen en AMBER 99 te selecteren en waterstof en eenzame paren aan te passen zoals vereist. Sla vervolgens het structuurbestand op. Als u de structuur voor het substraat peptiden en TRIM14 wilt bouwen, opent u het Protein Builder-paneel, voert u de substraatsequentie in en selecteert u Auto Repack.Stel vervolgens Geometrie in als Verlengd en klik op Bouwen. Minimaliseer ten slotte de structuur en sla deze op als een PDB-bestand. Dok de substraatpeptiden aan op VEEV-nsP2 met PyRx AudoDock 4.2-software.Laad het eiwit, klik met de rechtermuisknop op de naam en selecteer Macromolecule maken om het PDBQT-dockingbestand voor te bereiden. Laad vervolgens het substraatmolecuul en selecteer Maak Ligand om het ligand docking-bestand voor te bereiden. Start de wizard AutoDock op het dockingpaneel onderaan en selecteer de voorbereide ligand- en eiwitbestanden.Definieer de eiwitbindende zak door de rasterafmeting handmatig aan te passen en vervolgens AuotGrid uit te voeren. Voer vervolgens AutoDock uit en selecteer de Lamarckiaanse genetische algoritmemethode. Klik op Docking parameters en stel het aantal GA-runs in op 50 en klik op Doorsturen om de dockingrun te starten.Wanneer AutoDock is voltooid, opent u het deelvenster Resultaten analyseren en inspecteer u alle voorspelde bindingsposes. Selecteer het beste model met de laagst voorspelde bindingsenergie en redelijke bindende interacties tussen de cis-477 en het substraat op de decolletésite en sla het op als een PDB-bestand voor verdere MD-simulaties. Na het lezen van de bindingsposes met AutoDock is het belangrijk om post-docking analyse uit te voeren om het plausibele bindingsmodel voor verfijning te identificeren met MD-simulaties.Dit protocol werd gebruikt om korte stukken van homologe gastheer-pathogene eiwitopeenvolgingen of SSHHPS in het Zika virus ns2B/3 protease te vinden. Er werden vier gastheer-eiwitdoelen geïdentificeerd. FOXGS, SFRP1, een Gsalpha subunit uit een retinale cDNA bibliotheek, en de NT5M mitochondriale 5'3'nucleotidase.Sequentie uitlijningen van de SSHHPS toegestaan soort-specifieke verschillen in de decolleté site sequenties. De SFRP1-sequentie was identiek bij mensen en kippen, wat opmerkelijk is omdat het Zika-virus mortaliteit en microcefalie in kippenembryo's kan veroorzaken. De continue test werd gebruikt om steady state kinetische parameters en remmingsconstanten voor de virale polyproteïne sequenties te meten en de discontinu test werd gebruikt om kwalitatieve decolleté-informatie te verkrijgen, zoals decolleté van een bepaalde sequentie of de remming van de protease door verschillende verbindingen.Een model van de Venezolaanse paardenencefalitis nsP1-nsP2 knooppunt werd gemaakt met behulp van silico methoden. Voor de nsP2 protease, verlenging van het substraat sequentie en het verminderen van de ionische sterkte van de buffer leidde tot een aanzienlijke vermindering van de Michaelis constante van decollete van een Semliki Forest virus sequentie. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de besturingselementen uit te voeren.Substraten die de virale protease decolletésitesequenties bevatten, moeten worden getest voordat ze verder gaan met SSHHPS-sequentieanalyse. Als het decolleté van een gastheereiwit wordt waargenomen, moeten vervolgexperimenten worden uitgevoerd om te bevestigen dat dat gastheereiwit virale replicatie beïnvloedt. Dit kan worden gedaan door het eiwit uit te uitdrukking of uit te kuilen en vervolgens de effecten op virale replicatie te onderzoeken.Groep IV bevat een groot aantal nieuwe en opkomende ziekteverwekkers. De SSHHPS sequenties koppelen specifieke gastheereiwitten en -paden op een zeer voorspelbare manier aan de virale proteases.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kwantitatief<em&gt; In vitro</em&gt; Assay om neutrofieladhesie Maatregel om Activated primaire humane microvasculaire endotheelcellen onder statische omstandigheden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor<em&gt; Burkholderia</em&gt; Soorten

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methoden voor het vergelijken van Target Binding en CDC Inductie Tussen Therapeutische Antilichamen: Toepassingen in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternatieve In Vitro methoden voor de bepaling van de structurele integriteit van virale Eiwitmantel

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detectie van lage exemplaar nummer geïntegreerde viraal DNA gevormd door In Vitro Hepatitis B-infectie

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...