Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den Projektnummern CB-SEED-SEED09-2-0061 und CBCall4-CBM-05-2-0019 und teilweise vom Intramural/Extramural-Forschungsprogramm der Basisfonds NCATS, NIH (XH) und Naval Research Laboratory unterstützt.

Die hier zum Ausdruck gebrachten Meinungen sind die der Autoren und repräsentieren nicht die der U. S. Navy, der U. S. Army, des U. S. Department of Defense oder der US-Regierung.

Die sequenzspezifische Zerstörung eines Proteins oder einer Nukleinsäure, die von einer fremden Sequenz geleitet wird, ist nur in wenigen Fällen in der Biologie zu beobachten. Die in Abbildung 1 dargestellten Mechanismen sind Abwehrmechanismen, die einen Host vor einem Virus oder einen Virus von einem Host schützen.
Mit bioinformatischen Methoden können wir die Ziele identifizieren, die durch diese Systeme zerstört werden. In unseren Analysen von SSHHP-Sequenzen entdeckten wir, dass viele von ihnen in Proteinen gefunden werden konnten, die benötigt werden, um angeborene Immunantworten zu erzeugen. Einige hatten offensichtliche Rollen wie MAVS und TRIF (TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-'), während andere mit Immunität durch komplexere Mechanismen (z.B. Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9zusammenhängen. Die in der SSHHP-Sequenz gespeicherten Zielinformationen haben das Potenzial, Wege zu identifizieren, die antivirale Auswirkungen gegen diese Viren haben. Antivirale Reaktionen in vivo sind oft virusspezifisch26,43. Zum Beispiel haben Teilmengen von TRIM-Proteinen antivirale Wirkungen auf verschiedene Viren43,44,45, einige sind virale Restriktionsfaktoren (z. B. HIV und TRIM5). Die Spezifität von TRIM-Proteinen (70 wurden identifiziert) wird noch untersucht44,45. Die Informationen innerhalb von SSHHPS können zu unserem Verständnis beitragen, wie diese Viren den angeborenen Immunreaktionen entgehen. Andere Muster und Korrelationen können aufgedeckt werden, wenn mehr SSHHPS untersucht werden.
In unseren Analysen zeigten sich artspezifische Unterschiede (Abbildung 2, Abbildung 10). Es ist bekannt, dass diese Viren einige Arten stärker betreffen als andere. Informationen über Hostbereich, Hostanfälligkeit und Hostverteidigung können in SSHHPS vorhanden sein. Zum Beispiel fehlte Pferde, der anfälligsten Art für Pferdeenzephalitisviren, die Region des menschlichen TRIM14, die vorübergehend von der VEEV nsP2 Protease geschnitten wurde. Menschen sterben selten an VEEV-Infektionen, können aber infiziert werden24. Das humane TRIM14-Protein trug eine nsP2-Proteasespaltungssequenz6. Das Vorhandensein der Spaltungsstelle deutet darauf hin, dass Menschen einen Abwehrmechanismus gegen diese Viren haben. Vögel wurden als potenzielle Reservoirs dieser Viren gedacht46. Die entsprechende SSHHP-Sequenz im TRIM14-Protein von Hühnern unterschied sich von den Sequenzen, die beim Menschen und anderen Arten gefunden wurden. Subtile Unterschiede wie diese können ein Ziel-Wirt-Protein uncleavable oder leichter spalten. Aguirre et al.16 zeigten, dass ein onkelwältbar esmutiertes STRING-Protein nach der Dengue-Virusinfektion höhere IFN-Konzentrationen induzierte und dass Mäuse natürlicherweise eine Version von STING tragen, die nicht von der Dengue ns2B3 Protease geschnitten wird. Das murine STING-Protein wurde von der ZIKV-Protease47nicht geschnitten. In unserer SSHHPS-Analyse beobachteten wir auch Unterschiede in den ZIKV-Proteasespaltungs-Standortsequenzen, wenn wir die menschlichen Proteine mit denen von Nagetieren verglichen6 (Abbildung 10D). Die Reproduktion der artspezifischen proteolytischen Spaltungen von Wirtsproteinen kann in Tiermodellen, die für Viren der Gruppe IV verwendet werden, von Bedeutung sein. Die Hemmung der Dekolleté-Spaltung des Wirtsproteins hat auch Auswirkungen auf die Entwicklung von Proteasehemmern der Gruppe IV. In unserer vorherigen Publikation haben wir gezeigt, dass wir trim14 Spaltung durch die VEEV nsP2 Protease mit CA074 Methylester6hemmen können. Dieses Ergebnis legt nahe, dass kleine Molekülinhibitoren dieser Proteasen in der Lage sein könnten, die angeborenen Immunantworten zu modulieren, die in der Lage sind, die Infektion zu unterdrücken6,31.
Genetische Variation innerhalb einer Art hat auch das Potenzial, Unterschiede in der proteolytischen Spaltung zu produzieren. Subtile Unterschiede in der Codon-Nutzung könnten ribosome Pausieren48beeinflussen. Da einige virale Proteasen der Gruppe IV in die ER-Membran eingebettet sind, können Unterschiede in diesen Pausen die Spaltung eines Ziels beeinflussen, wenn die Spaltung ko-translational auftritt. Einige der von uns identifizierten Spaltungsstellen befanden sich in vorhergesagten Signalpeptidsequenzen (z. B. SFRP1), während andere intern waren.
Die SSHHPS-Analyse kann Informationen liefern, die sich von anderen Methoden der Wirtsproteinanalyse unterscheiden. Die SSHHPS-Analyse war kostengünstig und einfach zu verwenden. Die Verwendung eines bakteriellen Expressionssystems ermöglichte das Testen von kurzen Segmenten (25 Aminosäuren) von Säugetiersequenzen ohne die Verwendung von Säugetierzellkultur. Wir fanden heraus, dass die CFP-YFP-Substrate in der Lage waren, alle getesteten menschlichen Proteinsequenzen zu tolerieren; die Erträge jedoch unterschiedlich. In ähnlichen Assays wurden Substrate, die menschliche Proteinsequenzen enthalten, solange 63 Aminosäuren erfolgreich exprimiert, gereinigt und für kinetische Analysen und Inhibitor-Screening49,50,51verwendet. Da für den diskontinuierlichen Assay nur geringe Mengen des Substrats benötigt werden, kann eine große Anzahl von Zielen untersucht werden. Ein Vorteil des Systems ist, dass die CFP/YFP-Substrate für SDS-PAGE-Analysen und für aufwendigere kinetische Analysen (z.B. IC50, Ki, Km, Vmax)verwendet werden können. Für die Entdeckung von Arzneimitteln können hemmende Verbindungen Artefakte in fluoreszierenden Assays produzieren. So ermöglicht der diskontinuierliche Assay in Kombination mit einem kontinuierlichen Assay, die Spaltung oder Hemmung der Spaltung zu bestätigen. Die Proben für den diskontinuierlichen SDS-PAGE-Assay können direkt aus den 96-Well-Platten entnommen werden. CFP/YFP-Substrate wurden für das Screening von Verbundbibliotheken52verwendet. Es sind jedoch zusätzliche Analysen erforderlich, um festzustellen, ob ein Substrat für ein Hochdurchsatzscreening geeignet ist, wie z.B. die Berechnung eines Z-Faktors53.
Eine Herausforderung bei der Gestaltung eines Substrats besteht darin, die Region um die sissile Bindung zu identifizieren, die von der Protease gebunden und erkannt wird. In den hier gezeigten Beispielen begannen wir mit 12 Rückstandssequenzen, die um die sissile Bindung zentriert waren. Nach der Analyse der Sequenzausrichtungen der Spaltungsstellen wurde für die VEEV-Protease eine Homologie zu den Rückständen gefunden, N-Terminal der Sissile-Bindung, während für die ZIKV-Proteasehomologie mehrere der C-Terminal-Rückstände gefunden wurden. Ein in silico Modell des angedockten Substrats kann verwendet werden, um standortgesteuerte Mutageneseexperimente zu entwerfen, die die Bindungsstellen des Substrats untersuchen. Da sich die Substrat- und Enzymsequenzen auf Plasmiden befinden, können entweder die in silico-Modelle oder die Subsite-Toleranzen mutiert werden. Dies kann von Vorteil sein, wenn eine Kristallstruktur des gebundenen Substrats nicht verfügbar ist.
Die SSHHPS-Analyse kann auch neue Informationen über die Mechanismen liefern, mit denen virusinduzierte Phänotypen durch virale Enzyme erzeugt werden. Eines der ZIKV-Ziele, SFRP1, ist Teil des Wnt-Signalwegs und hat Rollen sowohl in der Gehirn- und Augenentwicklung als auch in den Immunantworten36,37,54,55,56,57. Wir fanden heraus, dass die anderen Proteinsequenzen, die durch die ZIKV ns2B/ns3 Protease geschnitten werden konnten, auch in Proteinen an der Entwicklung von Gehirn und Auge beteiligt waren; Anomalien in beiden wurden beim angeborenen Zika-Syndrom beobachtet und gelten als Teil des virusinduzierten Phänotyps58.
Die Vorhersehbarkeit von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen könnte für eine Vielzahl von Anwendungen genutzt werden: zielspezifische onkolytische virale Therapien; Entrisiko von Impfstoffen gegen lebende Viren; Verfeinerung, Vorhersage oder Auswahl von Tiermodellen; Vorhersage des Wirtsbereichs oder der Anfälligkeit; Vorhersage von Zoonose-Ereignissen; und Vorhersage der Host-Verteidigung. Da die beschriebenen Methoden sequenzbasiert sind, können sie von Nutzen sein, um sie in Zukunft in Software zu integrieren.

Beweise für einen horizontalen Gentransfer vom Virus zum Wirt oder wirt zu Virus, können in einer Vielzahl von Genomengefundenwerden 1,2,3,4. Beispiele für virale Endogenisation sind die CRISPR-Abstandssequenzen, die in bakteriellen Wirtsgenomen gefunden werden4. Kürzlich haben wir Hinweise auf Wirtsproteinsequenzen gefunden, die in die nichtstrukturellen Polyproteine von (+)ssRNA Group IV-Viren eingebettet sind. Diese Sequenzen innerhalb der kodierenden Bereiche des viralen Genoms können generationell vermehrt werden. Die kurzen Strecken homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen (SSHHPS) finden sich im Virus und Wirt5,6. SSHHPS sind die konservierten Spalt-Standort-Motivsequenzen, die von viralen Proteasen erkannt werden, die Homologie zu bestimmten Wirtsproteinen haben. Diese Sequenzen leiten die Zerstörung bestimmter Wirtsproteine.
In unserer vorherigen Publikation6haben wir eine Liste aller Wirtsproteine zusammengestellt, die von viralen Proteasen angegriffen wurden, und festgestellt, dass die Liste der Ziele nicht zufällig war (Tabelle 1). Zwei Trends waren offensichtlich. Erstens gehörte die Mehrheit der viralen Proteasen, die Wirtsproteine schneiden, zu Denkowerviren der Gruppe IV (24 von 25 Fällen betrafen virale Proteasen der Gruppe IV), und eine Protease gehörte zur (+)ssRNA-Gruppe VI-Retroviren (HIV, Human Immunodeficiency Virus)7. Zweitens waren die Wirtsproteinziele, die von den viralen Proteasen geschnitten wurden, im Allgemeinen an der Generierung der angeborenen Immunantworten beteiligt, was darauf hindeutet, dass die Spaltungen dazu bestimmt waren, die Immunantworten des Wirts zu verankern. Die Hälfte der von den viralen Proteasen ins Visier genommenen Wirtsproteine waren bekannte Bestandteile von Signalkaskaden, die Interferon (IFN) und proinflammatorische Zytokine erzeugen (Tabelle 1). Andere waren an der Hostzellentranskription8,9,10 oder Translation11beteiligt. Interessanterweise haben Shmakov et al.4 gezeigt, dass viele CRISPR Protospacer-Sequenzen Genen entsprechen, die an Derplasmakonjugation oder Replikation beteiligt sind4.
Gruppe IV umfasst unter anderem Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae und Togaviridae. Mehrere neue und neu auftretende Krankheitserreger gehören zur Gruppe IV wie das Zika-Virus (ZIKV), West-Nil (WNV), Chikungunya (CHIKV), das schwere akute Atemwegssyndrom (SARS) und das Atemwegssyndrom -virus (MERS) im Nahen Osten. Das (+)ssRNA-Genom ist im Wesentlichen ein Stück mRNA. Um die für die Genomreplikation notwendigen Enzyme zu produzieren, muss zunächst das (+)ssRNA-Genom übersetzt werden. Bei Alphaviren und anderen Viren der Gruppe IV werden die für die Replikation notwendigen Enzyme in einem einzigen Polyprotein (d. h. nsP1234 für VEEV) hergestellt. Das nichtstrukturelle Polyprotein (nsP) wird proteolytisch verarbeitet (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) durch die nsP2-Protease zur Herstellung aktiver Enzyme12 (Abbildung 1). Die Spaltung des Polyproteins durch die nsP2-Protease ist für die Virusreplikation unerlässlich; Dies wurde durch Deletion und standortgesteuerte Mutagenese der aktiven Stelle Cystein der nsP2-Protease13,14demonstriert. Insbesondere die Translation viraler Proteine geht genomischen Replikationsereignissen voraus. Beispielsweise enthält nsP4 die RNA-abhängige RNA-Polymerase, die zur Replikation des (+)ssRNA-Genoms erforderlich ist. Die Genomreplikation kann dsRNA-Zwischenprodukte erzeugen; Diese Zwischenprodukte können die angeborenen Immunreaktionen des Wirts auslösen. So können diese Viren Wirt angeborene Immunantwort Proteine früh in der Infektion spalten, um ihre Wirkung zu unterdrücken15,16,17.
Silencing kann auf der Ebene von DNA, RNA und Protein auftreten. Was jedem der in Abbildung 1 gezeigten Silencing-Mechanismen gemeinsam ist, ist, dass kurze fremde DNA-, RNA- oder Proteinsequenzen verwendet werden, um die Zerstörung bestimmter Ziele zu steuern, um ihre Funktion zu veranschlagen. Die Silencing-Mechanismen sind analog zu "Suchen und Löschen" von Programmen, die in drei verschiedenen Sprachen geschrieben wurden. Die kurze Spaltungs-Site-Sequenz ist analog zu einem "Schlüsselwort". Jedes Programm hat ein Enzym, das die Übereinstimmung zwischen der kurzen Sequenz (das "Schlüsselwort") und einem Wort in der "Datei" erkennt, das gelöscht werden soll. Sobald eine Übereinstimmung gefunden ist, schneidet das Enzym die größere Zielsequenz ("löscht"). Die drei in Abbildung 1 gezeigten Mechanismen werden verwendet, um den Wirt vor Viren zu schützen oder um ein Virus vor dem Immunsystem eines Hosts zu schützen.
Virale Proteasen erkennen kurze Spalt-Standort-Motivsequenzen zwischen 2-11 Aminosäuren; in Nukleotiden würde dies 6-33 Basen entsprechen. Zum Vergleich: CrispR-Abstandssequenzen sind Nukleotide von 26-72 und RNAi sind Nukleotide18,19. Obwohl diese Sequenzen relativ kurz sind, können sie spezifisch erkannt werden. Angesichts der höheren Vielfalt an Aminosäuren ist die Wahrscheinlichkeit eines zufälligen Spaltungsereignisses für eine virale Protease, die Proteinsequenzen von 6-8 Aminosäuren oder länger erkennt, relativ gering. Die Vorhersage von SSHHPS in Wirtsproteinen wird weitgehend von der Spezifität der untersuchten viralen Protease abhängen. Wenn die Protease strenge Sequenzspezifitätsanforderungen hat, beträgt die Wahrscheinlichkeit, eine Spaltungs-Standortsequenz zu finden, 1/206 = 1 in 64 Millionen oder 1/208 = 1 in 25,6 Milliarden; Die meisten Proteasen weisen jedoch variable Untersitetoleranzen auf (z. B. können R oder K am Standort S1 toleriert werden). Folglich ist keine Sequenzidentität zwischen den Sequenzen, die auf dem Host gefunden werden, und dem Virus erforderlich. Bei viralen Proteasen, die lockerere Sequenzanforderungen haben (z. B. bei Picornaviridae), kann die Wahrscheinlichkeit, eine Spaltungsstelle in einem Wirtsprotein zu finden, höher sein. Viele der Einträge in Tabelle 1 stammen aus der Familie der Picornaviridae.
Schechter & Berger Notation20 wird häufig verwendet, um die Rückstände in einem Proteasesubstrat und die Untersits, an die sie binden, zu beschreiben, verwenden wir diese Notation durchgehend. Die Rückstände im Substrat, die N-Terminal der Sissile-Bindung sind, werden als P3-P2-P1 bezeichnet, während die Rückstände, die C-Terminal sind, als P1'-P2'-P3' bezeichnet werden. Die entsprechenden Untersiten in der Protease, die diese Aminosäurerückstände binden, sind S3-S2-S1 bzw. S1'-S2'-S3'.
Um zu bestimmen, welche Wirtsproteine ins Visier genommen werden, können wir SSHHPS in den viralen Polyproteinspaltungsstellen identifizieren und nach den Wirtsproteinen suchen, die sie enthalten. Hierin skizzieren wir Verfahren zur Identifizierung von SSHHPS mit bekannten viralen Proteasespaltungs-Site-Sequenzen. Die bioinformatischen Methoden, Protease-Assays und in silico-Methoden sollen in Verbindung mit zellbasierten Assays verwendet werden.
Sequenzausrichtungen der Wirtsproteine, die von viralen Proteasen angegriffen werden, haben artspezifische Unterschiede innerhalb dieser kurzen Spalt-Standortsequenzen aufgedeckt. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass das venezolanische Pferdeenzephalitisvirus (VEEV) nsP2-Protease das menschliche TRIM14, ein dreigliedriges Motiv (TRIM) Protein6, schneidet. Einige TRIM-Proteine sind virale Restriktionsfaktoren (z.B. TRIM5-21), die meisten gelten vermutlich als Ubiquitin E3-Ligasen. TRIM14 verfügt nicht über eine RING-Domain (wirklich interessantes neues Gen) und wird nicht als E3-Ligase22angesehen. TRIM14 wurde als Adapter in der mitochondrialen antiviralen Signalososome (MAVS)22vorgeschlagen, kann aber andere antivirale Funktionen haben23. Die Ausrichtung der TRIM14-Sequenzen verschiedener Arten zeigt, dass Pferde nicht die Spaltungsstelle haben und eine abgeschnittene Version von TRIM14 beherbergen, die die C-Terminal PRY/SPRY-Domäne vermisst. Diese Domäne enthält eine Polyubiquitinationsstelle (Abbildung 2). Bei Pferden sind diese Viren hochgradig tödlich (20-80% Mortalität), während beim Menschen nur 1% an VEEV-Infektionen sterben24. Die Cleavage der PRY/SPRY-Domäne kann die MAVS-Signalkaskade vorübergehend kurzschließen. Diese Kaskade kann durch dsRNA ausgelöst werden und führt zur Produktion von Interferon und pro-inflammatorischen Zytokinen. Daher kann das Vorhandensein der SSHHPS nützlich sein, um vorherzusagen, welche Arten Abwehrsysteme gegen bestimmte Viren der Gruppe IV haben.
In der Gruppe IV viren werden IFN-Antagonismusmechanismen als multipliziert redundant25angenommen. Die Dekolleté des Wirtskann während der Infektion vorübergehend sein und die Konzentrationen können sich im Laufe der Zeit erholen. Wir fanden in Zellen, dass TRIM14-Spaltungsprodukte sehr früh nach Transfektion (6 h) mit einem Plasmid nachgewiesen werden konnten, das die Protease (Cytomegalievirus-Promotor) kodiert. Länger wurden die Spaltprodukte jedoch nicht nachgewiesen. In virusinfizierten Zellen war die Kinetik unterschiedlich und Spaltprodukte konnten zwischen 6-48 h6nachgewiesen werden. Andere haben das Auftreten von Wirtprotein-Spaltungsprodukte bereits 3-6 h nach der Infektion9,11berichtet.
Proteolytische Aktivität in Zellen ist oft schwer zu fangen; die Spaltprodukte können in ihrer Löslichkeit, Konzentration, Stabilität und Lebensdauer variieren. In zellbasierten Assays kann nicht davon ausgegangen werden, dass sich Spaltprodukte in einer Zelle ansammeln oder dass die Bandintensitäten von geschnittenem und ungeschnittenem Protein kompensatorische Zu- und Abnahmen aufweisen, da das geschnittene Protein sehr schnell abgebaut werden kann und möglicherweise nicht in einem westlichen Fleck bei einem erwarteten Molekulargewicht (MW) nachweisbar ist (z. B. könnte die Region, die das Epitop enthält, von anderen Wirtsproteasen geklammert werden oder ubiiniert werden könnten). Wenn das Substrat der viralen Protease ein angeborenes Immunantwortprotein ist, kann seine Konzentration während der Infektion variieren. Zum Beispiel sind einige angeborene Immunantwortproteine vor einer Virusinfektion vorhanden und werden durch Interferon26weiter induziert. Die Konzentration des Zielproteins kann daher während der Infektion schwanken, und der Vergleich von nicht infizierten vs. infizierten Zelllysaten kann schwer zu interpretieren sein. Darüber hinaus dürfen nicht alle Zellen gleichmäßig transfiziert oder infiziert sein. In-vitro-Protease-Assays mit gereinigten Proteinen aus E. coli haben dagegen weniger Variablen, für die sie zu kontrollieren sind, und solche Assays können mit SDS-PAGE statt mit Immunoblots durchgeführt werden. Kontaminierende Proteasen können in den frühen Schritten der Proteinreinigung des CFP/YFP-Substrats gehemmt werden, und mutierte virale Proteasen können gereinigt und als Kontrollen getestet werden, um festzustellen, ob die Spaltung auf die virale Protease oder eine kontaminierende bakterielle Protease zurückzuführen ist.
Eine Einschränkung der In-vitro-Protease-Assays ist, dass ihnen die Komplexität einer Säugetierzelle fehlt. Damit ein Enzym sein Substrat schneidet, müssen die beiden kolokalisiert sein. Virale Proteasen der Gruppe IV unterscheiden sich in Struktur und Lokalisierung. Zum Beispiel ist die ZIKV-Protease in die endoplasmatische Retikulum -Membran (ER) eingebettet und steht dem Zytosol gegenüber, während die VEEV nsP2-Protease ein lösliches Protein im Zytoplasma und Kern27ist. Einige der in der ZIKV-SSHHPS-Analyse gefundenen Spaltungs-Standortsequenzen waren in Signalpeptiden, die darauf hindeuten, dass Spaltung für einige Ziele ko-translational auftreten könnte. Daher muss bei diesen Analysen auch die Lage der Protease und des Substrats in der Zelle berücksichtigt werden.
Zellbasierte Assays können wertvoll sein, um eine Rolle für das identifizierte Wirtsprotein(e) bei Infektionen zu etablieren. Methoden, die darauf abzielen, die virale Proteasespaltung von Wirtsproteinen zu stoppen, wie die Zugabe eines Proteasehemmers6 oder eine Mutation im Wirtsziel16, können verwendet werden, um ihre Auswirkungen auf die Virusreplikation zu untersuchen. Eine Überexpression des Zielproteins kann auch die Virusreplikation beeinträchtigen28. Plaque-Assays oder andere Methoden können verwendet werden, um die Virusreplikation zu quantifizieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

Alphavirale Enzyme werden in einem einzigen Polypeptid synthetisiert. Das nichtstrukturelle Polyprotein (nsP) wird von seiner nsP2-Cysteinprotease verarbeitet, um aktive Enzyme zu produzieren, die für die Virusreplikation unerlässlich sind. Virale Proteasen sind hochspezifisch und erkennen konservierte Spalt-Standort-Motivsequenzen (ca. 6-8 Aminosäuren). In mehreren Virusarten der Gruppe IV finden sich die Motivsequenzen der nsP-Protease(s) In bestimmten Wirtsproteinen, die an der Erzeugung der angeborenen Immunantworten beteiligt sind, und in einigen Fällen scheinen die zielgerichteten Proteine mit dem virusinduzierten Phänotyp in Verbindung zu stehen. Diese Viren nutzen kurze Strecken homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen (SSHHPS) zur gezielten Zerstörung von Wirtsproteinen. Zur Identifizierung von SSHHPS können die viralen Proteasespaltungs-Standort-Motivsequenzen in BLAST eingegeben und die Wirtsgenome durchsucht werden. Cleavage kann zunächst mit den gereinigten nsP-Virusprotease- und Fluoreszenzresonanz-Energieübertragungssubstraten (FRET) aus E. coligetestet werden. Die FRET-Substrate enthalten Cyan- und Gelbfluoreszenzprotein und die Spaltungs-Standortsequenz (CFP-Sequenz-YFP). Dieser Protease-Assay kann kontinuierlich in einem Plattenleser oder diskontinuierlich in SDS-PAGE Gelen eingesetzt werden. Modelle der gebundenen Peptidsubstrate können in Silico erzeugt werden, um Substratauswahl- und Mutagenesestudien zu leiten. GFP/YFP-Substrate wurden auch verwendet, um Proteasehemmer zu identifizieren. Diese In-vitro- und Silico-Methoden können in Kombination mit zellbasierten Assays verwendet werden, um festzustellen, ob das Ziel-Wirtsprotein die Virusreplikation beeinflusst.

Die SSHHPS-Analyse der ZIKV ns2B/3-Protease identifizierte 4 Wirtproteinziele: FOXG1, SFRP1, eine G s-Alpha-Untereinheit aus einer retinalen cDNA-Bibliothek und die NT5M-Mitochondrial-5',3'-Nukleotidase (Abbildung 10)6. Bemerkenswert ist, dass keine andere Methode diese Proteine als potenzielle Ziele der ZIKV-Protease vorhersagte. Mutationen im FOXG1-Gen wurden mit einem angeborenen Syndrom in Verbindung gebracht, das durch eine eingeschränkte Entwicklung und strukturelle Hirnanomalien wie Mikrozephalie gekennzeichnet ist. SFRP1 ist ein abgesondertes Frizzled-protein (SFRP); Diese löslichen Rezeptoren können Wnt-Liganden wettbewerbsfähig binden, um die Wnt-Signalisierung zu antagonisieren und zu hemmen. Der Wnt-Signalweg ist an der Regulierung der IFN-Reaktion während der Flavivirus-Infektionbeteiligt 36. Die Spaltung von SFRP1 würde erwartet, um die Flavivirus-Replikation zu verbessern. SFRP1 ist auch an der Th17-Zelldifferenzierung37beteiligt. Sequenzausrichtungen des SSHHPS zeigten artspezifische Unterschiede in den Spalt-Standortsequenzen (Abbildung 10D). Die Spaltungs-Standortsequenz in SFRP1 war bei Menschen und Hühnern identisch; ZIKV kann Mortalität und Mikrozephalie bei Hühnerembryonen induzieren38. Bei Nagetieren wird der hochkonservierte P1-Rückstand (K/R)R-G durch ein Glycin (RGG) ersetzt. Immunkompetente Stämme von Mäusen sind in der Regel resistent gegen ZIKV-Infektion und Krankheit39.
Stetige Zustandskinetische Parameter und Hemmungskonstanten können für die viralen Polyproteinsequenzen und für die Wirtsproteinsequenzen mit dem kontinuierlichen Assay in einem Plattenleser31,40,41 ( Abbildung11A) gemessen werden. Für qualitative Spaltungsinformationen, wie z.B. Spaltung einer bestimmten Sequenz oder die Hemmung der Protease durch verschiedene Verbindungen, kann der diskontinuierliche Assay verwendet werden (Abbildung 11B).
Es kann eine Optimierung der Anzahl der Rückstände zwischen GFP und YFP erforderlich sein. Ein substratgebundenes Modell kann mit den in silico-Methoden hergestellt werden. Abbildung 9zeigt ein repräsentatives dockiertes Modell der nsP1/nsP2-Kreuzung . Für die VEEV nsP2-Protease wurde eine Spaltung einer 12-Aminosäure-Sequenz semliki Forest Virus (SFV) berichtet (Km = 0,58 mM)33. Die Verlängerung der Substratsequenz auf 19, 22 und 25 Rückstände und die Verringerung der Ionenstärke des Puffers führten zu einer signifikanten Reduktion von Km. Die Untersuchung der VEEV nsP2 Kristallstruktur und Kristallverpackung zeigte auch, dass ein Teil einer der Knoten gegen die Protease-Domäne verpackt war und helical war. So können die längeren VEEV-Substrate durch die Erkennung eines sekundären Strukturmotivs besser binden.
Für TRIM14 haben wir ein Km = 21 m6,33erhalten. Das Km für das Substrat, das die Wirtsproteinsequenz trägt, war vergleichbar mit den Km-Werten der Substrate, die die viralen Polyproteinspaltungs-Standortsequenzen (Km(V12) = 12 m und Km(V34) = 21 m enthalten. Die Spalten-Standortsequenzen an den Knoten nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 und nsP3/nsP4 wurden mit unterschiedlichen Effizienzen geschnitten. In der Zelle wird gedacht, dass dies eine sequenzielle Spaltung des Polyproteins42ermöglicht.
Bei der Interpretation negativer Ergebnisse ist Vorsicht geboten. Wenn keine Spaltung auftritt, kann die Spaltstelle zu kurz oder die gereinigte Protease inaktiv sein. Für Substrate, die geschnitten werden, sind zusätzliche Experimente erforderlich, um die Spaltung des Voll-Proteins oder die Spaltung in virusinfizierten Zellen zu bestätigen. Es sollten geeignete Folgeexperimente ausgewählt werden. Die Auswirkungen von Überexpression oder Silencing des Zielproteins auf die Virusreplikation können ebenfalls getestet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Abbildung 1: Drei Mechanismen des Silencings. Silencing kann auf der Ebene von DNA, RNA oder Protein auftreten. Diese "Suchen und Löschen" Algorithmen verwenden jeweils ein "Schlüsselwort", um die Spaltung einer Datei, die das Wort enthält, zu lenken. Diese Zahl wurde von Morazzani et al.32 und den darin enthaltenen Referenzen geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Abbildung 2: Artenspezifische Unterschiede in Spalt-Standortsequenzen. Die C-Terminal PRY/SPRY-Domänen der TRIM14-Homologe werden in der Ausrichtung dargestellt. Die PRY/SPRY-Domäne kann durch die konservierten Motive identifiziert werden, die grau hervorgehoben sind. Human TRIM14 wird bei QEAGA-G von der VEEV nsP2 Cystein-Protease geschnitten. Die SSHHP-Sequenz wird in Farbe angezeigt. Der Rückstand in Grün ist der Rückstand von P1; in blau ist der P4-Rückstand, und in Rot sind andere konservierte Rückstände innerhalb der Spaltstellen-Motivsequenz. Equine beherbergen eine abgeschnittene Version von TRIM14, die nicht die PRY/SPRY-Domain hat. Das in Cyan hervorgehobene Lysin ist polyubiquitiniert und wichtig für die Montage des MAVS-Signalossomens. Die C-terminale PRY/SPRY-Domäne kann vorübergehend durch die nsP2-Protease geschnitten werden, um die antivirale Reaktion des Wirts intrazellulär während einer akuten Virusinfektion zu beeinträchtigen. Bei Pferden ist diese Domäne immer nicht vorhanden. Dies deutet darauf hin, dass die PRY/SPRY-Domäne von TRIM14 eine Schutzfunktion gegen VEEV-Infektionen haben kann. Diese Figur wurde von Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank"></a> reproduziert.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Abbildung 3: SSHHPS-Identifikation mit BLAST. Die Spalt-Standort-Motivsequenz am VEEV nsP1/nsP2-Knoten ist an der SSHHP-Sequenz im Wirtsprotein TRIM14 ausgerichtet. Der grün gefärbte Rückstand ist der Rückstand von P1; in blau ist der P4-Rückstand und in rot weitere konservierte Rückstände der Spalt-Standort-Motivsequenz. Die meisten Achsen enthielten Homologie n. Außerhalb des konservierten Spaltstellenmotivs oder enthielten nicht die sissile Bindungsrückstände von P1/P1. TRIM14 zeigte eine Übereinstimmung mit 6 Rückständen in sequenzieller Reihenfolge, die P1 und P1' enthielten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Abbildung 4: Protein- und DNA-Sequenzen des CFP-V12-YFP-Substrats für die VEEV nsP2-Cysteinprotease. Die Beschränkungsstandorte NdeI (CATATG) und XhoI (CTCGAG) werden in Großbuchstaben dargestellt. In rot ist die Spaltungs-Standortsequenz aus dem viralen Polyprotein, das sich zwischen nsP1 und nsP2 befindet. Der Rückstand in Grün ist der Rückstand p1 und in blau der P4-Rückstand der Spaltungsstelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Abbildung 5: Proteinsequenz des Trx-VEEV-nsP2-Cystein-Proteasekonstrukts. Thioredoxin (Trx) ist gelb dargestellt. Die Thrombin-Spaltungsstelle und sein His-Tag werden in Cyan dargestellt. Die Cys-His Dyade sind rot beschriftet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Abbildung 6: Peptidstrukturen in MOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Abbildung 7: Andocken von Substratpeptid mit PyRx/AutoDock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Abbildung 8: Aufträge, die im Biowulf-Cluster ausgeführt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Abbildung 9: Modell des VEEV P12 Substrats, das die Spaltungs-Standortsequenz an der nsP1/nsP2-Kreuzung enthält. Die Katalyse-Dyade Cys-477/His-546 ist blau dargestellt. Die Abbildung wurde mit Pymol (https://pymol.org) gemacht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Abbildung 10: SSHHPS Analyse des Zika-Virus ns2B/ns3 Protease. (A) Voraussichtliche Wirtproteinziele der ZIKV ns2B/ns3-Protease. Rückstände in Rot entsprechen einer einzelnen Spalt-Standortsequenz. Rückstände in Grün werden an der Unterstelle toleriert und passen Rückstände an anderen Spaltungsstellen ab. SFRP1 hatte die höchste Anzahl identischer Rückstände in aufeinander folgender Reihenfolge. (B) CFP-Substrat-YFP-Proteine (50-60 kDa) wurden exprimiert und gereinigt, die die vorhergesagte SSHHP-Sequenz aus jedem Wirtsprotein (Mensch) enthielten. Die ZIKV-Protease schnitt menschliche FOXG1, SFRP1, NT5M und eine GsAlpha-Untereinheit isoliert aus einer retinalen cDNA-Bibliothek. Die Dekolleté-Produkte sind ca. 28-30 kDa. Die Substratsequenzen sind in Morazzani et al.6 (C) verfügbar, während die ns2B/ns3 Protease SFRP1 schnitt, schnitt sie ihre Homologe (SFRP2 und SFRP4) nicht ab. (D) Die Ausrichtung der Spaltungsgebiete von verschiedenen Tierarten kann bei der Auswahl eines Tiermodells für ein Virus der Gruppe IV nützlich sein. Beachten Sie, dass sich die konservierte R-G-Sequenz zwischen Menschen und Nagetieren in SFRP1 unterscheidet. Abbildung reproduziert von Morazzani et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Abbildung 11: Stetige Zustandskinetik analyse mit den kontinuierlichen und diskontinuierlichen Assays. (A) Die in Tabelle 5 dargestellten kinetischen Daten wurden in GraFit dargestellt. Der Einset zeigt das Lineweaver-Burk-Plot. (B) SDS-PAGE Gel mit den Spaltprodukten des CFP-V12-YFP Substrats. In Spur 1 befindet sich das Substrat "UNCUT" (48 kDa). In Spur 2 befindet sich das Substrat "CUT" (31 kDa und 27 kDa). In den Bahnen wurden 3-9 verschiedene Verbindungen aufgenommen, um ihre hemmende Aktivität zu testen. Lane 4 enthält den kovalenten E64d-Inhibitor. Diese Reaktionen wurden über Nacht für 17 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Kochen der Samples war erforderlich, um das scharfe Banding-Muster zu erreichen. Die nsP2-Protease ist sichtbar (56 kDa) in den Enzym-Haltigen Reaktionen, jedoch nicht in Spur 1. Lane 1 ist die "kein Enzym"-Kontrolle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Wir präsentieren ein allgemeines Protokoll zur Identifizierung kurzer Strecken homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen (SSHHPS), die in das virale Polyprotein eingebettet sind. SSHHPS werden durch virale Proteasen erkannt und leiten die gezielte Zerstörung bestimmter Wirtsproteine durch mehrere Viren der Gruppe IV.

Analyse von viralen SSHHPS der Gruppe IV mit In-vitro- und Silico-Methoden

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Wir haben gezeigt, dass virale Genome der Gruppe IV kurze Strecken von Wirtsproteinsequenzen kodieren. Diese Sequenzen können innerhalb der viralen Protease-Spaltungsstellen gefunden werden. Sie werden für die gezielte Zerstörung von Wirtsproteinen verwendet, in der Regel Proteine, die an der Erzeugung der Immunantworten beteiligt sind.Ein großer Vorteil der Verwendung von Protease-Assays ist, dass es die Komplexität einer Zelle entfernt und zeigt, ob eine virale Protease eine bestimmte Sequenz spalten kann oder nicht. Als wir also Zika SSHHPS-Sequenzen analysierten, fanden wir heraus, dass die Protease Sequenzen in Proteinen schneiden konnte, die an der Erzeugung von Immunreaktionen beteiligt waren, und dass einige dieser Proteine auch Rollen in der Gehirn- und Augenentwicklung spielten. Bei der Durchführung dieser Technik zum ersten Mal, sollte man daran denken, dass, wenn Spaltung nicht beobachtet wird, dass es aufgrund einer Vielzahl von Faktoren wie die Aktivität der Protease sein kann.Demonstriert wird das Verfahren von Jaimee Compton, einem Techniker aus meinem Labor. Beginnen Sie mit dem Öffnen von Protein BLAST und legen Sie die 20 Aminosäuren um die sissile Bindung und das virale Polyprotein und wählen Sie nicht-redundante Proteinsequenzen aus, und geben Sie dann das zu durchsuchende Wirtsgenom ein. Wählen Sie bei Bedarf PHI-BLAST aus und geben Sie eine Mustersequenz ein, in der eckige Klammern darauf hinweisen, dass sich eine der Aminosäuren innerhalb der Klammern an der Ersatzposition befinden kann, und dann auf BLAST drücken.Ordnen Sie die BLAST-Treffer basierend auf der Anzahl der aufeinanderfolgenden identischen oder tolerierten Rückstände an, die einer Spaltungs-Standortsequenz entsprechen. Wählen Sie aus der Liste die Proteine aus, die sechs oder mehr identische oder ähnliche Rückstände enthalten, um sie in den Protease-Assays zu analysieren. Konstruieren Sie ein Plasmid, das das Cyanfluoreszenzprotein, bis zu 25 Aminosäuren der Spaltungssequenz und das gelbe fluoreszierende Protein kodiert.Als nächstes bereiten Sie die CFP- und YFP-Substrate vor, indem Sie vier Vier-Liter-Flaschen mit 25 Millilitern einer Nachtkultur impfen. Schütteln Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius und überwachen Sie das Wachstum stündlich durch UV-Vis-Spektroskopie bei 600 Nanometern. Wenn die Bakterien eine Absorption von etwa einem erreichen, induzieren Sie die Proteinexpression, indem Sie 0,5 Milliliter eines Molaren IPTG zu jedem Kolben hinzufügen, senken Sie dann die Temperatur des Schüttelinkubators auf 17 Grad Celsius und lassen Sie die Expression über Nacht für 17 bis 20 Stunden fortsetzen.Am nächsten Tag pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 7000 mal g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Entfernen und entsorgen Sie die flüssigen Medien, dann speichern Sie die Pellets bei minus 80 Grad Celsius oder fahren Sie mit der Zelllyse fort. Um die Zellen zu lysieren, bereiten Sie 100 Milliliter Lysepuffer nach Manuskriptrichtungen vor, setzen Sie die Pellets im Puffer wieder auf und übertragen Sie 25 bis 25 Milliliter der Suspension in 50 Milliliter Einwegkonische Rohre.Legen Sie die Rohre in einen Kunststoffbecher mit Eiswasser und legen Sie dann die Beschallungsspitze in das Rohr ein, so dass die Spitze etwa einen Zentimeter vom Boden des Rohres entfernt ist, und beschallen Sie das Lysat 10 bis 20 Mal, bis es flüssig und verflüssigt wird. Nach der Beschallung das Lysat auf Hochgeschwindigkeitszentrifugenrohre übertragen und bei 20, 500 x g 30 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Den Überstand in eine saubere Flasche geben und die Pellets entsorgen.Laden Sie das Lysat auf die Nickelsäule und waschen Sie dann die Säule mit zwei Säulenvolumen des Puffers A, gefolgt von fünf Spaltenvolumen von 20%Puffer B.Die Absorption bei 280 Nanometern nimmt während der Wäsche zu, da die Verunreinigungen aus der Säule entfernt werden. Fahren Sie mit dem Waschen fort, bis A280 zu den Basiswerten zurückkehrt. Dann elute das Protein mit zwei bis drei Spaltenvolumen von 100%Puffer B und sammeln 10 Milliliter Fraktionen, um sicherzustellen, dass die A280 jeder Fraktion zu messen.Bereiten Sie acht Reaktionen mischungen nach Manuskript Richtungen und Pipette 45 Mikroliter jeder Mischung in die ersten drei Brunnen jeder Reihe einer schwarzen Halbfläche 96-Well-Platte. Richten Sie den Plattenleser für die gleichzeitige Erkennung von Blütenstand bei zwei Wellenlängen mit einer festen Photomultiplier-Rohreinstellung ein. Programmieren Sie die Lesezeit auf 20 bis 30 Minuten mit einem Lese-pro-Minute und wählen Sie die zu lesenden Brunnen aus.Setzen Sie die Platte in die Maschine ein und starten Sie die Lese, indem Sie die Emissionsverhältnisse im Laufe der Zeit überwachen. Führen Sie einen Endpunkt aus, der die Platte liest, die das ungeschnittene Substrat enthält. Entfernen Sie die Platte und Pipette fünf Mikroliter Enzym in jedem Brunnen.Man kann die erste Spalte als ungeschnittenes Steuerelement speichern. Lesen Sie dann die Platte 20 bis 30 Minuten lang erneut, um den Plattenleser auf die Ausgabe absoluter Werte einzustellen. Sobald die Auslesung abgeschlossen ist, versiegeln Sie die Platte mit Folie, um Verdunstung zu verhindern, und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur, damit das Enzym das Substrat vollständig schneiden kann.Entfernen Sie nach 24 Stunden den Film und führen Sie einen Endpunktauslesung der Platte durch. Durchschnittlich die Emissionsverhältnisse und notieren Sie sie als schnitt. Bestätigen Sie die Spaltung des Substrats mit SDS-PAGE.Laden Sie einen Molekulargewichtsmarker in die erste oder letzte Spur und laden Sie fünf Mikroliter jedes Reaktionsgemisches in eine Spur des Gels, beginnend mit der ungeschnittenen Reaktion. Befestigen Sie die Elektroden des Geltanks an der Stromversorgung und führen Sie die Produkte 60 Minuten lang bei 110 Volt aus. Entfernen Sie das Gel mit einem Risswerkzeug aus der Kassette und tauchen Sie es in fünf bis 10 Milliliter Färbelösung ein.Nach ein bis 24 Stunden den überschüssigen Fleck entfernen und das Gel in Wasser tauchen. Dann machen Sie ein Bild des Gels mit einem Gel-Imager. Um die Proteinstruktur vorzubereiten, laden Sie die Protein-PDB-Datei in MOE.Klicken Sie auf Auswählen und Lösungsmittel, und löschen Sie dann das Lösungsmittel. Öffnen Sie das Bedienfeld Struktur pVorbereitung in der oberen Menüleiste Berechnen, und korrigieren Sie automatisch alle Strukturelemente, indem Sie auf Korrigieren klicken. Protonieren Sie die Struktur, indem Sie auf Protonate 3D klicken.Fügen Sie dem Protein Teilladungen hinzu, indem Sie das Bedienfeld "Teilladungen" öffnen und AMBER 99 auswählen und Wasserstoffe und Einzelpaare nach Bedarf anpassen. Speichern Sie dann die Strukturdatei. Um die Struktur für die Substratpeptide und TRIM14 zu erstellen, öffnen Sie das Protein Builder-Panel, geben Sie die Substratsequenz ein, und wählen Sie Auto Repack aus.Legen Sie als Nächstes Geometrie als Erweitert fest und klicken Sie auf Build. Minimieren Sie schließlich die Struktur und speichern Sie sie als PDB-Datei. Docken Sie die Substratpeptide mit der PyRx AudoDock 4.2 Software an VEEV-nsP2 an.Laden Sie das Protein, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Namen, und wählen Sie Makromolekül erstellen aus, um die PDBQT-Dockingdatei vorzubereiten. Dann laden Sie das Substratmolekül und wählen Sie Ligand machen, um die Ligandendocking-Datei vorzubereiten. Starten Sie den AutoDock-Assistenten auf dem Docking-Panel unten und wählen Sie die vorbereiteten Liganden- und Proteindateien aus.Definieren Sie die Proteinbindungstasche, indem Sie die Rasterdimension manuell anpassen und dann AuotGrid ausführen. Führen Sie als Nächstes AutoDock aus, und wählen Sie die Lamarckian genetische Algorithmusmethode aus. Klicken Sie auf Docking-Parameter und legen Sie die Anzahl der GA-Läufe auf 50 fest, und klicken Sie dann auf Vorwärts, um den Docking-Lauf zu starten.Wenn AutoDock abgeschlossen ist, öffnen Sie das Bedienfeld Ergebnisse analysieren, und überprüfen Sie alle vorhergesagten Bindungsposen. Wählen Sie das beste Modell mit der niedrigsten vorhergesagten Bindungsenergie und vernünftigen Bindungswechselwirkungen zwischen cis-477 und Substrat auf der Spaltungsstelle aus und speichern Sie es dann als PDB-Datei für weitere MD-Simulationen. Nach dem Lesen der Bindungsposen mit AutoDock ist es wichtig, eine Post-Docking-Analyse durchzuführen, um das plausible Bindungsmodell für die Verfeinerung mit MD-Simulationen zu identifizieren.Dieses Protokoll wurde verwendet, um kurze Abschnitte homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen oder SSHHPS im Zika-Virus ns2B/3 Protease zu finden. Vier Wirtsproteinziele wurden identifiziert. FOXGS, SFRP1, eine Gsalpha-Untereinheit aus einer retinalen cDNA-Bibliothek, und die NT5M mitochondriale 5'3'nukleotidase.Sequenzausrichtungen der SSHHPS erlaubten artspezifische Unterschiede in den Spalt-Standortsequenzen. Die SFRP1-Sequenz war bei Menschen und Hühnern identisch, was bemerkenswert ist, da das Zika-Virus Sterblichkeit und Mikrozephalie in Hühnerembryonen auslösen kann. Der kontinuierliche Assay wurde verwendet, um stetige Zustand kinetische Parameter und Hemmungskonstanten für die viralen Polyproteinsequenzen zu messen und der diskontinuierliche Assay wurde verwendet, um qualitative Spaltungsinformationen zu erhalten, wie z. B. Die Spaltung einer bestimmten Sequenz oder die Hemmung der Protease durch verschiedene Verbindungen.Ein Modell der venezolanischen Pferdeenzephalitis nsP1-nsP2 Kreuzung wurde mit Silico-Methoden gemacht. Bei der nsP2-Protease führte die Verlängerung der Substratsequenz und die Verringerung der Ionenstärke des Puffers zu einer signifikanten Verringerung der Michaelis-Konstante der Spaltung einer Semliki Forest Virussequenz. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Steuerelemente auszuführen.Substrate, die die viralen Proteasespaltungs-Standortsequenzen enthalten, sollten getestet werden, bevor die SSHHPS-Sequenzanalyse fortgesetzt wird. Wenn die Spaltung eines Wirtsproteins beobachtet wird, sollten Folgeexperimente durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass dieses Wirtsprotein die Virusreplikation beeinflusst. Dies kann durch Überexpression oder Silencing des Proteins erfolgen und dann die Auswirkungen auf die Virusreplikation untersucht werden.Gruppe IV enthält eine große Anzahl neuer und neu auftretender Krankheitserreger. Die SSHHPS-Sequenzen verknüpfen bestimmte Wirtsproteine und -wege sehr vorhersehbar mit den viralen Proteasen.

Research

JoVE Journal

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