Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

עבודה זו הייתה נתמכת על ידי הסוכנות להפחתת איום הביטחון (DTRA) מספרי הפרויקט CB-SEED-SEED09-2-0061 ו CBCall4-CBM-05-2-0019, ובחלקו על ידי התוכנית הפנים/מחקר אקסטרקיר של NCATS, NIH (XH) ו מחקר הצי בסיס קרנות מעבדה.

הדעות שהוביעו כאן הן אלה של המחברים ואינן מייצגות את אלה של חיל הים האמריקאי, צבא ארה ב, משרד ההגנה של ארה ב, או ממשלת ארה ב.

השמדה ספציפית לרצף של חלבון או חומצת גרעין המודרכת על-ידי רצף זר מראה רק במקרים ספורים בביולוגיה. המנגנונים המוצגים באיור 1 הם מנגנוני הגנה המגנים על המחשב המארח מפני וירוס, או וירוס ממחשב מארח.
שימוש בשיטות ביוטיות ניתן לזהות את המטרות הושמדו על-ידי מערכות אלה. בניתוח שלנו של רצפי SSHHP, גילינו כי רבים מהם ניתן למצוא חלבונים הדרושים כדי ליצור תגובות החיסונית מולדים. חלקם היו תפקידים ברורים כגון mavs ו-trif (טיר-domain-מכיל מתאם אינטרפרון-β), בעוד אחרים היו קשורים לחסינות אף מנגנונים מורכבים יותר (למשל, histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. למידע היעד המאוחסן ברצף SSHHP יש את הפוטנציאל לזהות מסלולים בעלי אפקטים אנטי-ויראליות נגד וירוסים אלה. תגובות אנטי ויראליות ב vivo הם לעתים קרובות לוירוסים מסוימים26,43. לדוגמה, קבוצות מערכות של חלבונים לקצץ יש השפעות אנטי ויראליות על וירוסים שונים43,44,45, כמה הם גורמי הגבלה נגיפית (למשל, HIV ו TRIM5α). הספציפיות של חלבונים לקצץ (~ 70 זוהו) עדיין נבדק44,45. המידע בתוך SSHHPS עשוי לתרום להבנת האופן שבו וירוסים אלה להתחמק תגובות החיסונית מולדים. דפוסים אחרים וקשרי גומלין עלולים להיות נחשפים כמו SSHHPS יותר נבדקים.
הבדלים ספציפיים למינים התבררו בניתוח שלנו (איור 2, איור 10). וירוסים אלה ידועים להשפיע על מינים מסוימים יותר מאשר אחרים. מידע אודות טווח המארח, הרגישות המארחת וההגנות המארחות עשויים להופיע בתוך SSHHPS. לדוגמה, סוסים, המינים הרגישים ביותר לווירוסים דלקת קרום המוח של הסוסים, חסר באזור TRIM14 אנושי שנחתך ברובו על-ידי ה-VEEV nsP2 פרוטאז. בני אדם לעתים נדירות למות מזיהומים VEEV אבל יכול להיות נגוע24. חלבון TRIM14 האנושי נשא מחשוף nsP2 פרוטאז רצף6. הנוכחות של אתר המחשוף מראים כי בני אדם יש מנגנון הגנה נגד וירוסים אלה. ציפורים כבר חשבו להיות מאגרים פוטנציאליים של וירוסים אלה46. רצף SSHHP המקביל בחלבון TRIM14 מתרנגולות שונה מהרצפים שנמצאו בבני אדם ובמינים אחרים. הבדלים עדינים כמו אלה עשויים להפוך חלבון מארח היעד בלתי ניתן לביטול או מאפשר בקלות רבה יותר. אגירי ואח '16 הראה כי מוטציה בלתי מעשית חלבון מחרוזת הנגרמת רמות גבוהות יותר של ifn לאחר זיהום וירוס דנגה, כי עכברים באופן טבעי לשאת גרסה של סטינג כי הוא לא נחתך על ידי Ns2B3 פרוטאז דנגה. חלבון מורטין העוקץ לא נחתך על ידי ZIKV פרוטאז47. בניתוח SSHHPS שלנו, ראינו גם הבדלים של המחשוף ZIKV פרוטאז האתר כאשר השוונו את החלבונים האנושיים עם אלה של מכרסמים6 (איור 10ד). לשחזר את המינים ספציפיים מסוג החיידקים האנטי-חרדה של חלבונים מארחים עשוי להיות חשוב במודלים של חיות המשמשות לווירוסים Group IV. עיכוב של מחשוף חלבון מארח יש גם השלכות בנוגע לפיתוח של מעכבי הקבוצה IV פרוטאז. בפרסום הקודם שלנו, הראנו שאנחנו יכולים לעכב את TRIM14 המחשוף על ידי nsP2 פרוטאז של VEEV באמצעות CA074 מתיל אסתר6. תוצאה זו עולה כי מולקולה קטנה מעכבי של פרוטסים אלה עשויים להיות מסוגלים לווסת את התגובות החיסונית מולדים כי הם מסוגלים לדכא את הזיהום6,31.
וריאציה גנטית בתוך מינים יש גם את הפוטנציאל לייצר הבדלים במחשוף הפרוטחרדה. הבדלים עדינים בשימוש קודון יכול להשפיע על ריבוכמה משהה48. מאז כמה הקבוצה הרביעית הפרוטזיות נגיפי מוטבע קרום ER, הבדלים אלה הפסקות יכול להשפיע על המחשוף של היעד אם המחשוף מתרחשת שיתוף בצורה מבצעית. חלק מאתרי המחשוף שזיהינו היו ברצפי פפטיד אותות (למשל, SFRP1) בעוד שאחרים היו פנימיים.
ניתוח SSHHPS יכול להפיק מידע השונה משיטות אחרות של ניתוחי חלבון מארחים. הניתוח SSHHPS היה זול וקל להעסיק. השימוש במערכת ביטויים חיידקית מאפשר בדיקה של קטעים קצרים (~ 25 חומצות אמינו) של רצפי יונקים ללא שימוש בתרבות התא של היונקים. מצאנו כי מצעים CFP YFP היו מסוגלים לסבול את כל רצפי החלבונים האנושיים נבדק; עם זאת, תשואות מגוונות. ב assays דומה, מצעים המכילים את רצפי החלבון האנושי כל עוד 63 חומצות אמינו הביעו בהצלחה, מטוהרים, ומנוצל עבור ניתוחים קינטי ו מעכבי ההקרנה49,50,51. מאחר שרק כמויות קטנות של המצע נדרשות לצורך הצורך המתמשך, ניתן לחקור מספר רב של מטרות. אחד היתרונות של המערכת היא כי מצעים CFP/YFP ניתן להשתמש עבור SDS-דף ניתוחים ועבור ניתוחים קינטי מורכבים יותר (כלומר, IC50, ki, km, Vמקסימום). לגילוי סמים, תרכובות מעכבות יכולות לייצר פריטים בערוץ הפלורסנט. לפיכך, היכולת המתמדת בשילוב עם שיטת מתמשך מאפשרת לאדם לאשר מחשוף או עיכוב במחשוף. ניתן לקחת את הדגימות של שיטת ה-SDS-PAGE הרציפה ישירות מתוך הצלחות 96-היטב. CFP/YFP מצעים שימשו לסינון ספריה מורכבת52. עם זאת, ניתוחים נוספים נדרשים כדי לקבוע אם מצע מתאים להקרנה בתפוקה גבוהה כגון חישוב Z-factor53.
אתגר אחד בעיצוב מצע מזהה את האזור סביב הקשר scissile כי הוא מאוגד ומזוהה על ידי פרוטאז. בדוגמאות שמוצגות כאן, התחלנו עם 12 רצפי שאריות שהיו ממורכזים סביב הקשר הscissile. לאחר ניתוח של מערכים רצף של אתרי המחשוף הומולוגיה לשקעים N-טרמינל של איגרת החוב הscissile נמצא עבור פרוטאז VEEV, ואילו עבור פרוטאז ZIKV הומולוגיה לכמה שאריות C-terminal נמצאה. במודל סיליקו של המצע העוגן ניתן להשתמש כדי לעצב ניסויים מוטארזיס בבימויו של האתר החוקרים את האתרים המחייבים של המצע. מאז המצע ורצפי אנזימים הם על פלמידים, או יכול להיות מוטציה כדי לבדוק את המודלים סיליקו או מאתר המשנה טולרנסים. הדבר עשוי להיות יתרון אם מבנה גביש של המצע (ים) המאוגד אינו זמין.
ניתוח SSHHPS עשוי גם להניב מידע חדש על המנגנונים שבהם פנוטיפים המושרה על ידי וירוסים מיוצרים על ידי אנזימים ויראליים. אחד היעדים zikv, SFRP1, הוא חלק של wnt איתות מסלול ויש לו תפקידים הן במוח והן בפיתוח העין ואת התגובות החיסונית36,37,54,55,56,57. מצאנו כי רצפי החלבון האחרים שניתן לגזור על ידי ZIKV ns2B/ns3 פרוטאז היו גם חלבונים מעורבים המוח ופיתוח העין; חריגות בשניהם נצפו בתסמונת Zika מולדים נחשבים לחלק הווירוס המושרה פנוטיפ58.
ניתן לנצל את החיזוי של אינטראקציות מארח-פתוגן למגוון יישומים: טיפולים ויראליים ספציפיים למטרה; דה-סיכון חיסונים וירוס חיים; עידון, חיזוי או מבחר של דגמי בעלי חיים; חיזוי של שורה לטווח או רגישות; חיזוי אירועים zoonotic; וחיזוי ההגנות המארחות. מאחר שהשיטות המתוארות הן מבוססות רצף, הן עשויות להיות בעלי ערך שיכללו בעתיד.

עדות של העברה גנטית אופקית מווירוס לארח, או מארח לנגיף, ניתן למצוא במגוון של גנום1,2,3,4. דוגמאות של האנדוזציה ויראלית הם רצפי מרווח crispr שנמצאו מארח חיידקי גנום4. לאחרונה, מצאנו ראיות של רצפי חלבון מארח מוטבע ב polyproteins שאינם מבניים של (+) ssRNA קבוצה הרביעי וירוסים. רצפים אלה בתוך אזורי הקידוד של הגנום הנגיפי ניתן להפיץ באופן כללי. הקטעים הקצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (sshhps) נמצאים בווירוס ומארח5,6. SSHHPS הם באתר המחשוף שמרו רצפי מוטיב המוכרים על ידי הפרוטסים נגיפי כי יש הומולוגיה לחלבונים מארחים ספציפיים. רצפים אלה מכוונים את ההרס של חלבונים מארחים ספציפיים.
בפרסום הקודם שלנו6, הערכנו רשימה של כל החלבונים המארחים שהיו ממוקדים על ידי הפרוטסים ויראלי מצאו כי רשימת היעדים היה לא אקראי (שולחן 1). שתי מגמות היו בבירור. ראשית, רוב הפרוטסים ויראלי כי לחתוך חלבונים מארחים שייך לקבוצה הרביעי וירוסים (24 של 25 מקרים מעורבים הקבוצה הרביעית ויראלית), פרוטאז אחד שייך (+) ssRNA קבוצת השישי וירוסים (HIV, הנגיף החיסוני האנושי)7. שנית, מטרות החלבון המארח להיות גזור על ידי הפרוטסים נגיפי היו מעורבים בדרך כלל ביצירת התגובות החיסונית מולדים רומז כי ביקנים נועדו להרגיז את התגובות החיסונית של הפונדקאי. מחצית החלבונים המארחים ממוקדות על ידי הפרוטסים ויראלי היו רכיבים ידועים של מפלי איתות שיוצרים אינטרפרון (IFN) ו ציטוקינים proinflammatory (שולחן 1). אחרים היו מעורבים בתמלול התאים המארחים8,9,10 או תרגום11. מעניין, Shmakov ואח '4 הראו כי רצפי CRISPR רבים מתאים לגנים המעורבים בתוך בניין הפלבאמצע או שכפול4.
הקבוצה הרביעית כוללת, בין היתר, מפלאביריתיים, פיאורנרידיים, מאוזיים, כלוניים , וטוגוניים. מספר פתוגנים חדשים ומתפתחים שייכים לקבוצה IV כגון וירוס Zika (ZIKA), מערב הנילוס (WNV), Chikungunya (CHIKV), חמור תסמונת הנשימה הנשימתית וירוס (סארס) ואת תסמונת הנשימה המזרח התיכון וירוס (מרס). The (+) הגנום ssRNA הוא בעיקרו פיסת mRNA. כדי לייצר את האנזימים הנחוצים לשכפול הגנום, הגנום (+) ssRNA הראשון חייב להיות מתורגם. ב אלפא וירוסים ווירוסים הרביעי של הקבוצה, האנזימים הנחוצים לשכפול מיוצרים ב-polyprotein יחיד (כלומר, nsP1234 עבור VEEV). פוליפרוטאין שאינו מבני (nsP) הוא מעובד פרוטפוליסטי (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) על ידי פרוטאז nsP2 לייצר אנזימים פעילים12 (איור 1). פצילות של פוליפרוטאין על ידי nsP2 פרוטאז חיוני עבור שכפול נגיפי; זה הוכח על ידי מחיקה ומוטזיס בבימויו של האתר של האתר הפעיל ציסטאין של nsP2 פרוטאז13,14. בעיקר, את התרגום של חלבונים נגיפי לפני אירועי שכפול הגנום. לדוגמה, nsP4 מכיל rna התלוי רנ א פולימראז צורך לשכפל את (+) הגנום ssRNA. שכפול הגנום יכול לייצר dsRNA intermediates; intermediates אלה יכולים להפעיל את התגובות החיסונית מולדים של המארח. Thus, וירוסים אלה עשויים לקליב מארח מולדת תגובה חיסונית חלבונים בתחילת זיהום על מנת לדכא את השפעותיו15,16,17.
השתקה יכולה להתרחש ברמה של דנ א, רנ א וחלבון. מה שמשותף לכל אחד ממנגנוני ההשתקה המוצגים באיור 1 הוא ה-DNA הזר הקצר, RNA או רצפי החלבונים משמשים כדי להנחות את ההרס של מטרות ספציפיות כדי להרגיז את תפקידם. מנגנוני ההשתקה הם מקבילה לתוכניות "חיפוש ומחיקה" שנכתבו בשלוש שפות שונות. רצף המחשוף הקצר הוא אנלוגי ל-"מילת מפתח". לכל תוכנית יש אנזים המכיר את ההתאמה בין הרצף הקצר ("מילת המפתח") לבין מילה ב"קובץ" שנמחק. לאחר שנמצאה התאמה, קיצוץ האנזים ("מוחק") את רצף היעד הגדול יותר. שלושת המנגנונים המוצגים באיור 1 משמשים להגנה על המחשב המארח מפני וירוסים, או כדי להגן על וירוס ממערכת החיסון של המחשב המארח.
הפרוטסים ויראלי לזהות מחשוף קצר באתר רצפי מוטיב בין ~ 2-11 חומצות אמינו; ב נוקלאוטידים, זה יתאים 6-33 בסיסים. להשוואה, רצפי מרווח crispr הם ~ 26-72 נוקלאוטידים ו rnai הם ~ 20-22 נוקלאוטידים18,19. בעוד רצפים אלה קצרים יחסית, הם יכולים להיות מזוהים במיוחד. בהינתן מגוון גבוה יותר של חומצות אמינו, ההסתברות של אירוע מחשוף אקראי הוא נמוך יחסית עבור פרוטאז נגיפי הכרת רצפי חלבון של 6-8 חומצות אמינו או יותר. החיזוי של SSHHPS בחלבונים מארחים יהיה תלוי במידה רבה בספציפיות של הפרוטאז הנגיפי הנבדק. אם פרוטאז יש הדרישות הספציפיות רצף קפדנית הסיכוי למצוא רצף האתר מחשוף הוא 1/206 = 1 ב 64,000,000 או 1/208 = 1 ב 25,600,000,000; עם זאת, ברוב הפרוטסים יש אתר משנה טולרנסים (למשל, R או K עשוי להיות נסבל באתר S1). כתוצאה מכך, אין דרישה לזהות רצף בין הרצפים שנמצאו במחשב המארח לעומת הווירוס. עבור מיומנויות ויראליות כי יש דרישות רצף משוחרר יותר (כגון אלה השייכות Picornaviridae) ההסתברות למציאת אתר מחשוף בחלבון מארח עשוי להיות גבוה יותר. רבים מהערכים בטבלה 1 הם ממשפחת פיאורנריים .
&שכטר סימון ברגר משמש בדרך כלל לתיאור השקעים במצע פרוטאז ולאתרי האתר שעליהם הם מאגד, אנו משתמשים בסימון זה לאורך כל הדרך. שאריות במצע כי הם N-טרמינל של scissile bond מסומנים P3-P2-P1 בעוד אלה הם C-טרמינל מסומנים P1'-P2' P3 '. אתרי האתר המתאימים בפרוטאז כי לאגד אלה חומצות אמינו שאריות הם S3-S2-S1 ו-S1'-S2'-S3 ', בהתאמה.
כדי לקבוע אילו חלבונים מארחים מיועדים, אנו יכולים לזהות את SSHHPS באתרי המחשוף הנגיפי פוליפרוטאין ולחפש את החלבונים המארחים המכילים אותם. להלן, אנו הליכי מיתאר לזיהוי SSHHPS באמצעות מחשוף הנגיפי פרוטאז האתר רצפים. השיטות הביותטיות, הפרוטאז, ובשיטות סיליקו המתוארות, מיועדות לשימוש בשילוב עם מספר מבוסס-תא.
מערכים רצף של החלבונים המארחים ממוקד על ידי הפרוטסים נגיפי חשפו מינים ספציפיים הבדלים בתוך אלה רצפי מחשוף קצר באתר. לדוגמה, וירוס דלקת קרום המוח של ונצואלה (VEEV) nsP2 פרוטאז נמצא לחתוך את TRIM14 האנושי, מוטיב ה tripartite COMMISSION (TRIM) חלבון6. כמה חלבונים TRIM הם גורמי הגבלה נגיפי (למשל, TRIM5α21), רובם נחשבים אוביקוויב E3 ליגסים. TRIM14 חסרה טבעת (גן מאוד מעניין באמת) התחום והוא אינו נחשב E3 ליגאז22. TRIM14 כבר הציע להיות מתאם בתוך הסימן האנטי ויראלי מיטוכונדריאני (MAVS)22, אבל אולי יש פונקציות אנטי ויראליות אחרות23. היישור של רצפי TRIM14 ממינים שונים מראה כי הסוס חסר באתר המחשוף והנמל גרסה קטומה של TRIM14 כי הוא חסר את ה-C-terminal מתחם/SPRY. תחום זה מכיל אתר polyubiquitination (איור 2). בסוסים, וירוסים אלה הם קטלניים מאוד (~ 20-80% תמותה) ואילו בבני אדם רק ~ 1% למות מזיהומים VEEV24. הפצילות של התחום לחטט/SPRY עשוי להיות קצר ביותר מעגל איתות מתחת ל-MAVS. מפל זה יכול להיות מופעל על ידי dsRNA ומוביל לייצור ציטוקינים אינטרפרון ו pro-דלקתיות. כך, הנוכחות של SSHHPS עשוי להיות שימושי לניבוי איזה מינים יש מערכות הגנה נגד וירוסים מסוימים הרביעי קבוצה.
בווירוסים של הקבוצה הרביעית, מנגנוני האנטוניזם של IFN נחשבים להכפלת25מיותרים. מעטפת חלבון מארח עשוי להיות ארעי במהלך זיהום וריכוזים עשוי להתאושש לאורך זמן. מצאנו בתאים כי מוצרי המחשוף TRIM14 ניתן להבחין מוקדם מאוד לאחר החצייה (6 h) עם קידוד פלבמיד את פרוטאז (cytomegalovirus ירוס מקדם). עם זאת, בתקופות ארוכות יותר, מוצרי המחשוף לא זוהו. בתאים נגועים בווירוס, הקינטיקה היו שונים מוצרי המחשוף יכול להיות מזוהה בין 6-48 h6. אחרים דיווחו על הופעתו של מארח חלבון מוצרי מחשוף מוקדם ככל 3-6 h לאחר הזיהום9,11.
פעילות פרוטחרדה בתאים לעתים קרובות קשה לתפוס; מוצרי המחשוף יכולים להשתנות באמצעות מסיסות, ריכוז, יציבות וחיים. בתוך תא מבוסס assays זה לא ניתן להניח כי מוצרי מחשוף יצטברו בתא או כי עוצמות הלהקה של החלבון גזור ומלא מלוטש יציג מגדילה הפיצוי ופוחתת כמו חלבון לחתוך עלול להיות מושפל מהר מאוד ולא ניתן לגילוי בכתם המערבי במשקל מולקולרי צפוי (MW) (למשל, האזור המכיל את האפירופה יכול להיות ביקע על ידי הפרוטסים מארחים אחרים או יכול להיות אוביקווילי. אם המצע של הפרוטאז הנגיפי הוא חלבון תגובה חיסונית מולדת, הריכוז שלה עשוי להשתנות במהלך הזיהום. לדוגמה, כמה חלבונים מולדים תגובה חיסונית נמצאים לפני זיהום נגיפי הם המושרה עוד על ידי אינטרפרון26. הריכוז של חלבון היעד עשוי אפוא להשתנות במהלך הזיהום והשוואה של ליטים נגועים נגוע לעומת נגוע עלול להיות קשה לפענוח. בנוסף, כל התאים עשויים שלא להיות מזוהמים או נגועים בצורה אחידה. בתוך הפריה חוץ גופית פרוטאז שימוש בחלבונים מטוהרים מ -E. coli מצד שני יש פחות משתנים שעליהם לשלוט וכדומה יכול להיעשות באמצעות sds-PAGE במקום בלוק חיסוני. הפרוטסים מזהם יכול להיות מעוכב בשלבים המוקדמים של טיהור חלבון של המצע CFP/YFP, ומוטציה ויראלי הפרוטסים ניתן לטהר ונבדק כפקדים כדי לקבוע אם המחשוף נובע פרוטאז נגיפי או פרוטאז חיידקי מזהם.
מגבלה אחת של פרוטאז מחוץ לבית הספר היא שאין להם מורכבות של תא יונקים. כדי שאנזים יחתוך את המצע שלו, השניים חייבים להיות מותאמים לשיתוף. שונות ויראלית של קבוצה הרביעית במבנה ובלוקליזציה. לדוגמה, פרוטאז ZIKV מוטבע הממברנה האנדופלזמית (ER) הפנים ופרצופים ציטוסול, בעוד הפרוטאז VEEV nsP2 הוא חלבון מסיס בציטופלסמה ו גרעין27. חלק מהמחשוף שנמצאו בניתוח ZIKV SSHHPS היו בפפטידים של אותות הרומזים כי המחשוף עלול להתרחש במשותף למטרות מסוימות. כך, המיקום של פרוטאז ואת המצע בתא גם צריך להיחשב בניתוחים אלה.
בחני מבוסס התא יכול להיות בעל ערך עבור הקמת תפקיד עבור חלבון מארח מזוהה (s) זיהום. שיטות שמטרתן לעצור מחשוף פרוטאז ויראלי של חלבונים מארחים כגון תוספת של מעכב פרוטאז6 או מוטציה ביעד המארח16 ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעות שלהם על שכפול נגיפי. ביטוי יתר של חלבון ייעודי גם עלול להשפיע על שכפול נגיפי28. הפלאק אומר או שיטות אחרות ניתן להשתמש כדי לכמת שכפול נגיפי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

אנזימים אלפא-ויראליות מסונתז בפוליפפטיד בודד. Polyprotein לא מבניים (nsp) מעובד על ידי פרוטאז nsP2 ציסטאין שלה כדי לייצר אנזימים פעילים חיוניים עבור שכפול נגיפי. הפרוטסים ויראלי הם ספציפיים מאוד ולהכיר מחשוף שמרו רצפים מוטיב האתר (~ 6-8 חומצות אמינו). בכמה וירוסים Group IV, פרוטאז nsP (s) מחשוף מוטיב האתר ניתן למצוא חלבונים מארחים ספציפיים מעורב ביצירת תגובות החיסונית מולדים, במקרים מסוימים, החלבונים ממוקד להיראות מקושרים את הנגיף המושרה פנוטיפים. וירוסים אלה לנצל קטעים קצרים של הומוולוגי רצפי חלבון הפתוגן מארח (SSHHPS) עבור הרס ממוקד של חלבונים מארחים. כדי לזהות SSHHPS ויראלי מחשוף המחשוף באתר רצפי מוטיב ניתן להכניס את הפיצוץ ואת הגנום מארח (s) ניתן לחפש. הפצילות בתחילה ניתן לבחון באמצעות מטוהרים nsP ויראלי פרוטאז והעברת אנרגיה בתהודה הקרינה (לדאוג) מצעים שנעשו ב -E. coli. מצעים הסריג מכילים חלבון פלורסנט תכלת וצהוב ורצף האתר המחשוף (CFP-רצף-YFP). שיטת פרוטאז זו ניתן להשתמש ברציפות בקורא צלחת או ברציפות ב-SDS-דף ג ' לים. מודלים של מצעים פפטיד מאוגד ניתן לייצר בסיליקו כדי להנחות את המצע בחירת מחקרים מוטגנזה. CFP/YFP מצעים יש גם מנוצל כדי לזהות מעכבי פרוטאז. אלה בתוך מבחנה ובשיטות סיליקו ניתן להשתמש בשילוב עם בחני מבוסס תא אומר לקבוע אם החלבון המארח הייעודי משפיע על שכפול נגיפי.

SSHHPS ניתוח של ZIKV ns2B/3 פרוטאז מזוהה 4 מטרות חלבון מארח: FOXG1, SFRP1, יחידת משנהאלפא של G מספריית cdna רשתית, ואת מיטוכונדריאל NT5M 5 ', 3 '-nucleotidase (איור 10)6. בעיקר, אין שיטה אחרת ניבא חלבונים אלה כמטרות פוטנציאליות של פרוטאז ZIKV. מוטציות בגן FOXG1 קושרו לתסמונת מולדת המאופיינת על ידי פיתוח לקוי וחריגות המוח מבניים כגון microcephaly. SFRP1 הוא חלבון מופרש הקשור ביניהם (SFRP); אלה קולטנים מסיסים יכולים לאגד בתחרותי Wnt ליגנדס להרגיז ולעכב איתות Wnt. מסלול ה-Wnt איתות מעורב בוויסות התגובה IFN במהלך זיהום36Flavivirus. המחשוף של SFRP1 צפוי לשפר את שכפול וירוס flavivirus. SFRP1 מעורב גם ב Th17-cell בידול37. מערכים הרצף של SSHHPS הראו הבדלים ספציפיים למינים בתוך רצפי האתר מחשוף (איור 10ד). רצף המחשוף בSFRP1 היה זהה בבני אדם ותרנגולות; ZIKV יכול לגרום לתמותה ו microcephaly ב העוברים עוף38. ב מכרסמים, שאריות P1 מאוד שמרו (K/R) R ↓ G הוא הוחלף על ידי גליצין (RGG). זנים אימונומוסמכים של עכברים עמידים בדרך כלל כדי זיהום ZIKV ומחלות39.
יציב המצב הקינטי פרמטרים וקבועים עיכוב ניתן למדוד עבור רצפי פוליפרוטאין נגיפי ועבור רצפי חלבון מארח באמצעות הסדר הרציף בקורא לוחית31,40,41 (איור 11א). למידע על מחשוף איכותי, כגון מחשוף של רצף מסוים או עיכוב של הפרוטאז באמצעות תרכובות שונות, ניתן להשתמש באופן שאינו רציף (איור 11ב).
אופטימיזציה של מספר שאריות בין CFP ו-YFP עשוי להידרש. ניתן לעשות מודל מאוגד מצע באמצעות שיטות סיליקו. מודל מעוגן נציג של צומת nsP1/nsP2 מוצג באיור 9. עבור הפרוטאז VEEV nsP2, המחשוף של 12-אמינו חומצה היער הנגיף (SFV) רצף דווח (Km = 0.58 mM)33. הארכת רצף המצע ל-19, 22, ו -25 שאריות והפחתת החוזק היוני של המאגר הובילה לירידה משמעותית ב-Km. בחינת מבנה הגביש VEEV nsP2 ואריזת הגביש גם הראה שחלק מאחת הצמתים היה ארוז נגד התחום פרוטאז והיה helical. כך, מצעים VEEV ארוך יותר עשויים לאגד טוב יותר בשל הכרה של מוטיב מבניים משני.
עבור TRIM14, הצלחנו Km = 21 μm6,33. Km עבור מצע הנושאת את רצף החלבון המארח היה דומה לערכי Km של מצעים המכילים את המחשוף polyprotein מחשוף האתר (Km(רובוטית v12) = 12 μm ו-Km(V34) = 21 μm). רצפי אתר המחשוף בצמתים nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 ו-nsP3/nsP4 נחתכו ביעילות שונה. בתא, זה נחשב לאפשר מחשוף סדרתי של polyprotein42.
יש לנקוט זהירות בפענוח תוצאות שליליות. אם לא מתרחשת מחשוף, אתר המחשוף עשוי להיות קצר מדי או פרוטאז מטוהר יכול להיות פעיל. עבור מצעים מנותקים, ניסויים נוספים נחוצים כדי לאשר את המחשוף של חלבון אורך מלא או מחשוף בתאים נגועים בווירוס. יש לבחור ניסויים מתאימים למעקב. ניתן לבדוק את ההשפעות של ביטוי יתר או השתקה של חלבון היעד על שכפול נגיפי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> איור 1: שלושה מנגנונים של השתקה. השתקה יכולה להתרחש ברמה של DNA, RNA או חלבון. אלגוריתמים אלה "חיפוש ומחיקה" משתמשים במילת "מילת מפתח" כדי לכוון את המחשוף של קובץ המכיל את המילה. דמות זו השתנתה ממוריאני ואח '32 וההפניות בו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> איור 2: הבדלים ספציפיים למינים בתוך מחשוף ברצפי האתרים. קבוצות המחשבים של TRIM14 homologues מופיעות ביישור. ניתן לזהות את קבוצת המחשבים ' חטט/SPRY ' על-ידי המוטיבים המושמרו המסומנים באפור. האדם TRIM14 הוא נחתך ב q, ↓ G על ידי veev nsP2 ציסטאין פרוטאז. הרצף של SSHHP מוצג בצבע. השאריות הירוקות הן השאריות של P1; בכחול הוא שאריות P4, ו באדום הם שאריות שמרו אחרים בתוך המחשוף מוטיב האתר. הנמל של הסוס גרסה קטומה של TRIM14 חסר את התחום חטט/SPRY. הלויזין המסומן בציאן הוא פולי-אוביקוויל, והוא חשוב להרכבת השלטים המאסיביים. תחום ה-C-terminal לפריצה/SPRY עשוי להיחתך בחריפות על ידי nsP2 פרוטאז כדי לפגוע בתגובה האנטי-ויראלית של המארח intracellularly במהלך זיהום נגיפי חריף. בסוסים, תחום זה תמיד נעדר. זה מרמז כי התחום לחטט/SPRY של TRIM14 עשוי להיות פונקציה מגן נגד זיהומים VEEV. הדמות הזאת שוחזר ממורעזאני ואח '6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> איור 3: זיהוי SSHHPS באמצעות הפיצוץ. המחשוף באתר מוטיב רצף בצומת VEEV nsP1/nsP2 מיושר עם סדרת SSHHP ב חלבון מארח TRIM14. השאריות הצבועות בירוק הוא שארית ה-P1; בכחול הוא שאריות P4 ו אדום הם שאריות שמרו אחרים של המחשוף באתר מוטיב. רוב המערכים הכילו הומולוגיה לאזורים מחוץ למוטיב החיצוני של מוטיב המחשוף או לא כללו את שאריות הקשר של P1/P1 scissile. TRIM14 הראה התאמה 6 שאריות בסדר רציפים שכללו P1 ו P1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> איור 4: החלבון ורצפי ה-DNA של המצע CFP-רובוטית v12-yfp ל-veev nsP2 ציסטאין פרוטאז. אתרי ההגבלה של NdeI (CATATG) ו-XhoI (CTCGAG) מוצגים באותיות רישיות. באדום הוא רצף באתר המחשוף של polyprotein הנגיפי כי הוא בין nsP1 ו nsP2. שאריות ירוק הוא שאריות P1 ו בכחול הוא שאריות P4 של אתר המחשוף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> איור 5: רצף החלבונים של מבנה פרוטאז של trx-veev-nsP2 ציסטאין. Thioredoxin (Trx) מוצג בצהוב. אתר המחשוף של התרומבין והתג שלו מוצגים בציאן. משפחת מק-הדיקן שלו. מתויג באדום <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> איור 6: מבנים פפטיד ב-מו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> איור 7: עגינה של מצע פפטיד באמצעות PyRx/AutoDock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> איור 8: משימות הפועלות באשכול Biowulf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> איור 9: מודל של המצע VEEV P12 המכיל את רצף האתר מחשוף בצומת nsP1/nsP2. Cys-477/שלו-546 לדיאד קטליטי מוצג בכחול. הדמות נעשתה באמצעות פימול (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> איור 10: ניתוח SSHHPS של וירוס Zika ns2B/ns3 פרוטאז. (א) החזוי מטרות חלבון מארח של Zikv ns2B/ns3 פרוטאז. שאריות באדום מתאימים. לרצף מחשוף אחד שאריות בירוק נסבלים באתר המשנה ומתאימים לשקעים באתרי מחשוף אחרים. SFRP1 היה המספר הגבוה ביותר של שאריות זהים בסדר רציף. (ב) CFP-מצע-yfp חלבונים (~ 50-60 kda) הביעו ומטוהרים המכיל את רצף SSHHP החזוי מכל חלבון מארח (אנושי). פרוטאז ZIKV לחתוך האדם FOXG1, SFRP1, NT5M ויחידת המשנה Gsאלפא מבודד מספריית cdna רשתית. מוצרי המחשוף הם כ 28-30 kDa. רצפי המצע זמינים ב morazzani ואח '6 (ג) בעוד ns2B הns3 פרוטאז לחתוך SFRP1, זה לא לגזור homologues שלה (SFRP2 ו SFRP4). (ד) היישור של אתרי המחשוף ממינים שונים של בעלי חיים עשוי להועיל בבחירת דגם בעל חיים עבור וירוס הרביעי של הקבוצה. שים לב כי הרצף שמור R ↓ G שונה בין בני אדם ומכרסמים ב SFRP1. איור ששוחזר ממוריאני ואח '6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> איור 11: המצב יציב קינטי ניתוח באמצעות assays רציף מתמשך. (א) הנתונים הקינטית המוצגים בטבלה 5 הותוו ב-grafit. הכניסה מראה את העלילה. של לינויבר-בורק (ב) sds-ג'ל עמוד מציג את מוצרי המחשוף של המצע CFP-רובוטית v12-yfp. במשעול 1 הוא המצע "נימול" (48 kDa). במשעול 2 הוא "גזור" מצע (31 kDa ו -27 kDa). בנתיבים 3-9 תרכובות שונות נכללו כדי לבדוק את פעילות העכבות שלהם. ליין 4 מכיל את המעכב. הE64d קוולנטי התגובות הללו התבצעה במשך. הלילה בטמפרטורת החדר הרתיחה של הדגימות היה נדרש כדי להשיג את הדפוס פסים חדים. NsP2 פרוטאז הוא גלוי (56 kDa) בתגובות המכילות אנזים, אבל לא במסלול 1. . ליין 1 "זה בקרת" ללא אנזים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

אנו מציגים פרוטוקול כללי לזיהוי קטעים קצרים של רצפי חלבון הומוולוגי מארח-הפתוגן (SSHHPS) מוטבע polyprotein הנגיפי. SSHHPS מזוהים על ידי הפרוטסים נגיפי ולהפנות את ההרס המיועד של חלבונים מארחים ספציפיים על ידי מספר וירוסים הקבוצה הרביעית.

ניתוח של הקבוצה הרביעית ויראלית שימוש במבחנה ובשיטות סיליקו

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

הראינו שהגנומים הנגיפיים של הקבוצה הרביעית מקודדים קטעים קצרים של רצפי חלבונים מארחים. רצפים אלה ניתן למצוא בתוך אתרי מחשוף פרוטאז ויראלי. הם משמשים להרס ממוקד של חלבונים מארחים, בדרך כלל חלבונים המעורבים ביצירת התגובות החיסוניות.היתרון העיקרי של שימוש ב- protease assays הוא שהוא מסיר את המורכבות של תא ומראה אם פרוטאז ויראלי יכול לחשוף רצף מסוים. לכן, כאשר ניתחנו רצפי זיקה SSHHPS, מצאנו כי פרוטאז יכול לחתוך רצפים חלבונים המעורבים ביצירת תגובות חיסוניות, כי חלק חלבונים אלה היו גם תפקידים בהתפתחות המוח והעין. בעת ביצוע טכניקה זו בפעם הראשונה, יש לזכור כי אם המחשוף לא נצפתה, כי זה יכול להיות בגלל מגוון רחב של גורמים כגון הפעילות של פרוטאז.הדגימה של ההליך תהיה ג'יימי קומפטון, טכנאי מהמעבדה שלי. התחל על ידי פתיחת Protein BLAST ולשים את 20 חומצות האמינו המקיפות את הקשר מספריים ואת פוליפרוטאין ויראלי לבחור רצפי חלבון מיותרים ולאחר מכן להקליד את הגנום המארח כדי לחפש. במידת הצורך, בחר PHI-BLAST והקלד רצף דוגמאות מילוי שבו סוגריים מרובעים מציינים כי חומצת אמינו בתוך הסוגריים יכולים להיות במיקום המחליף, ולאחר מכן לחץ על BLAST.סדר דירוג להיטי BLAST בהתבסס על מספר שאריות זהות או נסבלות רצופות התואמות לרצף אתר מחשוף. מהרשימה, בחר את החלבונים המכילים שש שאריות זהות או דומות יותר לניתוח בהמתזות הפרוטאז. בנו קידוד פלסמיד לחלבון פלואורסצנטי ציאן, עד 25 חומצות אמינו של רצף המחשוף, וחלבון פלואורסצנטי צהוב.לאחר מכן, להכין את המצעים CFP ו- YFP על ידי חיטוי ארבעה ארבעה בקבוקונים ליטר עם 25 מיליליטר של תרבות לילה. לנער את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס ולפקח על הצמיחה מדי שעה על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis ב 600 ננומטר. כאשר החיידקים מגיעים לספיגה של כאחד, לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת 0.5 מיליליטר של IPTG טוחן אחד לכל בקבוק, ולאחר מכן להוריד את הטמפרטורה של החממה רועדת ל 17 מעלות צלזיוס ולאפשר את הביטוי להמשיך לילה במשך 17 עד 20 שעות.ביום שלמחרת, גלולה את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 7000 פעמים גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר והשליך את המדיה הנוזלית ולאחר מכן לאחסן את כדורי במינוס 80 מעלות צלזיוס או להמשיך עם תות התא. כדי lyse התאים, להכין 100 מיליליטר של חיץ תזה על פי הוראות כתב היד, להשתמש מחדש את כדורי במאגר, ולהעביר 25 עד 25 מיליליטר של ההשעיה ל 50 צינורות חרוט חד פעמיים מיליליטר.מניחים את הצינורות ב פלסטיק עם מי קרח ואז להכניס את קצה sonicator לתוך הצינור, כך הקצה הוא כ סנטימטר אחד מתחתית הצינור sonicate 10 עד 20 פעמים עד שהוא הופך נוזל נוזלי נוזלי. לאחר sonication, להעביר את lysate לצינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה צנטריפוגה אותו ב 20, 500 x g במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לבקבוק נקי וזורקים את הכדורים.טען את lysate על עמוד ניקל ולאחר מכן לשטוף את העמודה עם שני כרכים עמודה של מאגר A ואחריו חמישה כרכים עמודה של 20%מאגר B.Absorbance ב 280 ננומטר יגדל במהלך לשטוף כמו מזהמים לרחף מהעמודה. המשך לשטוף עד ש- A280 יחזור לערכי התוכנית הבסיסית. לאחר מכן ליטף את החלבון עם שניים עד שלושה נפחי עמודות של 100%buffer B ולאסוף 10 שברים מיליליטר, הקפד למדוד את A280 של כל שבר.הכינו שמונה תערובות לפי הוראות כתב היד ופיגט 45 מיקרוליטרים של כל תערובת לשלושת בארות הראשונות של כל שורה של צלחת שחורה של חצי אזור 96 בארות. הגדר את קורא הלוחות לגילוי בו זמני של florescence בשני אורכי גל עם הגדרת צינור photomultiplier קבוע. תכנת את זמן הקריאה ל- 20 עד 30 דקות עם קריאה אחת לדקה ובחר את הבארים לקריאה.הכנס את הלוחית למכונה והתחל את הקריאה, תוך ניטור יחסי הפליטה לאורך זמן. הפעל קריאת נקודת קצה של הלוח המכיל את המצע הלא חתוך. הסר את הצלחת ואת פיפטה חמישה microliters של אנזים לתוך כל באר.ניתן לשמור את העמודה הראשונה כפקד ללא חיתוך. לאחר מכן קראו שוב את הלוח במשך 20 עד 30 דקות, ודאו להגדיר את קורא הלוחות לפלט ערכים מוחלטים. לאחר הקריאה הושלמה, לאטום את הצלחת עם הסרט כדי למנוע אידוי ולהשאיר אותו לילה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את האנזים לחתוך לחלוטין את המצע.לאחר 24 שעות, להסיר את הסרט ולבצע קריאת נקודת קצה של הצלחת. ממוצע יחסי הפליטה ותקליט אותם כחתך. אשר את המחשוף של המצע באמצעות SDS-PAGE.לטעון סמן משקל מולקולרי לנתיב הראשון או האחרון ולהעמיס חמישה microliters של כל תערובת תגובה לתוך נתיב של הג'ל, החל התגובה נימולים. חבר את האלקטרודות של מיכל הג'ל לאספקת החשמל והפעל את המוצרים ב 110 וולט במשך 60 דקות. מוציאים את הג'ל מהקלטת בעזרת כלי פיצוח ומטביעים אותו בחמישה עד עשרה מיליליטר של תותכת.לאחר שעה עד 24 שעות, להסיר את הכתם העודף להטביע את הג'ל במים. ואז לצלם את הג'ל באמצעות תמונה ג'ל. כדי להכין את מבנה החלבון, לטעון את קובץ PDB חלבון לתוך MOE.לחץ על בחר וממס ולאחר מכן מחק את הממס. פתחו את החלונית 'מבנה pPreparation' מ שורת התפריטים 'מיפוי עליון' ותיקנו אוטומטית את כל הפריטים המבניים בלחיצה על 'תקן'. פרוטונאט המבנה על ידי לחיצה על Protonate 3D.הוסיפו לחלבון חיובים חלקיים על-ידי פתיחת החלונית 'חיובים חלקיים' ובחירה ב-AMBER 99 וכוונון המימן והזוגות הבודדים כנדרש. לאחר מכן שמור את קובץ המבנה. לבניית המבנה של פפטידי המצע ו-TRIM14, פתחו את החלונית 'בונה חלבונים', הזינו את רצף המצע ובחרו 'אריזה אוטומטית מחדש'.לאחר מכן, הגדר גיאומטריה כמורחב ולחץ על לבנות. לבסוף למזער את המבנה ולשמור אותו כקובץ PDB. עגן את הפפטידים המצעיים ל- VEEV-nsP2 באמצעות תוכנת PyRx AudoDock 4.2.טען את החלבון, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השם ובחר הפוך את Macromolecule להכנת קובץ העגינה PDBQT. לאחר מכן טען את מולקולת המצע ובחר הפוך את Ligand כדי להכין את קובץ העגינה של הליגנד. הפעל את אשף ה-AutoDock בלוח העגינה בתחתית ובחר את קובצי הליגנד והחלבון המוכנים.הגדר את הכיס מחייב החלבון על-ידי כוונון ידני של ממד הרשת ולאחר מכן הפעל את AuotGrid. לאחר מכן, הפעל את AutoDock ובחר את שיטת האלגוריתם הגנטי של למארקיאן. לחץ על פרמטרי עגינה והגדר את מספר ריצות GA ל- 50 ולאחר מכן לחץ על קדימה כדי להתחיל את הפעלת העגינה.לאחר השלמת AutoDock, פתחו את החלונית 'נתח תוצאות' ובדקו את כל תנוחות האיגוד החזויות. בחר את המודל הטוב ביותר עם האנרגיה המחייבת החזויה הנמוכה ביותר ואינטראקציות מחייבות סבירות בין cis-477 לבין המצע באתר המחשוף ולאחר מכן שמור אותו כקובץ PDB לסימולציות MD נוספות. לאחר קריאת תנוחות הכריכה עם AutoDock, חשוב לבצע ניתוח שלאחר העגינה כדי לזהות את מודל מחייב מתקבל על הדעת עבור עידון עם סימולציות MD.פרוטוקול זה שימש כדי למצוא קטעים קצרים של רצפי חלבון מארח פתוגן הומולוגי או SSHHPS ב ns2B/3 וירוס זיקה פרוטאז. זוהו ארבע מטרות חלבון מארחות. FOXGS, SFRP1, תת-אחת של Gsalpha מספריית cDNA ברשתית, והנוקלאוטידס המיטוכונדריאלי NT5M 5'3'.יישורי רצף של SSHHPS אפשרו הבדלים ספציפיים למינים ברצפי אתר המחשוף. רצף SFRP1 היה זהה בבני אדם ותרנגולות וזה ראוי לציון כי וירוס זיקה יכול לגרום לתמותה ומיקרוסקפליה בעוברים עוף. ההסקה המתמשכת שימשה למדידת פרמטרים קינטיים של מצב יציב וקבועי עיכוב עבור רצפי הפוליפרוטאין הנגיפיים וההסקה הבלתי רציפה שימשה להשגת מידע מחשוף איכותי, כגון מחשוף של רצף מסוים או עיכוב הפרוטאז על ידי תרכובות שונות.מודל של צומת דלקת המוח סוסים ונצואלה nsP1-nsP2 נעשה באמצעות שיטות סיליקו. עבור פרוטאז nsP2, הארכת רצף המצע והפחתת הכוח היוני של החיץ הובילו לירידה משמעותית קבוע מיכאליס של מחשוף של רצף וירוס יער סמליקי. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב להפעיל את הפקדים.מצעים המכילים את רצפי האתר מחשוף פרוטאז ויראלי צריך להיבדק לפני שתמשיך עם ניתוח רצף SSHHPS. אם מחשוף של חלבון מארח הוא ציין, ניסויים מעקב צריך להתבצע כדי לאשר כי חלבון המארח משפיע על שכפול ויראלי. זה יכול להיעשות על ידי overexpressing או השתקה של החלבון, ולאחר מכן בחינת ההשפעות על שכפול ויראלי.קבוצה IV מכילה מספר רב של פתוגנים חדשים ומתפתחים. רצפי SSHHPS מקשרים חלבונים ומסלולים מארחים ספציפיים עם הפרוטאזות הנגיפיות בצורה צפויה מאוד.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

הקמת תרבות הנוזלית מכוסית של Airway האנושי המקוטב-3 Calu תאי אפיתל ללמוד תגובת תא מארחת לפתוגנים נשימה<em&gt; במבחנה</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...