Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

この研究は、防衛脅威低減庁(DTRA)プロジェクト番号CB-SEED-SEED09-2-0061とCBCall4-CBM-05-2-0019、およびNCATS、NIH(XH)および海軍研究所基地資金の内壁/壁外研究プログラムによって支援されました。

ここで表明された意見は著者のものであり、アメリカ海軍、アメリカ陸軍、米国国防総省、米国政府の意見を表すものではありません。

異物の配列によって導かれるタンパク質または核酸の配列特異的破壊は、生物学においていくつかの場合にしか見られない。図 1に示すメカニズムは、ホストをウイルスから保護する防御メカニズム、またはホストからのウイルスです。
バイオインフォマティクス法を用いて、これらのシステムによって破壊される標的を特定することができます。SSHHP配列の分析では、その多くが自然免疫応答を生成するために必要なタンパク質に含まれることがわかりました。MAVSやTRIF(TIRドメイン含有アダプタ誘導インターフェロンβ)などの明白な役割を持つものもあれば、より複雑なメカニズム(例えば、ヒストンH3、SFRP1、FOXG1)8、9.などの明らかな役割を果たしたものもあります。SSHHP配列に格納された標的情報は、これらのウイルスに対して抗ウイルス作用を有する経路を同定する可能性を有する。生体内での抗ウイルス応答は、多くの場合、ウイルス特異的な26、43.例えば、TRIMタンパク質のサブセットは、異なるウイルスに対する抗ウイルス作用を有する43、44、45、ウイルス制限因子(例えば、HIVおよびTRIM5α)である。TRIMタンパク質の特異性(約70が同定されている)は、まだ44、45を調べられている。SSHHPS内の情報は、これらのウイルスが自然免疫応答を回避する方法の理解に貢献する可能性があります。より多くのSSHHPSが調べられるにつれて、他のパターンおよび相関関係が明らかになるかもしれない。
種固有の違いは、我々の分析で明らかでした(図2、図10)。これらのウイルスは、他のものよりもいくつかの種に影響を与することが知られています。ホスト範囲、ホストの感受性、およびホスト防御に関する情報は、SSHHPS 内に存在する場合があります。例えば、馬脳炎ウイルスの最も影響を受けやすい種であるウマは、VEEV nsP2プロテアーゼによって一過性に切断されたヒトTRIM14の領域を欠いていた。ヒトがVEEV感染で死亡することはめったにないが、感染することは24.ヒトTRIM14タンパク質は、nsP2プロテアーゼ切断配列6を運んだ。切断部位の存在は、人間がこれらのウイルスに対する防御メカニズムを持っていることを示唆している。鳥は、これらのウイルスの潜在的な貯水池であると考えられてきた46.鶏由来のTRIM14タンパク質中の対応するSSHHP配列は、ヒトおよび他の種に見られる配列とは異なった。このような微妙な違いは、標的宿主タンパク質を不作とするか、またはより容易に切断させる可能性がある。Aguirre et al.16は、デングウイルス感染後に不死状態の変異型STRINGタンパク質がIFNのより高いレベルを誘導し、マウスがデングns2B3プロテアーゼによって切断されないSTINGのバージョンを自然に運ぶことを示した。マウスSTINGタンパク質は、ZIKVプロテアーゼ47によって切断されなかった。SSHHPS分析では、ヒトタンパク質とげっ歯類6のタンパク質を比較した際のZIKVプロテアーゼ切断部位配列の違いも観察した(図10D)。宿主タンパク質の種特異的タンパク質分解切断を再現することは、グループIVウイルスに使用される動物モデルにおいて重要である可能性がある。宿主タンパク質切断の阻害は、グループIVプロテアーゼ阻害剤の開発にも影響を及ぼす。前回の発表では、CA074メチルエステル6を用いたVEEV nsP2プロテアーゼによるTRIM14切断を阻害できることを示した。この結果は、これらのプロテアーゼの小分子阻害剤が、感染を抑制することができる自然免疫応答を調節することができることを示唆している。
種内の遺伝的変異はまた、タンパク質分解切断の違いを生成する可能性を有する。コドンの使用の微妙な違いは、リボソームの一時停止に影響を与える可能性があります48.一部のグループIVウイルスプロテアーゼはER膜に埋め込まれているため、切断が共に翻訳された場合、これらの一時停止の違いが標的の切断に影響を及ぼす可能性があります。我々が同定した切断部位のいくつかは、予測されたシグナルペプチド配列(例えば、SFRP1)にあったが、他のものは内部であった。
SSHHPS分析は、ホストタンパク質分析の他の方法とは異なる情報を生成することができます。SSHHPS分析は安価で使いやすいものでした。細菌発現系の使用は、哺乳動物細胞培養を使用せずに哺乳動物配列の短いセグメント(〜25アミノ酸)の試験を可能にした。我々は、CFP-YFP基質が試験されたヒトタンパク質配列のすべてを許容できることを発見した;しかし、収量はさまざまです。同様のアッセイにおいて、63個のアミノ酸であればヒトタンパク質配列を含む基質が、運動学的分析および阻害剤スクリーニングに正常に発現、精製、および利用された49、50、51である。不連続アッセイには少量の基板しか必要としないため、多数の標的を探索できます。このシステムの利点の1つは、CFP/YFP基板をSDS-PAGE解析およびより精巧な運動解析(すなわち、IC50、Ki、Km、Vmax)に使用できることです。創薬のために、阻害性化合物は蛍光アッセイでアーティファクトを産生することができる。したがって、連続アッセイと組み合わせた不連続アッセイは、切断または切断の阻害を確認することを可能にする。不連続なSDS-PAGEアッセイのサンプルは96ウェルプレートから直接取り出すことができます。CFP/YFP基板は、化合物ライブラリースクリーニング52に使用されている。しかし、Z係数53の計算などの高スループットスクリーニングに基板が適しているかどうかを判断するには、追加の分析が必要である。
基板を設計する際の課題の1つは、プロテアーゼによって結合および認識される生体結合の周りの領域を特定することです。ここに示す例では、生体結合を中心とした12個の残基配列から始めました。切断部位の配列アライメントを分析した後、生まれ関債の残基N末端に相同性がVEEVプロテアーゼに対して発見されたのに対し、一方、いくつかのC末端残基に対するZIKVプロテアーゼ相同位について発見された。ドッキング基板のインシリコモデルは、基板の結合部位をプローブする部位特異的突然変異誘発実験を設計するために使用することができる。基質および酵素配列はプラスミド上にあるので、インシリコモデルまたはサブサイト公差を試験するために変異させることができる。これは、結合基板の結晶構造が利用できない場合に有利であり得る。
SSHHPS分析はまた、ウイルス誘発表現型がウイルス酵素によって産生されるメカニズムに関する新しい情報を生み出す可能性がある。ZIKV標的の1つであるSFRP1は、Wntシグナル伝達経路の一部であり、脳および眼の発達および免疫応答36、37、54、55、56、57の両方において役割を有する。我々は、ZIKV ns2B/ns3プロテアーゼによって切断することができる他のタンパク質配列も脳および眼の発達に関与するタンパク質にあったことを発見した。両方の異常は先天性ジカ症候群で観察されており、ウイルス誘発表現型58の一部であると考えられている。
宿主と病原体の相互作用の予測可能性は、標的特異的のオンコ分解ウイルス療法という様々な用途に利用される可能性がある。危険を冒すライブウイルスワクチン;動物モデルの精製、予測または選択;宿主範囲または感受性の予測;人獣共通事象の予測;ホスト防御の予測。説明する方法はシーケンスベースであるため、将来的にソフトウェアに組み込む価値があるかもしれません。

ウイルスから宿主、または宿主からウイルスへの水平遺伝子導入の証拠は、種々のゲノム1、2、3、4で見つけることができる。ウイルス内因性化の例は、細菌宿主ゲノム4に見られるCRISPRスペーサー配列である。最近、(+)ssRNAグループIVウイルスの非構造性ポリタンパク質に埋め込まれた宿主タンパク質配列の証拠が見つかりました。ウイルスゲノムのコード領域内でこれらの配列を世代的に伝播させることができる。相同な宿主病原体タンパク質配列(SSHHPS)の短いストレッチは、ウイルスおよび宿主5、6に見出される。SSHHPSは、特定の宿主タンパク質に相同性を有するウイルスプロテアーゼによって認識される保存された切断部位モチーフ配列である。これらの配列は、特定の宿主タンパク質の破壊を指示する。
前回の出版物6では、ウイルスプロテアーゼの標的となったすべての宿主タンパク質のリストをまとめ、標的のリストが非ランダムであることを発見した(表1)。2つの傾向が明らかになった。まず、宿主タンパク質を切断したウイルスプロテアーゼの大部分は、グループIV型ウイルス(25例中24例が第4種ウイルスプロテアーゼを含む)に属し、かつ1つのプロテアーゼが(+)ssRNA群VIレトロウイルス(HIV、ヒト免疫不全ウイルス)7に属していた。第二に、ウイルスプロテアーゼによって切断される宿主タンパク質標的は、一般に、切断が宿主の免疫応答に拮抗することを意図していることを示唆する自然免疫応答の生成に関与していた。ウイルスプロテアーゼを標的とする宿主タンパク質の半数は、インターフェロン(IFN)および炎症性サイトカインを生成するシグナル伝達カスケードの既知の成分であった(表1)。他の宿主細胞転写8、9、10または翻訳11に関与した。興味深いことに、Shmakov et al.4は、多くのCRISPRプロトスペーサー配列がプラスミド結合または複製4に関与する遺伝子に対応することを示している。
第4族は、とりわけ、フラビウイルス科、ピコルナビリダ科、コロナウイルス科、カルシウイルス科、およびトガウイルス科を含む。ジカウイルス(ZIKV)、西ナイル(WNV)、チクングニア(CHIKV)、重症急性呼吸器症候群ウイルス(SARS)および中東呼吸器症候群ウイルス(MERS)などのグループIVに属するいくつかの新しい新しい病原体。(+)ssRNAゲノムは本質的にmRNAの一部である。ゲノム複製に必要な酵素を作製するには、まず(+)ssRNAゲノムを翻訳する必要があります。アルファウイルスおよび他のグループIV型ウイルスでは、複製に必要な酵素が単一のポリタンパク質(すなわち、VEEVの場合はnsP1234)で産生される。非構造性ポリタンパク質(nsP)は、nsP2プロテアーゼによってタンパク質分解能処理される(nsP1234 nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)活性酵素12を生成する(図1)。nsP2プロテアーゼによるポリタンパク質の切断は、ウイルス複製に不可欠です。これは、nsP2プロテアーゼ13、14の活性部位システインの欠失および部位特異的突然変異誘発によって実証された。特に、ウイルスタンパク質の翻訳はゲノム複製イベントに先行します。例えば、nsP4は(+)ssRNAゲノムを複製するのに必要なRNA依存性RNAポリメラーゼを含む。ゲノム複製はdsRNA中間体を産生することができる。これらの中間体は、宿主の自然免疫応答を引き起こす可能性があります。したがって、これらのウイルスは、感染の早期に宿主の自然免疫応答タンパク質を切断し、その効果を抑制するために15、16、17を抑制し得る。
サイレンシングは、DNA、RNA、およびタンパク質のレベルで発生する可能性があります。図1に示す各サイレンシング機構に共通しているのは、短い外来DNA、RNA、またはタンパク質配列が、その機能に拮抗するために特定の標的の破壊を導くために使用されることです。サイレンシングメカニズムは、3つの異なる言語で書かれた「検索と削除」プログラムに似ています。短い切断部位配列は「キーワード」に類似している。各プログラムには、短いシーケンス (「キーワード」) と削除される 「ファイル」内の単語との一致を認識する酵素があります。一致が見つかると、酵素は大きなターゲット配列をカット(「削除」)します。図 1に示す 3 つのメカニズムは、ホストをウイルスから防御したり、ホストの免疫系からウイルスを防御したりするために使用されます。
ウイルスプロテアーゼは、〜2〜11アミノ酸間の短い切断部位モチーフ配列を認識します。ヌクレオチドでは、これは6〜33塩基に対応するであろう。比較のために、CRISPRスペーサー配列は〜26〜72ヌクレオチドであり、RNAiは〜20〜22ヌクレオチド18、19である。これらの配列は比較的短いが、具体的に認識することができる。アミノ酸の多様性が高いことを考えると、6~8アミノ酸以上のタンパク質配列を認識するウイルスプロテアーゼに対して、ランダム切断事象の確率は比較的低い。宿主タンパク質中のSSHHPSの予測は、検査中のウイルスプロテアーゼの特異性に大きく依存する。プロテアーゼが厳密な配列特異性要件を持っている場合、切断部位配列を見つける可能性は6400万で1/206 = 1、1/208 = 1 256億で;しかしながら、ほとんどのプロテアーゼは可変サブサイト公差を有する(例えば、RまたはKはS1部位で許容され得る)。したがって、ホストで検出されたシーケンスとウイルスの間のシーケンス ID の要件はありません。より緩い配列要件を有するウイルスプロテアーゼ(ピコルナビリダエに属するものなど)の場合、宿主タンパク質中に切断部位を見つける確率は高くなる可能性がある。表1のエントリの多くは、ピコルナビリダ科のものです。
シェヒター&ベルガー表記20は、プロテアーゼ基質およびそれらが結合するサブサイトにおける残基を記述するために一般的に使用され、我々はこの表記法を全体に利用する。生体結合のN末端である基板中の残基はP3-P2-P1と表記され、C末端である残基はP1'-P2'-P3'と表記されます。これらのアミノ酸残基を結合するプロテアーゼ中の対応するサブ部位は、それぞれS3-S2-S1およびS1'-S2'-S3'である。
標的とされている宿主タンパク質を特定するために、ウイルス性ポリタンパク質切断部位でSSHHPSを同定し、それらを含む宿主タンパク質を探します。本明細書では、既知のウイルスプロテアーゼ切断部位配列を用いてSSHHPSを同定するための手順を概説する。バイオインフォマティクス法、プロテアーゼアッセイ、および記載のシリコ法は、細胞ベースのアッセイと組み合わせて使用することを意図している。
ウイルスプロテアーゼを標的とする宿主タンパク質の配列アライメントは、これらの短い切断部位配列内の種特異的な相違を明らかにした。例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)nsP2プロテアーゼは、ヒトTRIM14、三者間モチーフ(TRIM)タンパク質6を切断することが分かった。いくつかのTRIMタンパク質は、ウイルス制限因子(例えば、TRIM5α21)であり、ほとんどがユビキチンE3リガーゼであると考えられている。TRIM14は、RING(本当に興味深い新しい遺伝子)ドメインを欠き、E3リガーゼ22であるとは考えされていません。TRIM14は、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達薬(MAVS)22においてアダプタであることが提案されているが、他の抗ウイルス機能を有していてもよい23。様々な種からのTRIM14配列のアライメントは、馬が切断部位を欠き、C末端PRY/SPRYドメインが欠落しているTRIM14の切り捨てられたバージョンを収容することを示しています。このドメインには、ポリユビキチン化サイトが含まれています (図 2)。馬では、これらのウイルスは非常に致死性(〜20〜80%の死亡率)であるのに対し、ヒトではVEEV感染24から死ぬのはわずか1%である。PRY/SPRYドメインの切断は、MAVSシグナリングカスケードを一時的に短絡し得る。このカスケードはdsRNAによって引き起こされ、インターフェロンおよび炎症性サイトカインの産生につながる。したがって、SSHHPSの存在は、どの種が特定のグループIVウイルスに対する防御システムを有するかを予測するのに有用であり得る。
グループIVウイルスでは、IFN拮抗メカニズムは冗長25を掛けると考えられている。宿主タンパク質の切断は、感染中に一過性であり、濃度は時間の経過とともに回復することがある。TRIM14切断産物は、プロテアーゼ(サイトメガロウイルスプロモーター)をコードするプラスミドでトランスフェクション(6時間)の後に非常に早期に検出できることを細胞で発見した。しかし、より長い期間では、切断産物は検出されなかった。ウイルス感染細胞では、動態が異なり、切断産物は6〜48時間6の間で検出することができた。他の人は、早期に3-6時間ポスト感染9、11として宿主タンパク質切断産物の出現を報告している。
細胞内のタンパク質分解活性は、多くの場合、捕まえるのが困難です。切断製品は、その溶解性、濃度、安定性、および寿命が変化する可能性があります。細胞ベースのアッセイでは、切断産物が細胞内に蓄積したり、切断タンパク質とカットタンパク質のバンド強度が、切断タンパク質が非常に迅速に分解され、予想される分子量(MW)でウェスタンブロットで検出できない可能性があるため、切断産物が細胞内に蓄積されると仮定することはできません(例えば、エピトープを含む領域は、他の宿主によって切断され得る)。ウイルスプロテアーゼの基質が自然免疫応答タンパク質である場合、その濃度は感染時に変化し得る。例えば、一部の自然免疫応答タンパク質は、ウイルス感染の前に存在し、インターフェロン26によってさらに誘導される。したがって、標的タンパク質の濃度は、感染中に変動し、未感染細胞リサートと感染した細胞リサートの比較は解釈が困難な場合がある。さらに、すべての細胞が均一にトランスフェクトまたは感染しないことがある。一方、大腸菌由来の精製タンパク質を用いたインビトロプロテアーゼアッセイは、免疫ブロットではなくSDS-PAGEを用いて制御やアッセイを制御する変数が少なくなっています。汚染プロテアーゼは、CFP/YFP基質のタンパク質精製の初期段階で阻害することができ、変異したウイルスプロテアーゼを精製し、切断がウイルスプロテアーゼまたは汚染細菌プロテアーゼによるものかどうかを判断するための制御として試験することができる。
インビトロプロテアーゼアッセイの1つの制限は、哺乳動物細胞の複雑さを欠いているということです。酵素がその基質を切断するには、2つを共に局在させる必要があります。第4族ウイルスプロテアーゼは構造と局在化が異なる。例えば、ZIKVプロテアーゼは小胞体(ER)膜に埋め込まれ、細胞質に面するのに対し、VEEV nsP2プロテアーゼは細胞質および核27中の可溶性タンパク質である。ZIKV SSHHPS分析で見つかった切断部位配列のいくつかは、いくつかの標的に対して切断が共翻訳で起こりう可能性があることを示唆するシグナルペプチドにあった。したがって、細胞内のプロテアーゼおよび基質の位置も、これらの分析において考慮する必要がある。
細胞ベースのアッセイは、感染において同定された宿主タンパク質の役割を確立するために貴重であり得る。プロテアーゼ阻害剤6または宿主標的16への突然変異などの宿主タンパク質のウイルスプロテアーゼ切断を停止することを目的とする方法は、ウイルス複製に対するそれらの影響を調べるために使用することができる。標的タンパク質の過剰発現はまた、ウイルス複製28に影響を及ぼし得る。プラークアッセイまたは他の方法は、ウイルス複製を定量するために使用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

アルファウイルス酵素は、単一のポリペプチド中で合成される。非構造性ポリタンパク質(nsP)は、ウイルス複製に不可欠な活性酵素を生成するために、そのnsP2システインプロテアーゼによって処理されます。ウイルスプロテアーゼは、非常に特異的であり、保存された切断部位モチーフ配列(〜6〜8アミノ酸)を認識する。いくつかのグループIVウイルスでは、nsPプロテアーゼ(複数)切断部位モチーフ配列は、自然免疫応答の生成に関与する特定の宿主タンパク質で見つけることができ、場合によっては、標的タンパク質がウイルス誘発表現型に関連しているように見える。これらのウイルスは、相同な宿主病原体タンパク質配列(SSHHPS)の短いストレッチを利用して、宿主タンパク質の標的破壊を行う。SSHHPSを同定するために、ウイルスプロテアーゼ切断部位モチーフ配列をBLASTに入力することができ、宿主ゲノムを検索することができる。切断は、最初に大腸菌で作られた精製nsPウイルスプロテアーゼおよび蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)基質を用いて試験することができる。FRET基質は、シアンおよび黄色蛍光タンパク質および切断部位配列(CFP配列-YFP)を含む。このプロテアーゼアッセイは、プレートリーダーで連続的に使用することも、SDS-PAGEゲルで不連続に使用することもできます。結合ペプチド基質のモデルは、基質選択および突然変異誘発研究を導くためにシリコで生成することができる。CFP/YFP基質は、プロテアーゼ阻害剤を同定するためにも利用されている。これらのin vitroおよびin silico法は、標的宿主タンパク質がウイルス複製に影響を与えるかどうかを決定するために、細胞ベースのアッセイと組み合わせて使用することができます。

ZIKV ns2B/3プロテアーゼのSSHHPS分析は、4つの宿主タンパク質標的を同定した:FOXG1、SFRP1、網膜cDNAライブラリーからのGsアルファサブユニット、およびNT5Mミトコンドリア5',3'-核体質体素(図10)6。特に、ZIKVプロテアーゼの潜在的な標的としてこれらのタンパク質を予測した他の方法は他になかった。FOXG1遺伝子の突然変異は、小頭症などの発達障害および構造脳異常を特徴とする先天性症候群に関連している。SFRP1は分泌されたフリル関連タンパク質(SFRP);。これらの可溶性受容体は、Wntリガンドを拮抗し、Wntシグナル伝達を阻害するために競合的に結合することができます。Wntシグナル伝達経路は、フラビウイルス感染36時のIFN応答の調節に関与する。SFRP1の切断は、フラビウイルス複製を増強することが期待されるであろう。SFRP1はまた、Th17細胞分化37に関与する。SSHHPSの配列アライメントは、切断部位配列における種特有の差異を示した(図10D)。SFRP1の切断部位配列は、ヒトとニワトリにおいて同一であった。ZIKVは、鶏胚における死亡率および小頭症を誘発することができる38.げっ歯類では、高度に保存されたP1残基(K/R)R↓Gはグリシン(RGG)によって置換される。マウスの免疫担当株は、一般にZIKV感染および疾患39に対して耐性である。
定常状態運動パラメータおよび阻害定数は、プレートリーダー31、40、41における連続アッセイを用いたウイルスポリタンパク質配列および宿主タンパク質配列について測定することができる(図11A)。特定の配列の切断や種々の化合物によるプロテアーゼの阻害などの定性的切断情報については、不連続アッセイを用いることができる(図11B)。
CFPとYFPの間の残基数の最適化が必要な場合があります。基板結合モデルは、in silicoメソッドを使用して行うことができます。nsP1/nsP2ジャンクションの代表的なドッキングモデルを図9に示します。VEEV nsP2プロテアーゼについて、12アミノ酸セムリキ森林ウイルス(SFV)配列の切断が報告されていた(Km=0.58mM)33.基板配列を19、22、および25残基に延長し、緩衝液のイオン強度を低下させ、Kmの有意な減少につながった。VEEV nsP2結晶構造および結晶パッキングの検討はまた、接合片の一部がプロテアーゼドメインに対して充詰され、らせらであることを示した。したがって、VEEV基板が長いほど、二次構造モチーフの認識によりより良く結合し得る。
TRIM14については、Km =21μM6、33を得た。宿主タンパク質配列を担持する基質のKmは、ウイルスポリタンパク質切断部位配列(Km(V12)=12μM及びKm(V34)=21μM)を含む基質のKm値に匹敵した。nsP1/nsP2、nsP2/nsP3、nsP3/nsP4ジャンクションの切断サイトシーケンスは、異なる効率で切断されました。細胞において、これはポリタンパク質42の逐次切断を可能にすると考えられている。
否定的な結果を解釈する際には注意が必要です。切断が発生しない場合、切断部位が短すぎるか、精製されたプロテアーゼが不活性である可能性があります。切断された基質の場合、ウイルス感染細胞における全長タンパク質の切断または切断を確認するために、追加の実験が必要である。適切なフォローオン実験を選択する必要があります。標的タンパク質の過剰発現またはサイレンシングがウイルス複製に及ぼす影響も試験することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> 図 1: サイレンシングの 3 つのメカニズムサイレンシングは、DNA、RNA、またはタンパク質のレベルで発生する可能性があります。これらの「検索と削除」アルゴリズムは、それぞれ「キーワード」を使用して、単語を含むファイルの切断を指示します。この図は、モラッツァーニら32およびその中の参照から改変された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> 図2:切断部位配列における種特異的な相違点TRIM14ホモローグのC末端PRY/SPRYドメインがアライメントに表示されます。PRY/SPRYドメインは、グレーで強調表示された保存モチーフによって識別できます。ヒトTRIM14は、VEEV nsP2システインプロテアーゼによってQEAGA↓Gで切断される。SSHHP シーケンスは色で表示されます。緑色の残基はP1'残基です。青色ではP4残基であり、赤色では切断部位モチーフ配列内の他の保存残基である。馬はPRY/SPRYドメインを欠いているTRIM14の切り捨てられたバージョンを港。シアンで強調されたリジンは、ポリユビキチン化され、MAVSシグナルソームの組み立てにとって重要です。C末端PRY/SPRYドメインは、急性ウイルス感染時に細胞内で宿主の抗ウイルス応答を損なうためにnsP2プロテアーゼによって一時的に切断され得る。馬では、このドメインは常に存在しません。これは、TRIM14のPRY/SPRYドメインがVEEV感染に対する保護機能を有する可能性があることを示唆している。この図はモラザンニら6から再現されています 6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> 図3:BLASTを使用したSSHHPS識別VEEV nsP1/nsP2接合部における切断部位モチーフ配列は、ホストタンパク質TRIM14のSSHHP配列と整列される。緑色で着色された残基はP1'残基です。青色ではP4残基であり、赤色では切断部位モチーフ配列の他の保存残基である。ほとんどのアライメントは、保存された切断部位モチーフの外側の領域に相同性を含んでいたか、P1/P1の生体結合残基を含みませんでした。TRIM14は、P1及びP1'を含む順次6残基との一致を示した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> 図4:VEEV nsP2システインプロテアーゼに対するCFP-V12-YFP基質のタンパク質およびDNA配列。NdeI (CATATG) および XhoI (CTCGAG) の制限サイトは大文字で示されています。赤色では、nsP1とnsP2の間にあるウイルスポリタンパク質からの切断部位配列である。緑色の残基はP1'残基であり、青色では切断部位のP4残基である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> 図5:Trx-VEEV-nsP2システインプロテアーゼ構築物のタンパク質配列。チオレドキシン(Trx)は黄色で示されている。トロンビン切断部位とヒスタグはシアンで示されている。サイス・ヒス・ダイアドには赤いラベルが付いています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> 図6:MOEにおけるペプチド構造<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> 図7:PyRx/オートドックを用いた基質ペプチドのドッキング<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> 図 8: Biowulf クラスターで実行されているジョブ<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> 図9:nsP1/nsP2接合部における切断部位配列を含むVEEV P12基板のモデル。Cys-477/His-546触媒ダイアドは青色で表示されています。図はピモール(https://pymol.org)を用いて作製した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> 図10:ジカウイルスns2B/ns3プロテアーゼのSSHHPS解析(A)ZIKV ns2B/ns3プロテアーゼの宿主タンパク質標的を予測した。赤色の残基は、単一の切断部位配列と一致する。緑色の残基は、サブサイトで許容され、他の切断部位の残基と一致する。SFRP1は連続した順序で同一残基の数が最も多かった。(B)CFP基質-YFPタンパク質(〜50〜60kDa)を発現し、各宿主タンパク質(ヒト)からの予測SSHHP配列を含む精製した。ZIKVプロテアーゼは、網膜cDNAライブラリーから分離されたヒトFOXG1、SFRP1、NT5MおよびGsアルファサブユニットを切断した。切断製品は約28-30 kDaです。基質配列は、Morazzani etal. 6 (C) ns2B/ns3プロテアーゼカットSFRP1では利用可能であるが、そのホモローグ(SFRP2およびSFRP4)を切断しなかった。(D)異なる動物種からの切断部位のアライメントは、グループIVウイルスの動物モデルを選択する際に有用であり得る。保存されたR↓G配列は、SFRP1におけるヒトとげっ歯類の間で異なであることに注意してください。モラッツァーニら6から再現された図<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">はこちらをクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> 図11:連続および不連続アッセイを用いた定常運動解析。(A) 表5に示す運動データをGraFitにプロットした。差し込みは、ラインウィーバーバークプロットを示しています。(B)CFP-V12-YFP基板の切断産物を示すSDS-PAGEゲル。レーン1では「UNCUT」基板(48kDa)である。レーン2では「CUT」基板(31kDa及び27kDa)である。レーン3〜9では、その阻害活性を試験するために異なる化合物が含まれていた。レーン4にはE64d共有阻害剤が含まれている。これらの反応を室温で〜17時間一晩行った。鋭いバンディングパターンを達成するためにサンプルの沸騰が必要であった。nsP2プロテアーゼは酵素を含む反応では(56kDa)見えるが、レーン1には見えない。レーン1は「酵素なし」対照である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

ウイルス性ポリタンパク質に埋め込まれた相同な宿主病原体タンパク質配列(SSHHPS)の短いストレッチを同定するための一般的なプロトコルを提示する。SSHHPSはウイルスプロテアーゼによって認識され、いくつかのグループIVウイルスによって特定の宿主タンパク質の標的破壊を指示する。

インビトロ法とインシリコ法を用いた第IV族ウイルスSSHHPSの解析

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

我々は、グループIVウイルスゲノムが宿主タンパク質配列の短い伸びをコードすることを示した。これらの配列は、ウイルス性プロテアーゼ切断部位内に見つけることができる。彼らは、宿主タンパク質の標的破壊、典型的には免疫応答の生成に関与するタンパク質に使用されています。プロテアーゼアッセイを使用する主な利点は、細胞の複雑さを除去し、ウイルスプロテアーゼが特定の配列を切断できるかどうかを示すということです。そこでジカSSHHPS配列を分析したところ、プロテアーゼは免疫応答の生成に関与するタンパク質の配列を切断することができ、これらのタンパク質のいくつかは脳と眼の発達にも役割を果たしていることがわかりました。この技術を初めて行う場合、切断が観察されない場合、プロテアーゼの活性などの様々な要因による可能性があることを覚えておくべきである。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるジェイミー・コンプトンです。プロテインBLASTを開き、scissile結合とウイルス性ポリタンパク質を取り巻く20個のアミノ酸を入れ、非冗長タンパク質配列を選択して、検索する宿主ゲノムに入力します。必要に応じて、PHI-BLAST を選択し、角括弧が、ブラケット内のいずれかのアミノ酸が代替位置に配置できることを示すパターンシーケンスを入力し、BLAST をヒットします。ランクは、切断部位のシーケンスに一致する連続した同一または許容残基の数に基づいてBLASTヒットを順序付けます。リストから、プロテアーゼアッセイで分析するために6つ以上の同一または類似の残基を含むタンパク質を選択します。シアン蛍光タンパク質をコードするプラスミドを構築し、切断配列の最大25個のアミノ酸、および黄色の蛍光タンパク質を構築する。次に、CFPおよびYFP基質を、一晩培養した25ミリリットルの4つのフラスコを接種して調製する。37°Cで文化を振り、600ナノメートルのUV-Vis分光法によって毎時成長を監視します。細菌が約1の吸光度に達したら、各フラスコに1つのモルIPTGの0.5ミリリットルを加えることによってタンパク質発現を誘導し、次に振れるインキュベーターの温度を摂氏17度に下げ、17〜20時間一晩続けることを可能にする。翌日、摂氏4度で10分間7000倍gで遠心分離して細菌をペレット化する。液体培地を取り出して捨て、ペレットをマイナス80度で保存するか、細胞のリシスを進めます。細胞を融解するには、原稿の方向に従って100ミリリットルのリシスバッファーを調製し、バッファー内のペレットを再中断し、25〜25ミリリットルの懸濁液を50ミリリットルの使い捨て円錐形チューブに移す。氷水でプラスチックビーカーにチューブを入れ、先端がチューブの底から約1センチメートルになるように超音波処理器の先端をチューブに挿入し、溶解物が液体になるまで10〜20回超音波処理します。超音波処理後、リセートを高速遠心管に移し、摂氏4度で30分間20、500 x gの遠心分離機を行います。上清をきれいなボトルに移し、ペレットを捨てます。溶液をニッケルカラムに積み込み、2カラムの体積のバッファAでカラムを洗浄し、続いて20%バッファBの5カラム体積を洗浄し、280ナノメートルでの吸光度は、洗浄中に280ナノメートルの吸光度が増加し、そのカラムから溶出して溶出します。A280がベースライン値に戻るまで洗浄を続けます。その後、100%バッファーBの2〜3カラム体積でタンパク質を溶出し、10ミリリットルの分画を収集し、各画分のA280を測定することを確認します。原稿の方向に応じて8つの反応ミックスを準備し、各ミックスのピペット45マイクロリットルは、黒いハーフエリア96ウェルプレートの各行の最初の3つの井戸に入ります。固定のフォトマルチプライヤチューブ設定で2つの波長での花相の同時検出用プレートリーダーを設定します。1分に1回読み取りで20〜30分に読み取り時間をプログラムし、読み取る井戸を選択します。プレートを機械に挿入し、読み取りを開始し、時間の経過に対する放出比を監視します。ノーカット基板を含むプレートの終点読み取りを実行します。プレートを取り出し、各井戸に酵素の5マイクロリットルをピペット。最初の列を切り取りなしコントロールとして保存できます。その後、プレートを20〜30分間読み返し、プレートリーダーに絶対値を出力するように設定します。読み取りが完了したら、プレートをフィルムで密封して蒸発を防ぎ、室温で一晩放置して酵素が基質を完全に切断できるようにします。24時間後、フィルムを取り出し、プレートの終点読み取りを行います。放出比率を平均し、カットとして記録します。SDS-PAGEを用いて基板の切断を確認する。分子量マーカーを最初または最後のレーンにロードし、各反応混合物の5マイクロリットルをゲルのレーンにロードし、ノーカット反応から始めます。ゲルタンクの電極を電源に取り付け、110ボルトで60分間実行します。割れるツールを使用してカセットからゲルを取り出し、5〜10ミリリットルの染色溶液に沈めます。1~24時間後、余分な汚れを取り除き、ゲルを水に沈めます。次に、ゲルイメージャーを使用してゲルの写真を撮ります。タンパク質構造を調製するには、タンパク質PDBファイルをMOEにロードします。[選択と溶媒]をクリックし、溶媒を削除します。コンピュートトップメニューバーから構造pの準備パネルを開き、自動的に[修正]をクリックして、すべての構造項目を修正します。「プロトネイト 3D」をクリックして、構造をプロトネーションします。部分電荷パネルを開き、必要に応じて「AMBER 99」と「水素と孤独なペアを調整」を選択して、タンパク質に部分的な電荷を追加します。次に、構造ファイルを保存します。基質ペプチドとTRIM14の構造を構築するには、プロテインビルダーパネルを開き、基質配列を入力し、自動再パックを選択します。次に、[ジオメトリ]を[拡張]に設定し、[構築]をクリックします。最後に、構造を最小化し、PDB ファイルとして保存します。PyRx AudoDock 4.2ソフトウェアを使用して、基板ペプチドをVEEV-nsP2にドッキングします。タンパク質をロードし、名前を右クリックして[マクロ分子を作る]を選択してPDBQTドッキングファイルを準備します。次に基質分子をロードし、「リガンドを作る」を選択してリガンドドッキングファイルを準備します。下部のドッキングパネルで AutoDock ウィザードを起動し、準備したリガンドとタンパク質ファイルを選択します。グリッド寸法を手動で調整してタンパク結合ポケットを定義し、AuotGridを実行します。次に、AutoDockを実行し、ラマルキアン遺伝的アルゴリズム法を選択します。[ドッキング パラメータ] をクリックし、GA 実行数を 50 に設定し、[転送] をクリックしてドッキングの実行を開始します。AutoDock が完了したら、[結果の分析] パネルを開き、予測されるすべてのバインド ポーズを調べます。切断部位上のcis-477と基板との間の最も低い予測結合エネルギーと合理的な結合相互作用を持つ最良のモデルを選択し、さらにMDシミュレーションのためにPDBファイルとして保存します。AutoDock でバインド ポーズを読み取った後、ドッキング後の解析を実行して、MD シミュレーションで絞り込むための妥当なバインド モデルを特定することが重要です。このプロトコルは、ジカウイルスns2B/3プロテアーゼ中の相同の宿主病原タンパク質配列またはSSHHPSの短いストレッチを見つけるために使用された。4つの宿主タンパク質標的が同定された。FOXGS、SFRP1、retinal cDNAライブラリからのGsαサブユニット、およびNT5Mミトコンドリア5'3'ヌクレオチダーゼ。SSHHPSの配列アライメントは、切断部位配列における種特異的な違いを認めた。SFRP1配列は、ジカウイルスが鶏の胚の死亡率と小頭症を誘発することができるので注目に値するヒトと鶏で同一であった。連続アッセイは、ウイルスポリタンパク質配列に対する定常運動パラメータおよび阻害定数を測定するために使用され、不連続アッセイは、特定の配列の切断または様々な化合物によるプロテアーゼの阻害などの質的切断情報を得るために使用した。ベネズエラの馬脳炎nsP1-nsP2接合のモデルは、シリコ法を用いて作られた。nsP2プロテアーゼの場合、基質配列を長くし、バッファーのイオン強度を低下させることで、セムリキフォレストウイルス配列のミカリス定数の切断が大幅に減少した。この手順を実行するときは、コントロールを実行することが重要です。ウイルスプロテアーゼ切断部位配列を含む基質は、SSHHPS配列解析を進める前に試験する必要があります。宿主タンパク質の切断が観察された場合、宿主タンパク質がウイルス複製に影響を及ぼすことを確認するためにフォローアップ実験を行う必要があります。これは、タンパク質を過剰発現またはサイレンシングし、ウイルス複製への影響を調べることによって行うことができます。グループIVには、新しい病原体と新興病原体が多数含まれています。SSHHPS配列は、特定の宿主タンパク質および経路をウイルスプロテアーゼと非常に予測可能な方法で結びつける。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em&gt;インビトロ</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための<em&gt;バークホルデリア</em&gt;種

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

治療抗体間の標的結合およびCDC誘導を比較するためのインビトロ法：Biosimilarity Analysisにおける応用

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

低コピーの検出数は B 型肝炎感染培養によって形成された統合ウイルス DNA

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...