Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Defense Threat Reduction Agency (DTRA) prosjektnumre CB-SEED-SEED09-2-0061 og CBCall4-CBM-05-2-0019, og delvis av intramural/ekstra forskningsprogram av NCATS, NIH (XH) og Naval Research Laboratory base fond.

De synspunktene her er de av forfatterne og representerer ikke de av den amerikanske marinen, US Army, US Department of Defense, eller den amerikanske regjeringen, eller den amerikanske regjering.

Sekvens-spesifikk ødeleggelse av et protein eller en nukleinsyre syre guidet av en utenlandsk sekvens er bare sett i noen tilfeller i biologi. Mekanismene som vises i figur 1 er defensive mekanismer som beskytter en vert fra et virus, eller et virus fra en vert.
Bruke Bioinformatic metoder vi kan identifisere de målene som er ødelagt av disse systemene. I vår analyse av SSHHP sekvenser, oppdaget vi at mange av dem kunne finnes i proteiner som trengs for å generere medfødte immunresponser. Noen hadde åpenbare roller som Mavs og TRIF (tir-domene-som inneholder adapter-inducing interferon-β), mens andre var relatert til immunitet om mer komplekse mekanismer (f. eks histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Målet informasjon som er lagret i SSHHP sekvensen har potensial til å identifisere trasé som har antivirale effekter mot disse virusene. Antivirale responser i Vivo er ofte virus spesifikke26,43. For eksempel, delsett av trim proteiner har antivirale effekter på ulike virus43,44,45, noen er viral begrensning faktorer (f. eks, HIV og TRIM5α). Det spesielle ved trim proteiner (~ 70 har blitt identifisert) fortsatt blir undersøkt44,45. Informasjonen innen SSHHPS kan bidra til vår forståelse av hvordan disse virusene unngå medfødte immunresponser. Andre mønstre og sammenhenger kan bli avdekket som mer SSHHPS er undersøkt.
Det var tydelige forskjeller i arten i analysene våre (figur 2, Figur 10). Disse virusene er kjent for å påvirke noen arter mer enn andre. Informasjon om vertsområde, verts mottakelighet og verts beskyttelse kan være til stede i SSHHPS. For eksempel, equine, den mest mottakelige arter til Equine Encefalitt virus, manglet regionen menneskelige TRIM14 som ble midlertidig kuttet av VEEV nsP2 protease. Mennesker sjelden dør av VEEV infeksjoner, men kan være infisert24. Den menneskelige TRIM14 protein gjennomført en nsP2 protease kløft sekvens6. Tilstedeværelsen av kløft stedet tyder på at mennesker har en forsvarsmekanisme mot disse virusene. Fugler har vært antatt å være potensielle reservoarer av disse virusene46. Den tilsvarende SSHHP sekvensen i TRIM14 protein fra kyllinger forskjellig fra sekvenser som finnes i mennesker og andre arter. Subtile forskjeller som dette kan gjøre en mål vert protein uncleavable eller lettere kløyvde. Aguirre et al.16 viste at en UNCLEAVABLE mutert streng protein indusert høyere nivåer av IFN etter Dengue virus infeksjon og at mus naturlig bære en versjon av STING som ikke er kuttet av Dengue ns2B3 protease. Det murine STING proteinet ble ikke kuttet av ZIKV protease47. I vår SSHHPS analyse observerte vi også forskjeller i ZIKV protease kløft side sekvenser når vi sammenlignet de menneskelige proteinene med de av gnagere6 (Figur 10D). Gjengivelse av arter-spesifikke proteolytiske splittelsene av verten proteiner kan være viktig i dyremodeller som brukes for gruppe IV virus. Den hemming av verten protein kløften har også implikasjoner med hensyn til utvikling av gruppe IV protease hemmere. I vår forrige utgivelse, viste vi at vi kunne hemme TRIM14 kløft av VEEV nsP2 protease bruker CA074 methyl ester6. Dette resultatet tyder på at små molekyl hemmere av disse proteaser kan være i stand til å modulere de medfødte immunresponser som er i stand til å undertrykke infeksjonen6,31.
Genetisk variasjon i en Art har også potensiale til å produsere forskjeller i proteolytiske kløft. Subtile forskjeller i Codon bruk kan påvirke ribosom pause48. Siden noen gruppe IV virale proteaser er innebygd i ER-membranen, kan forskjellene i disse pauser påvirke kløften av et mål hvis kløften oppstår translationally. Noen av kløften områder som vi identifiserte var i spådd signal peptid sekvenser (f. eks SFRP1) mens andre var interne.
SSHHPS analyse kan produsere informasjon som avviker fra andre metoder for vert protein analyser. SSHHPS analyse var billig og enkel å ansette. Bruken av et bakteriell uttrykks system tillot testing av korte segmenter (~ 25 aminosyrer) av pattedyr sekvenser uten bruk av pattedyr cellekultur. Vi fant at CFP-YFP underlag var i stand til å tolerere alle de testede menneskelige protein sekvenser; imidlertid gir varierte. I lignende analyser, underlag som inneholder menneskelige protein sekvenser så lenge som 63 aminosyrer ble vellykket uttrykt, renset, og benyttet for kinetisk analyser og hemmer screening49,50,51. Siden bare små mengder av underlaget er nødvendig for usammenhengende analysen, kan et stort antall mål utforskes. En fordel med systemet er at CFP/YFP underlag kan brukes til SDS-side analyser og for mer forseggjort kinetisk analyser (dvs. IC50, ki, km, VMax). For narkotika oppdagelse kan hemmende stoffer produsere artefakter i fluorescerende analyser. Således, den usammenhengende analysen i kombinasjon med en kontinuerlig analysen tillater en å bekrefte kløft eller hemming av kløft. Prøvene for den usammenhengende SDS-PAGE-analysen kan tas direkte ut av 96-brønn platene. CFP/YFP underlag har blitt brukt til sammensatte biblioteket screening52. Det er imidlertid nødvendig med flere analyser for å avgjøre om et substrat er egnet for screening med høy gjennomstrømning, for eksempel beregning av en Z-faktor53.
En utfordring i å designe et substrat er å identifisere regionen rundt scissile bånd som er bundet og anerkjent av protease. I eksemplene som vises her, begynte vi med 12 rester sekvenser som var sentrert rundt scissile obligasjon. Etter å ha analysert sekvens justering av kløften nettsteder homologi til rester N-Terminal av scissile bindingen ble funnet for VEEV protease, mens for ZIKV protease homologi til flere av C-terminalen rester ble funnet. En i silisiummangan modell av forankret underlaget kan brukes til å designe site-regissert mutagenese eksperimenter som sonde bindingen områder av underlaget. Siden underlaget og enzymet sekvenser er på plasmider, enten kan være mutert til å teste i silisiummangan modeller eller sekundært område toleranser. Dette kan være en fordel hvis en krystallstruktur av bundet substrat (er) ikke er tilgjengelig.
SSHHPS analyse kan også gi ny informasjon om de mekanismer som virus-indusert fenotyper er produsert av viral enzymer. En av de ZIKV mål, SFRP1, er en del av wnt signalering Pathway og har roller i både hjerne og øye utvikling og i immunresponser36,37,54,55,56,57. Vi fant at de andre protein sekvenser som kunne kuttes av ZIKV ns2B/ns3 protease var også i proteiner involvert i hjerne-og øye utvikling; unormalt i begge har blitt observert i medfødt Zika syndrom og antas å være en del av viruset-indusert fenotype58.
Den forutsigbarhet av verts-patogen interaksjoner kan utnyttes for en rekke bruksområder: Target-spesifikke oncolytic viral terapi; de-risikere levende virusvaksiner; raffinement, prediksjon eller valg av dyremodeller; prediksjon av Host-Range eller mottakelighet; prediksjon av zoonotiske hendelser; og prediksjon av Host-forsvar. Siden metodene som beskrives er sekvens BAS ert, kan de være av verdi å innlemme i programvare i fremtiden.

Bevis for horisontal genoverføring fra virus til vert, eller vertskap for virus, finnes i en rekke genomer1,2,3,4. Eksempler på viral endogenization er CRISPR spacer sekvenser funnet i bakteriell vert genomer4. I den seneste tid, vi har grunnlegge bevis av vert protein sekvenser lagt ned i inne det nonstructural polyproteins av (+) ssRNA gruppe IV viruser. Disse sekvensene innenfor koding regioner av viral Genova kan spres generationally. Den korte strekninger av homologe Host-patogen protein sekvenser (SSHHPS) er funnet i viruset og Host5,6. SSHHPS er den bevarte kløften området motiv sekvenser anerkjent av viral proteaser som har homologi til bestemte vert proteiner. Disse sekvensene direkte ødeleggelsen av bestemte vert proteiner.
I vår forrige utgivelse6, vi samlet en liste over alle de vert proteiner som ble målrettet av viral proteaser og fant at listen over mål var ikke tilfeldig (tabell 1). To trender var åpenbare. For det første, flertallet av viral proteaser det kutt vert protein tilhørte gruppe IV viruser (24 av 25 sakene involvert gruppe IV viral proteaser), og ettall protease tilhøre å det (+) ssRNA gruppe VI retroviruses (HIV, Human immunsviktvirus)7. For det andre, verten protein mål blir kuttet av viral proteaser var generelt involvert i å generere medfødte immunresponser antyder at splittelsene var ment å antagonize vertens immunresponser. Halvparten av verten proteiner målrettet av viral proteaser var kjent komponenter av signalering kaskader som genererer interferon (IFN) og proinflammatoriske cytokiner (tabell 1). Andre var involvert i Host Cell transkripsjon8,9,10 eller oversettelse11. Interessant, Shmakov et al.4 har vist at mange CRISPR protospacer sekvenser tilsvarer gener involvert i plasmider Bøyning eller replikering4.
Gruppe IV omfatter blant annet hvilken, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae og Togaviridae. Flere nye og framvoksende patogener tilhører gruppe IV som Zika-viruset (ZIKV), West Nile (WNV), Chikungunya (CHIKV), alvorlig akutt respiratorisk syndrom virus (SARS) og Midtøsten respiratorisk syndrom virus (MERS). Det (+) ssRNA Genova er i all vesentlighet en stykke mRNA. Å tilvirke det enzym på krevd for Genova replikering, det (+) ssRNA Genova for det første må være oversatt. I alphaviruses og andre gruppe IV-virus produseres enzymene som er nødvendige for replikering i en enkelt polyprotein (dvs. nsP1234 for VEEV). Nonstructural polyprotein (nsP) er proteolytically behandlet (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) av nsP2-protease for å produsere aktive enzymer12 (figur 1). Kløft av polyprotein av nsP2 protease er avgjørende for viral replikering; Dette har blitt demonstrert ved sletting og site-regissert mutagenese av det aktive nettstedet cystein av nsP2 protease13,14. Spesielt, oversettelsen av viral proteiner foran Genova replikering hendelser. NsP4 inneholder for eksempel den RNA-avhengige RNA-polymerase som trengs for å replikere (+) ssRNA-Genova. Genova replikering kan produsere dsRNA mellom produkter; disse mellom produkter kan utløse vertens medfødte immunresponser. Dermed kan disse virusene holde vert medfødt immunrespons proteiner tidlig i smitte for å undertrykke sine effekter15,16,17.
Å stanse kan forekomme på DNA-, RNA-og protein nivået. Det som er felles for hver av mekanismene for deaktivering som vises i figur 1 , er at korte, utenlandske DNA-, RNA-eller protein sekvenser brukes til å lede ødeleggelsen av bestemte mål for å antagonize deres funksjon. Mekanismene for demping er analoge til «søk og slett»-programmer som er skrevet på tre forskjellige språk. Den korte kløften området sekvensen er analogt til et "søkeord". Hvert program har et enzym som anerkjenner kampen mellom den korte sekvensen ("søkeordet") og et ord i "fil" som skal slettes. Når en kamp blir funnet, enzymet kutt ("sletter") den større mål sekvensen. De tre mekanismene som vises i figur 1 brukes til å forsvare verten mot virus, eller til å forsvare et virus fra en vertens immunsystem.
Viral proteaser anerkjenner kort kløft nettsted motiv sekvenser mellom ~ 2-11 aminosyrer; i nukleotider, ville dette tilsvare 6-33 baser. Til sammenligning er CRISPR spacer sekvenser ~ 26-72 nukleotider og RNAi er ~ 20-22 nukleotider18,19. Selv om disse sekvensene er relativt korte, kan de bli gjenkjent spesifikt. Gitt høyere mangfold av aminosyrer, sannsynligheten for en tilfeldig kløft hendelse er relativt lav for en viral protease gjenkjenne protein sekvenser av 6-8 aminosyrer eller lengre. Prediksjon av SSHHPS i vert proteiner vil i stor grad avhenge av spesifisitet av viral protease blir undersøkt. Hvis protease har strenge sekvens spesifisitet krav muligheten til å finne en kløft området sekvensen er 1/206 = 1 i 64 000 000 eller 1/208 = 1 i 25 600 000 000; imidlertid har de fleste proteaser variable toleranser (f.eks. R eller K kan tolereres på S1-nettstedet). Følgelig er det ingen krav til sekvens identitet mellom sekvensene funnet i verten versus viruset. For viral proteaser som har løsere sekvens krav (for eksempel de som tilhører Picornaviridae) sannsynligheten for å finne en kløft sted i en vert protein kan være høyere. Mange av oppføringene i tabell 1 er fra Picornaviridae -familien.
Schechter & Berger-notasjon20 brukes vanligvis til å beskrive restene i et protease substrat og de sekundære områdene som de binder, vi bruker denne notasjonen gjennom. Rester i underlaget som er N-Terminal av scissile Bond er betegnet som P3-P2-P1 mens de som er C-terminal er betegnet som P1'-P2'-P3 '. De tilsvarende sekundære områdene i protease som binder disse aminosyre-restene, er henholdsvis S3-S2-S1 og S1'-S2'-S3.
For å finne ut hvilken vert proteiner blir målrettet, kan vi identifisere SSHHPS i viral polyprotein kløften områder og søke etter verten proteiner som inneholder dem. Heri, skisserer vi prosedyrer for å identifisere SSHHPS bruke kjente viral protease kløft site sekvenser. De Bioinformatic metodene, protease analysene og silisiummangan metodene som er beskrevet, er ment å brukes sammen med cellebasert analyser.
Sekvens justering av verten proteiner målrettet av viral proteaser har avdekket arter-spesifikke forskjeller innenfor disse korte kløft området sekvenser. For eksempel, den venezuelanske Equine Encefalitt virus (VEEV) nsP2 protease ble funnet å kutte menneskelige TRIM14, en tre parts motiv (TRIM) protein6. Noen TRIM proteiner er viral begrensning faktorer (f. eks TRIM5α21), de fleste antas å være ubiquitin E3 ligases. TRIM14 mangler en RING (veldig interessant nytt gen) domene og er ikke antatt å være en E3 ligase22. TRIM14 har blitt foreslått å være en adapter i mitokondrie antiviral signalosome (MAVS)22, men kan ha andre antivirale funksjoner23. Justering av TRIM14 sekvenser fra ulike arter viser at equine mangler kløften området og havnen en avkortet versjon av TRIM14 som mangler C-terminal SNUSE/SPRY domene. Dette domenet inneholder et polyubiquitination område (figur 2). I equine, disse virusene er svært dødelige (~ 20-80% dødelighet), mens i mennesker bare ~ 1% dør av VEEV infeksjoner24. Kløft av det SNUSE/SPRY domenen kanskje midlertidig kort kretsløpet det MAVS signal Cascade. Dette Cascade kan utløses av dsRNA og fører til produksjon av interferon og Pro-inflammatorisk cytokiner. Dermed kan tilstedeværelsen av SSHHPS være nyttig for å forutsi hvilke arter som har forsvarssystemer mot bestemte gruppe IV virus.
I gruppe IV virus, IFN motsetningen mekanismer antas å være multiplisere redundant25. Vert protein kløft kan være forbigående under smitte og konsentrasjoner kan komme seg over tid. Vi fant i celler som TRIM14 kløft produkter kunne oppdages svært tidlig etter transfeksjoner (6 h) med en plasmider koding av protease (Cytomegalovirus promoter). Men i lengre perioder ble ikke kløft-produktene oppdaget. I virus-infiserte celler, Kinetics var forskjellige og kløft produkter kunne oppdages mellom 6-48 h6. Andre har rapportert utseendet på Host protein kløft produkter så tidlig som 3-6 h post infeksjon9,11.
Proteolytiske aktivitet i cellene er ofte vanskelig å fange; mat fra kløften kan variere i løselighet, konsentrasjon, stabilitet og levetid. I celle-baserte analyser det kan ikke antas at kløft produkter vil akkumuleres i en celle eller at bandet intensitet av kutt og Uncut protein vil vise kompenserende øker og avtar som kutt protein kan bli degradert svært raskt og kan ikke være synlig i en vestlig blot på en forventet molekylvekt (MW) (f. eks regionen inneholder epitope kunne kløyvde av andre vert proteaser eller kan være ubiquitinated). Hvis underlaget av viral protease er en medfødt immunrespons protein, konsentrasjonen kan variere under infeksjon. For eksempel, noen medfødt immunrespons proteiner er til stede før viral infeksjon og er indusert ytterligere ved interferon26. Konsentrasjonen av målet protein kan derfor svinge under infeksjon og sammenligning av infisert vs infisert celle lysater kan være vanskelig å tolke. I tillegg kan alle celler ikke være jevnt transfekterte eller infisert. In vitro protease analyser ved hjelp av renset proteiner fra E. coli på den annen side har færre variabler som å kontrollere og slike analyser kan gjøres ved hjelp av SDS-side i stedet for immunoblots. Forurensende proteaser kan bli hemmet i de tidlige trinnene av protein rensing av CFP/YFP substrat, og mutert viral proteaser kan renses og testes som kontroller for å avgjøre om kløften skyldes viral protease eller en forurensende bakteriell protease.
En begrensning av in vitro protease analyser er at de mangler kompleksiteten av en pattedyr celle. For et enzym for å kutte sitt substrat, må de to være co-lokaliserte. Gruppe IV viral proteaser varierer i struktur og lokalisering. For eksempel er ZIKV-protease innebygd i endoplasmatiske retikulum (ER)-membranen og vender mot stoffer, mens VEEV nsP2-protease er et løselig protein i cytoplasma og nucleus27. Noen av kløften området sekvenser funnet i ZIKV SSHHPS analysen var i signal peptider antyder at kløften kan oppstå co-translationally for noen mål. Dermed må plasseringen av protease og underlaget i cellen også vurderes i disse analysene.
Celle-baserte analyser kan være verdifulle for å etablere en rolle for identifiserte verts protein (er) i infeksjon. Metoder som tar sikte på å stanse viral protease kløft av verten proteiner som tillegg av en protease inhibitor6 eller en mutasjon i verten målet16 kan brukes til å undersøke deres effekter på viral replikering. Overuttrykte av det målrettede proteinet kan også påvirke viral replikering28. Plakk analyser eller andre metoder kan brukes til å kvantifisere viral replikering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

Alphaviral enzymer er syntetisert i en enkelt polypeptid. Den nonstructural polyprotein (nsP) er behandlet av sin nsP2 cystein protease å produsere aktive enzymer avgjørende for viral replikering. Viral proteaser er svært spesifikke og anerkjenne bevart kløft nettsted motiv sekvenser (~ 6-8 aminosyrer). I flere gruppe IV virus, den nsP protease (s) kløft nettstedet motiv sekvenser kan finnes i bestemte vert proteiner involvert i å generere medfødt immunresponser og, i noen tilfeller, målrettede proteiner synes å være knyttet til virus-indusert fenotype. Disse virusene utnytte korte strekninger av homologe vert-patogen protein sekvenser (SSHHPS) for målrettet ødeleggelse av verten proteiner. For å identifisere SSHHPS viral protease kløft nettstedet motiv sekvenser kan angitt inn BLAST og verten Genova (e) kan søkes. Kløft utgangspunktet kan testes ved hjelp av renset nsP viral protease og fluorescens resonans energi overføring (SLITE) underlag laget i E. coli. BÅND underlaget inneholder cyan og gult fluorescerende protein og kløft området sekvensen (CFP-Sequence-YFP). Denne protease analysen kan brukes kontinuerlig i en plate leser eller discontinuously i SDS-PAGE gels. Modeller av bundet peptid underlag kan genereres i silisiummangan å veilede substrat utvalg og mutagenese studier. CFP/YFP underlag har også blitt benyttet for å identifisere protease hemmere. Disse in vitro og i silisiummangan metoder kan brukes i kombinasjon med celle-baserte analyser for å avgjøre om målrettede vert protein påvirker viral replikering.

SSHHPS analyse av ZIKV ns2B/3 protease identifisert 4 vert protein mål: FOXG1, SFRP1, en Gs Alpha delenhet fra en retinal cDNA bibliotek, og NT5M mitokondrie 5 ', 3 '-Nucleotidase (Figur 10)6. Spesielt, ingen annen metode spådd disse proteinene som potensielle mål av ZIKV protease. Mutasjoner i FOXG1 genet har vært knyttet til en medfødt syndrom preget av nedsatt utvikling og strukturelle hjerne unormalt som microcephaly. SFRP1 er en utskilt frizzled-relatert protein (SFRP); disse oppløselige reseptorer kan konkurransedyktig bind wnt ligander å antagonize og hemme wnt signalering. Wnt signal vei er involvert i reguleringen av IFN-responsen under Flavivirus-infeksjon36. Kløften av SFRP1 ville forventes å forsterke Flavivirus replikering. SFRP1 er også involvert i Th17-celle differensiering37. Sekvens justering av SSHHPS viste arter-spesifikke forskjeller i kløften området sekvenser (Figur 10D). Stedet sekvensen i SFRP1 var identisk hos mennesker og kyllinger. ZIKV kan indusere dødelighet og microcephaly i kylling embryo38. I gnagere, den svært bevarte P1 rester (K/R) R ↓ G er erstattet av en Glycine (RGG). Immunkompetente stammer av mus er generelt motstandsdyktig mot ZIKV infeksjon og sykdom39.
Steady state kinetisk parametre og hemming konstanter kan måles for viral polyprotein sekvenser og for verten protein sekvenser ved hjelp av kontinuerlig analysen i en plate leser31,40,41 (Figur 11a). For kvalitative kløft informasjon, for eksempel kløft av en bestemt sekvens eller hemming av protease av ulike forbindelser, kan den usammenhengende analysen brukes (Figur 11B).
Optimalisering av antall rester i mellom CFP og YFP kan være nødvendig. En substrat bundet modell kan lages ved hjelp av silisiummangan metoder. En representant forankret modell av nsP1/nsP2 krysset er vist i figur 9. For VEEV nsP2 protease hadde kløften av en 12-amino acid Semliki Forest virus (SFV) sekvensen blitt rapportert (Km = 0,58 mM)33. Forlenge underlaget sekvensen til 19, 22 og 25 rester og redusere den joniske styrken i bufferen førte til en betydelig reduksjon i Km. Undersøkelse av VEEV nsP2 krystallstruktur og krystall pakking viste også at en del av et av veikryss var pakket mot protease-domenet og ble vinkel. Dermed kan lengre VEEV underlag binde bedre på grunn av anerkjennelse av en sekundær strukturelle motiv.
For TRIM14, fikk vi en Km = 21 μM6,33. Km for underlaget som frakter verts protein sekvensen var sammenlignbar med Km -verdiene på underlag som inneholdt de virale polyprotein for område sekvenser (km(V12) = 12 μm og Km(V34) = 21 μm). Kløften området sekvenser på nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 og nsP3/nsP4 kryss ble kuttet med ulike effektivitet. I cellen antas dette å muliggjøre sekvensiell kløft av polyprotein42.
Det bør utvises forsiktighet ved tolkning av negative resultater. Hvis det ikke oppstår noen kløft, kan kløften være for kort eller renset protease kan være inaktiv. For underlag som er kuttet, er det behov for ytterligere eksperimenter for å bekrefte kløften av full lengde protein eller kløft i virus-infiserte celler. Passende oppfølgingseksperimenter bør velges. Effektene av overuttrykte eller demping av mål proteinet på viral replikering kan også testes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Figur 1: tre mekanismer for å stanse. Å stanse kan forekomme på DNA-, RNA-eller protein nivået. Disse "Søk og slett" algoritmer hver bruker et "søkeord" for å lede kløften av en fil som inneholder ordet. Dette tallet har blitt modifisert fra Morazzani et al.32 og referansene deri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Figur 2: arter-spesifikke forskjeller i kløft området sekvenser. C-terminalen SNUSE/SPRY domener av TRIM14 homologe vises i justeringen. Den SPRY domenet kan identifiseres ved de bevarte motivene uthevet i grått. Human TRIM14 er kuttet på QEAGA ↓ G av VEEV nsP2 cystein protease. SSHHP-sekvensen vises i farger. Rester i grønt er P1 ' rester; i blått er P4 rester, og i rødt er andre bevarte rester i kløften stedet motiv sekvensen. Equine Harbor en avkortet versjon av TRIM14 mangler SNUSE/SPRY domenet. Lysin uthevet i cyan er Poly-ubiquitinated og er viktig for montering av MAVS signalosome. C-terminal SNUSE/SPRY domenet kan være midlertidig kuttet av nsP2 protease å svekke vertens antiviral respons intracellulært under en akutt viral infeksjon. I equine, er dette domenet alltid fraværende. Dette tyder på at det SNUSE/SPRY domenet til TRIM14 kan ha en beskyttende funksjon mot VEEV infeksjoner. Dette tallet er gjengitt fra Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Figur 3: SSHHPS-identifikasjon ved hjelp av blast. Kløften nettstedet motiv sekvensen på VEEV nsP1/nsP2 krysset er på linje med SSHHP sekvensen i verten protein TRIM14. Rester farget i grønt er P1 ' rester; i blått er P4 rester og i rødt er andre bevarte rester av kløften stedet motiv sekvensen. De fleste tilpasninger inneholdt homologi til regioner utenfor den bevarte kløften stedet motiv eller ikke inkluderte P1/P1 ' scissile Bond rester. TRIM14 viste en kamp til 6 rester i sekvensiell rekkefølge som inkluderte P1 og P1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Figur 4: protein og DNA sekvenser av CFP-V12-YFP substrat for VEEV nsP2 cystein protease. Restriksjons områdene NdeI (CATATG) og XhoI (CTCGAG) vises med store bokstaver. I rødt er kløften området sekvensen fra viral polyprotein som er i mellom nsP1 og nsP2. Rester i grønt er P1 ' rester og i blått er P4 rester av kløften stedet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Figur 5: protein sekvens av TRX-VEEV-nsP2 cystein protease konstruere. Thioredoxin (TRX) er vist i gult. Den trombin kløften og hans-tag er vist i cyan. Cys-His Dyad er merket med rødt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Figur 6: peptid strukturer i Moe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Figur 7: docking av substrat peptid bruker PyRx/AutoDock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Figur 8: jobber som kjører på Biowulf-klyngen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Figur 9: modell av VEEV P12-substratet som inneholdt nsP1/nsP2-krysset. Cys-477/His-546 katalysatorer Dyad er vist i blått. Figur ble gjort ved hjelp Pymol (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Figur 10: SSHHPS-analyse av Zika-viruset ns2B/ns3-protease. (A) spådde vert protein mål av ZIKV ns2B/ns3 protease. Rester i rødt matche en enkelt kløft området sekvens. Rester i grønt tolereres på det sekundære området og matcher rester på andre steder i kløften. SFRP1 hadde det høyeste antallet identiske rester i rekkefølge. (B) CFP-SUBSTRAT-YFP proteiner (~ 50-60 KDA) ble uttrykt og renset inneholder spådde SSHHP sekvensen fra hvert vert protein (Human). Den ZIKV protease kuttet menneskelige FOXG1, SFRP1, NT5M og en GsAlpha delenhet isolert fra en retinal cDNA bibliotek. Produktene fra kløften er ca. 28-30 kDa. Underlaget sekvenser er tilgjengelig i Morazzani et al.6 (C) mens ns2B/ns3 protease cut SFRP1, det gjorde ikke klippe sin homologe (SFRP2 og SFRP4). (D) justering av kløften steder fra ulike dyrearter kan være nyttig i å velge en dyr modell for et gruppe IV virus. Merk at den bevarte R ↓ G sekvensen er forskjellig mellom mennesker og gnagere i SFRP1. Figur gjengitt fra Morazzani et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Figur 11: steady state kinetisk analyse ved hjelp av kontinuerlige og usammenhengende analyser. (A) kinetisk data vist i tabell 5 ble tegnet inn i GraFit. Det innfelte feltet viser Lineweaver-Burk-plottet. (B) SDS-side gel som viser kløften produkter av CFP-V12-YFP substrat. I kjørefelt 1 er "UNCUT" substrat (48 kDa). I Lane 2 er "CUT" substrat (31 kDa og 27 kDa). I baner 3-9 ulike forbindelser ble inkludert for å teste sin hemmende aktivitet. Lane 4 inneholder E64d kovalente inhibitor. Disse reaksjonene ble kjørt over natten for ~ 17 timer ved romtemperatur. Koking av prøvene var nødvendig for å oppnå den skarpe striper mønster. NsP2-protease er synlig (56 kDa) i reaksjonene som inneholder enzym, men ikke i kjørefelt 1. Lane 1 er "ingen enzym" kontroll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Vi presenterer en generell protokoll for å identifisere korte strekninger av homologe vert-patogen protein sekvenser (SSHHPS) innebygd i viral polyprotein. SSHHPS er anerkjent av viral proteaser og direkte målrettet ødeleggelse av bestemte vert proteiner av flere gruppe IV virus.

Analyse av gruppe IV viral SSHHPS bruke in vitro og i Silisiummangan metoder

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Vi har vist at gruppe IV virale genomer koder korte strekninger av vertsproteinsekvenser. Disse sekvensene finnes i viral protease cleavage nettsteder. De blir brukt til målrettet ødeleggelse av vertsproteiner, vanligvis proteiner involvert i å generere immunresponser.En stor fordel med å bruke proteaseanalyser er at den fjerner kompleksiteten til en celle og viser om en viral protease kan holde en bestemt sekvens. Så da vi analyserte Zika SSHHPS-sekvenser, fant vi ut at proteasen kunne kutte sekvenser i proteiner som er involvert i å generere immunresponser, og at noen av disse proteinene også hadde roller i hjerne- og øyeutvikling. Når du utfører denne teknikken for første gang, bør man huske at hvis spalting ikke observeres, at det kan skyldes en rekke faktorer som proteaseaktiviteten.Å demonstrere prosedyren vil være Jaimee Compton, en tekniker fra laboratoriet mitt. Start med å åpne Protein BLAST og legg de 20 aminosyrene rundt scissile bond og viral polyprotein og velg ikke-overflødige proteinsekvenser og skriv deretter inn vertsgenomet som skal søkes. Velg om nødvendig PHI-BLAST og skriv inn en mønstersekvens der hakeparenteser indikerer at enten aminosyre i parentesene kan være i erstatningsposisjon, og deretter treffer du BLAST.Rangeringsrekkefølge blast-treff basert på antall påfølgende identiske eller tolererte rester som samsvarer med en sekvens av spaltingsstedet. Fra listen velger du proteinene som inneholder seks eller flere identiske eller lignende rester for analyse i proteaseanalysene. Konstruer en plasmid koding av cyan fluorescerende protein, opptil 25 aminosyrer av cleavage sekvensen, og den gule fluorescerende protein.Deretter forbereder CFP- og YFP-substrater ved å vaksinere fire fire liters flasker med 25 milliliter av en overnattingskultur. Rist kulturene ved 37 grader Celsius og overvåk veksten hver time med UV-Vis spektroskopi ved 600 nanometer. Når bakteriene når en absorbans på omtrent en, indusere proteinuttrykk ved å legge til 0,5 milliliter av en molar IPTG til hver kolbe, senk deretter temperaturen på risting inkubatoren til 17 grader Celsius og la uttrykket fortsette over natten i 17 til 20 timer.På neste dag, pellet bakteriene ved sentrifugering på 7000 ganger g i 10 minutter ved 4 grader Celsius. Fjern og kast flytende media og oppbevar pellets på minus 80 grader Celsius eller fortsett med cellelys. For å lyse cellene, forberede 100 milliliter lysis buffer i henhold til manuskriptretninger, resuspend pellets i bufferen, og overføre 25 til 25 milliliter av suspensjonen til 50 milliliter disponibel koniske rør.Plasser rørene i et plastbeger med isvann og sett sonicatorspissen inn i røret slik at spissen er omtrent en centimeter fra bunnen av røret og sonikerer lysatet 10 til 20 ganger til den blir flytende og flytende. Etter sonikering, overføre lysate til høyhastighets sentrifuge rør og sentrifuge den på 20, 500 x g i 30 minutter ved 4 grader Celsius. Overfør supernatanten til en ren flaske og kast pellets.Last lysate på nikkelkolonnen og vask deretter kolonnen med to kolonnevolumer buffer A etterfulgt av fem kolonnevolumer på 20% buffer B.Absorbance ved 280 nanometer vil øke under vasken som forurensninger elute fra kolonnen. Fortsett å vaske til A280 går tilbake til grunnlinjeverdier. Elute deretter proteinet med to til tre kolonnevolumer på 100% buffer B og samle 10 milliliter fraksjoner, og sørg for å måle A280 av hver brøkdel.Forbered åtte reaksjoner blander seg i henhold til manuskriptretninger og pipette 45 mikroliter av hver blanding i de tre første brønnene i hver rad av en svart halvområde 96-brønnsplate. Sett opp plateleseren for samtidig påvisning av florescence ved to bølgelengder med en fast fotomultiplierrørinnstilling. Programmer lesetiden til 20 til 30 minutter med en lese per minutt og velg brønnene som skal leses.Sett platen inn i maskinen og start lømingen, og overt.hvor du kan se utslippsforholdene over tid. Kjør et endepunkt som leses av platen som inneholder det ukuttede substratet. Fjern platen og pipetten fem mikroliter av enzym i hver brønn.Man kan lagre den første kolonnen som en uklippet kontroll. Les deretter platen igjen i 20 til 30 minutter, og pass på at plateleseren skal sende ut absolutte verdier. Når lesingen er fullført, forsegler du platen med film for å forhindre fordampning og la den stå over natten ved romtemperatur for å la enzymet helt kutte underlaget.Etter 24 timer, fjern filmen og utfør et endepunkt som leses av platen. Gjennomsnittlig utslippsforhold og registrere dem som kutt. Bekreft spaltningen av underlaget ved hjelp av SDS-PAGE.Last en molekylær vektmarkør inn i første eller siste kjørefelt og last fem mikroliter av hver reaksjonsblanding inn i et kjørefelt på gelen, og start med den ukuttede reaksjonen. Fest elektrodene på geltanken til strømforsyningen og kjør produktene på 110 volt i 60 minutter. Fjern gelen fra kassetten ved hjelp av et sprengningsverktøy og senk den ned i fem til ti milliliter fargingsoppløsning.Etter en til 24 timer, fjern overflødig flekk og senk gelen i vann. Ta deretter et bilde av gelen ved hjelp av en gelbilder. For å forberede proteinstrukturen, last proteinet PDB-filen inn i MOE.Klikk Velg og løsningsmiddel, og slett deretter løsningsmidlet. Åpne Structure pPreparation-panelet fra menyen Beregne øverst på menylinjen, og korriger automatisk alle strukturelle elementer ved å klikke på Korriger. Protoner strukturen ved å klikke Protonate 3D.Legg delvise ladninger til proteinet ved å åpne Partial Charges-panelet og velge AMBER 99 og Juster hydrogener og ensomme par etter behov. Lagre deretter strukturfilen. Hvis du vil bygge strukturen for substratpeptider og TRIM14, åpner du Protein Builder-panelet, angir substratsekvensen og velger Automatisk ompakking.Deretter angir du Geometri som Utvidet og klikker på Bygg. Til slutt minimere strukturen og lagre den som en PDB-fil. Dokk substratpeptider til VEEV-nsP2 ved hjelp av PyRx AudoDock 4.2-programvaren.Last inn proteinet, høyreklikk navnet, og velg Lag makromolekyl for å klargjøre PDBQT-dokkingfilen. Last deretter substratmolekylet og velg Lag Ligand for å klargjøre ligand docking-filen. Start AutoDock-veiviseren på dokkingpanelet nederst, og velg de forberedte ligand- og proteinfilene.Definer proteinbindingslommen ved å justere rutenettdimensjonen manuelt, og kjør deretter AuotGrid. Deretter kjører du AutoDock og velger Den lamarckianske genetiske algoritmemetoden. Klikk på Docking Parameters og angi antall GA runs til 50 klikk deretter på Forward for å starte docking kjøre.Når AutoDock er fullført, åpner du Analyser resultater-panelet og inspiserer alle forventede bindingspositurer. Velg den beste modellen med lavest spådd bindingsenergi og rimelige bindende interaksjoner mellom cis-477 og substrat på cleavage-området, og lagre den deretter som en PDB-fil for ytterligere MD-simuleringer. Etter å ha lest bindingspositurene med AutoDock, er det viktig å utføre analyse etter dokking for å identifisere den plausible bindingsmodellen for raffinement med MD-simuleringer.Denne protokollen ble brukt til å finne korte strekninger av homologe vertspatogenproteinsekvenser eller SSHHPS i Zika-viruset ns2B/3 protease. Fire vertsproteinmål ble identifisert. FOXGS, SFRP1, en Gsalpha-underenhet fra et retinal cDNA-bibliotek, og NT5M mitokondrie 5'3'nucleotidase.Sekvensjusteringer av SSHHPS tillot artsspesifikke forskjeller i sekvensene for spaltingsstedet. SFRP1-sekvensen var identisk hos mennesker og kyllinger som er bemerkelsesverdig fordi Zika-viruset kan indusere dødelighet og mikrocefali hos kyllingembryoer. Den kontinuerlige analysen ble brukt til å måle steady state kinetiske parametere og hemming konstanter for viral polyprotein sekvenser og diskontinuerlig analyse ble brukt til å oppnå kvalitativ cleavage informasjon, for eksempel spalting av en bestemt sekvens eller hemming av protease av ulike forbindelser.En modell av den venezuelanske equine encefalitt nsP1-nsP2 krysset ble gjort ved hjelp av i silico metoder. For nsP2 protease, forlenge substrat sekvensen og redusere ionisk styrke buffer førte til en betydelig reduksjon i Michaelis konstant av spalting av en Semliki Forest virus sekvens. Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å kjøre kontrollene.Substrater som inneholder viral protease cleavage site sekvenser bør testes før du fortsetter med SSHHPS sekvensanalyse. Hvis spaltning av vertsprotein observeres, bør oppfølgingseksperimenter utføres for å bekrefte at vertsprotein påvirker viral replikering. Dette kan gjøres ved å overuttrykke eller dempe proteinet, og deretter undersøke effektene på viral replikering.Gruppe IV inneholder et stort antall nye og fremvoksende patogener. SSHHPS-sekvensene knytter spesifikke vertsproteiner og veier til viralprotesene på en svært forutsigbar måte.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering av en flytende dekket Culture of Polarized Menneskelig Airway Epiteliale Calu-3 Cells å studere Host Cell Response til luftveispatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Totalt Protein Extraction og 2-D-gel-elektroforese Metoder<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse av lymfocytt-ekstravasasjon ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det menneskelige blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In vitro- metoder for sammenligning av målbinding og CDC-induksjon mellom terapeutiske antistoffer: applikasjoner i biosimilaritetsanalyse

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro -metoder for fastsettelse av Viral kapsid konstruksjonssikkerhet

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Oppdagelse av lavt kopi nummer integrert virus-DNA dannet av In Vitro hepatitt B-smitte

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...