Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos números do projeto Defense Threat Reduction Agency (DTRA) CB-SEED-SEED09-2-0061 e CBCall4-CBM-05-2-0019, e em parte pelo programa de pesquisa Intramural/Extramural dos fundos base do Laboratório de Pesquisa Naval NCATS, NIH (XH) e Naval Research Laboratory.

As opiniões expressas aqui são as dos autores e não representam as da Marinha dos EUA, do Exército dos EUA, do Departamento de Defesa dos EUA ou do governo dos EUA.

A destruição seqüência específica de uma proteína ou de um ácido nucleic guiado por uma seqüência extrangeira é vista somente em alguns casos na biologia. Os mecanismos mostrados na Figura 1 são mecanismos defensivos que protegem um hospedeiro de um vírus ou um vírus de um hospedeiro.
Usando métodos bioinformatic nós podemos identificar os alvos que são destruídos por estes sistemas. Em nossas análises de sequências de SSHHP, descobrimos que muitas delas poderiam ser encontradas em proteínas necessárias para gerar respostas imunes inatas. Alguns tinham papéis óbvios, como MAVS e TRIF (TIR-domínio contendo adaptação-induzindo interferon-β), enquanto outros estavam relacionados à imunidade, embora mecanismos mais complexos (por exemplo, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. As informações-alvo armazenadas na sequência sshhp tem o potencial de identificar vias que têm efeitos antivirais contra esses vírus. As respostas antivirais in vivo são muitas vezes26,43. Por exemplo, subconjuntos de proteínas TRIM têm efeitos antivirais em diferentes vírus43,44,45, alguns são fatores de restrição viral (por exemplo, HIV e TRIM5α). A especificidade das proteínas TRIM (~70 foram identificadas) ainda está sendo examinada44,45. As informações dentro sshhps pode contribuir para a nossa compreensão de como esses vírus evitar as respostas imunes inatas. Outros padrões e correlações podem ser descobertos à medida que mais SSHHPS são examinados.
Diferenças específicas de espécies foram aparentes em nossas análises (Figura 2, Figura 10). Estes vírus são conhecidos por afetar algumas espécies mais do que outros. Informações sobre a gama de acolhimento, susceptibilidade de acolhimento e defesas de acolhimento podem estar presentes no SSHHPS. Por exemplo, o equino, a espécie mais suscetível aos vírus da encefalite equina, não tinha a região de TRIM14 humano que foi cortada transitóriamente pela protease veev nsP2. Os seres humanos raramente morrem de infecções VEEV, mas pode ser infectado24. A proteína TRIM14 humana carregava uma seqüência de clivagem protease nsP26. A presença do local da clivagem sugere que os seres humanos têm um mecanismo de defesa contra esses vírus. As aves foram pensados para ser reservatórios potenciais destes vírus46. A sequência correspondente do SSHHP na proteína TRIM14 das galinhas diferia das sequências encontradas em seres humanos e outras espécies. Diferenças sutis como estas podem tornar uma proteína alvo hospedeiro impuro ou mais facilmente clleaved. Aguirre et al.16 mostraram que uma proteína string mutada imuncleavable induziu níveis mais elevados de IFN após a infecção pelo vírus da dengue e que os ratos carregam naturalmente uma versão da PICADA que não é cortada pela dengue ns2B3 protease. A proteína PICADA murine não foi cortada pela protease ZIKV47. Em nossa análise SSHHPS, também observamos diferenças nas sequências do local de clivagem de protease ZIKV quando comparamos as proteínas humanas com as dos roedores6 (Figura 10D). Reproduzir as clivagens proteolíticas específicas das espécies de proteínas hospedeiras pode ser importante em modelos animais usados para vírus do Grupo IV. A inibição da clivagem de proteína hospedeira também tem implicações no que diz respeito ao desenvolvimento de inibidores da protease do Grupo IV. Em nossa publicação anterior, mostramos que poderíamos inibir a clivagem TRIM14 pela protease veev nsP2 usando o éster de metilo CA0746. Este resultado sugere que os inibidores de moléculas pequenas dessas proteases podem ser capazes de modular as respostas imunes inatas que são capazes de suprimir a infecção6,31.
A variação genética dentro de uma espécie também tem o potencial de produzir diferenças na clivagem proteolítica. Diferenças sutis no uso de codon podem afetar a pausa de ribossoma48. Como algumas proteases virais do Grupo IV estão incorporadas na membrana do ER, as diferenças nessas pausas podem afetar a clivagem de um alvo se a clivagem ocorrer co-translationally. Alguns dos locais de clivagem que identificamos estavam em sequências de peptídeos de sinal previstos (por exemplo, SFRP1), enquanto outros eram internos.
A análise do SSHHPS pode produzir informações que diferem de outros métodos de análises de proteínas hospedeiras. A análise do SSHHPS foi barata e fácil de empregar. O uso de um sistema de expressão bacteriana permitiu o teste de segmentos curtos (~25 aminoácidos) de seqüências de mamíferos sem o uso da cultura das células de mamíferos. Verificou-se que os substratos CFP-YFP foram capazes de tolerar todas as sequências de proteínas humanas testadas; no entanto, os rendimentos variaram. Em ensaios semelhantes, substratos contendo sequências de proteínas humanas, desde que 63 aminoácidos foram expressos com sucesso, purificados e utilizados para análises cinéticas e triageminibidora 49,50,51. Uma vez que apenas pequenas quantidades do substrato são necessárias para o ensaio descontínuo, um grande número de alvos pode ser explorado. Uma vantagem do sistema é que os substratos CFP/YFP podem ser usados para análises SDS-PAGE e para análises cinéticas mais elaboradas (ou seja, IC50,Ki,Km,Vmax). Para a descoberta de medicamentos, compostos inibitórios podem produzir artefatos em ensaios fluorescentes. Assim, o ensaio descontínuo em combinação com um ensaio contínuo permite confirmar a clivagem ou inibição da clivagem. As amostras para o ensaio SDS-PAGE descontínuo podem ser retiradas diretamente das placas de 96 poços. Os substratos cfp/yfp têm sido utilizados para triagem de biblioteca composta52. No entanto, são necessárias análises adicionais para determinar se um substrato é adequado para triagem de alta taxa de rendimento, como o cálculo de um fator Z53.
Um desafio na concepção de um substrato é identificar a região em torno do vínculo scissile que está vinculado e reconhecido pela protease. Nos exemplos mostrados aqui, começamos com 12 sequências de resíduos que estavam centradas em torno da ligação scissile. Após a análise de alinhamentos seqüência da homologia locais de clivagem para os resíduos N-terminal da ligação scissile foi encontrado para a protease VEEV, enquanto que para a homologia protease ZIKV para vários dos resíduos C-terminal foi encontrado. Um modelo em silico do substrato ancorado pode ser usado para projetar experimentos de mutagênese dirigidos pelo local que sondam os locais de ligação do substrato. Uma vez que as sequências de substrato e enzima estão em plasmídeos, ou podem ser mutadas para testar os modelos em silico ou tolerâncias subsite. Isso pode ser vantajoso se uma estrutura cristalina do substrato vinculado (s) não estiver disponível.
A análise do SSHHPS também pode produzir novas informações sobre os mecanismos pelos quais fenótipos induzidos por vírus são produzidos por enzimas virais. Um dos alvos ZIKV, SFRP1, faz parte da via de sinalização Wnt e tem papéis no desenvolvimento do cérebro e dos olhos e em respostas imunes36,37,54,55,56,57. Descobrimos que as outras sequências de proteínas que poderiam ser cortadas pela protease ZIKV ns2B/ns3 também estavam em proteínas envolvidas no desenvolvimento cerebral e ocular; Anormalidades em ambos têm sido observadas na síndrome congênita de Zika e são pensados para ser parte do fenótipo induzido pelo vírus58.
A previsibilidade das interações hospedógenas-patógenos poderia ser explorada para uma variedade de aplicações: terapias virais oncolíticas específicas para o alvo; desarriscar vacinas contra vírus vivos; refinamento, previsão ou seleção de modelos animais; previsão de gama de hospedeiros ou susceptibilidade; previsão de eventos zoonóticos; e previsão de host-defesas. Uma vez que os métodos descritos são baseados em sequências, eles podem ser de valor para incorporar em software no futuro.

Evidências de transferência horizontal de genes do vírus para hospedeiro, ou hospedeiro para vírus, podem ser encontradas em uma variedade de genomas1,2,3,4. Exemplos de endogenização viral são as sequências de espaçador CRISPR encontradas em genomas de hospedeiros bacterianos4. Recentemente, encontramos evidências de sequências de proteínas hospedeiras incorporadas nas poliproteínas não estruturais dos vírus (+)ssRNA Group IV. Essas sequências dentro das regiões de codificação do genoma viral podem ser propagadas geracionalmente. Os curtos trechos de sequências de proteínas homologous de acolhimento-patógeno (SSHHPS) são encontrados no vírus ehospedeiros5,6. SSHHPS são as seqüências conservadas do motivo do local da clivagem reconhecidas pelas proteases virais que têm a homologia às proteínas específicas do anfitrião. Estas sequências direcionam a destruição de proteínas hospedeiras específicas.
Em nossa publicação anterior6, compilamos uma lista de todas as proteínas hospedeiras que foram alvo de proteases virais e descobrimos que a lista de alvos não era aleatória(Tabela 1). Duas tendências eram aparentes. Primeiro, a maioria das proteases virais que cortam proteínas hospedeiras pertencia aos vírus do Grupo IV (24 dos 25 casos envolveram proteases virais do Grupo IV) e uma protease pertencia aos retrovírus (+)ssRNA Group VI (HIV, vírus da imunodeficiência humana)7. Em segundo lugar, os alvos proteicos hospedeiros que estão sendo cortados pelas proteases virais estavam geralmente envolvidos na geração das respostas imunes inatas, sugerindo que as clivagens tinham a intenção de antagonizar as respostas imunes do hospedeiro. Metade das proteínas hospedeiras visadas pelas proteases virais eram componentes conhecidos de cascatas de sinalização que geram interferon (IFN) e citocinas proinflamatórias(Tabela 1). Outros estavam envolvidos na transcrição celular anfitrião 8,9,10 ou tradução11. Curiosamente, Shmakov et al.4 mostraram que muitas sequências de protospacer CRISPR correspondem a genes envolvidos na conjugação plasmídea ou replicação4.
Grupo IV inclui, entre outros, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae, e Togaviridae. Vários patógenos novos e emergentes pertencem ao Grupo IV, como o vírus Zika (ZIKV), Nilo Ocidental (WNV), Chikungunya (CHIKV), vírus grave da síndrome respiratória aguda (SARS) e vírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS). O genoma (+)ssRNA é essencialmente um pedaço de mRNA. Para produzir as enzimas necessárias para a replicação do genoma, o genoma (+)ssRNA primeiro deve ser traduzido. Em alfavírus e outros vírus do Grupo IV, as enzimas necessárias para a replicação são produzidas em uma única poliproteína (ou seja, nsP1234 para VEEV). A poliproteína não estrutural (nsP) é processada proteolíticamente (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) pelo nsP2 protease para produzir enzimas ativas12 (Figura 1). A clivagem da poliproteína pela protease nsP2 é essencial para a replicação viral; isso tem sido demonstrado pela deleção e mutagênese dirigida pelo local da cisteína do site ativo do nsP2 protease13,14. Notavelmente, a tradução de proteínas virais precede eventos de replicação do genoma. Por exemplo, o nsP4 contém a polimererase de RNA dependente de RNA necessária para replicar o genoma (+)ssRNA. A replicação do genoma pode produzir intermediários do dsRNA; estes intermediários podem desencadear as respostas imunes inatas do hospedeiro. Assim, estes vírus podem apegar o hospedeiro proteínas de resposta imune inata no início da infecção, a fim de suprimir seus efeitos15,16,17.
Silenciar pode ocorrer no nível de DNA, RNA e proteína. O que é comum a cada um dos mecanismos de silenciamento mostrados na Figura 1 é que curto DNA estrangeiro, RNA ou sequências de proteínas são usados para guiar a destruição de alvos específicos para antagonizar sua função. Os mecanismos de silenciamento são análogos a programas de "busca e exclusão" que foram escritos em três idiomas diferentes. A seqüência do site de clivagem curta é análoga a uma "palavra-chave". Cada programa tem uma enzima que reconhece a correspondência entre a seqüência curta (a "palavra-chave") e uma palavra no "arquivo" que deve ser excluído. Uma vez que uma correspondência é encontrada, a enzima corta ("exclui") a sequência de alvo maior. Os três mecanismos mostrados na Figura 1 são usados para defender o hospedeiro de vírus, ou para defender um vírus do sistema imunológico de um hospedeiro.
Proteases virais reconhecem seqüências de motivos curtos do local de clivagem entre ~2-11 aminoácidos; em nucleotídeos, isso corresponderia a bases 6-33. Para comparação, as sequências de espaçadores CRISPR são ~26-72 nucleotídeos e RNAi são ~20-22 nucleotídeos18,19. Embora essas sequências sejam relativamente curtas, elas podem ser reconhecidas especificamente. Dada a maior diversidade de aminoácidos, a probabilidade de um evento de clivagem aleatória é relativamente baixa para uma protease viral reconhecendo sequências de proteínas de 6-8 aminoácidos ou mais. A previsão de SSHHPS em proteínas hospedeiras dependerá em grande parte da especificidade da protease viral que está sendo examinada. Se a protease tem requisitos rigorosos de especificidade seqüência a chance de encontrar uma seqüência de local de clivagem é 1/206 = 1 em 64 milhões ou 1/208 = 1 em 25,6 bilhões; no entanto, a maioria das proteases têm tolerâncias variáveis subsite (por exemplo, R ou K pode ser tolerado no site S1). Consequentemente, não há nenhuma exigência para a identidade da seqüência entre as seqüências encontradas no hospedeiro contra o vírus. Para proteases virais que têm requisitos de seqüência mais soltos (como aqueles pertencentes a Picornaviridae), a probabilidade de encontrar um local de clivagem em uma proteína hospedeira pode ser maior. Muitas das entradas na Tabela 1 são da família Picornaviridae.
A notação20 de Schechter & Berger é comumente usada para descrever os resíduos em um substrato protease e os subsites aos quais eles se ligam, utilizamos essa notação por toda parte. Os resíduos no substrato que são n-terminal da ligação scissile são denotados como P3-P2-P1, enquanto aqueles que são C-terminal são denotados como P1'-P2'-P3'. Os subsites correspondentes na protease que ligam esses resíduos de aminoácidos são S3-S2-S1 e S1'-S2'-S3', respectivamente.
Para determinar quais proteínas hospedeiras estão sendo direcionadas, podemos identificar SSHHPS nos locais de clivagem de poliproteína viral e procurar as proteínas hospedeiras que as contêm. Aqui, descrevemos procedimentos para identificar SSHHPS usando sequências conhecidas do site de clivagem protease viral. Os métodos bioinformatic, os ensaios do protease, e nos métodos do silico descritos são pretendidos ser usados conjuntamente com os ensaios pilha-baseados.
Alinhamentos sequenciais das proteínas hospedeiras alvo de proteases virais revelaram diferenças específicas de espécies dentro dessas sequências curtas do local de clivagem. Por exemplo, o vírus venezuelano da encefalite equina (VEEV) protease nsP2 foi encontrado para cortar trim14 humano, um motivo tripartite (TRIM) proteína6. Algumas proteínas TRIM são fatores de restrição viral (por exemplo, TRIM5α21), a maioria é pensada para ser ligases ubiquitin E3. TRIM14 não tem um anel (realmente interessante novo gene) domínio e não é pensado para ser um E3 ligase22. Trim14 foi proposto para ser um adaptador no signalosome antiviral mitocondrial (MAVS)22, mas pode ter outras funções antivirais23. Alinhamento de seqüências TRIM14 de várias espécies mostra que equino falta o local de clivagem e abrigar uma versão truncada de TRIM14 que está faltando o c-terminal PRY / domínio SPRY. Este domínio contém um site de poliubiquitinação (Figura 2). Em equino, estes vírus são altamente letais (~ 20-80% mortalidade), enquanto em seres humanos apenas ~ 1% morrem de infecções VEEV24. Clivagem do domínio PRY / SPRY pode transitoriamente curto-circuito do MAVS sinalização cascata. Esta cascata pode ser desencadeada por dsRNA e leva à produção de interferon e citocinas pró-inflamatórias. Assim, a presença do SSHHPS pode ser útil para prever quais espécies têm sistemas de defesa contra vírus específicos do Grupo IV.
Nos vírus do Grupo IV, acredita-se que os mecanismos de antagonismo ifn se multiplicam25redundantes. A clivagem da proteína do anfitrião pode ser transitória durante a infecção e as concentrações podem recuperar sobre o tempo. Encontramos nas células que os produtos de clivagem TRIM14 poderiam ser detectados muito cedo após a transfecção (6 h) com um plasmídeo codificando a protease (promotor de citomegalovírus). No entanto, em períodos mais longos, os produtos de clivagem não foram detectados. Em células infectadas pelo vírus, a cinética era diferente e produtos de clivagem podiam ser detectados entre 6-48 h6. Outros relataram o aparecimento de produtos de clivagem de proteína hospedeiro tão cedo quanto 3-6 h pós infecção9,11.
A atividade proteolítica nas células é muitas vezes difícil de capturar; os produtos de clivagem podem variar em sua solubilidade, concentração, estabilidade e vida. Em ensaios baseados em células, não se pode supor que os produtos de clivagem se acumularão em uma célula ou que as intensidades da banda de proteína cortada e sem cortes mostrarão aumentos e diminuições compensatórias à medida que a proteína cortada pode ser degradada muito rapidamente e pode não ser detectável em uma mancha ocidental com um peso molecular esperado (MW) (por exemplo, a região que contém a epítops poderia ser abarcada por outras proteases hospedeiras ou poderia ser ubiquitada). Se o substrato da protease viral é uma proteína de resposta imune inata, sua concentração pode variar durante a infecção. Por exemplo, algumas proteínas inatas de resposta imune estão presentes antes da infecção viral e são induzidas ainda mais pelo interferon26. A concentração da proteína alvo pode, portanto, flutuar durante a infecção e comparação de lysates celulares não infectados podem ser difíceis de interpretar. Além disso, todas as células podem não estar igualmente infectadas ou infectadas. Os ensaios de protease in vitro usando proteínas purificadas de E. coli, por outro lado, têm menos variáveis para controlar e tais ensaios podem ser feitos usando SDS-PAGE em vez de imunoblots. A contaminação de proteases pode ser inibida nos primeiros passos da purificação de proteínado substrato CFP/YFP, e proteases virais mutadas podem ser purificadas e testadas como controles para determinar se a clivagem é devido à protease viral ou a uma protease bacteriana contaminante.
Uma limitação dos ensaios protease in vitro é que eles não têm a complexidade de uma célula de mamíferos. Para que uma enzima corte seu substrato, os dois devem ser co-localizados. Proteases virais do grupo IV diferem na estrutura e localização. Por exemplo, a protease ZIKV está incorporada na membrana reticulum (ER) e enfrenta o citosol, enquanto a protease VEEV nsP2 é uma proteína solúvel no citoplasma e núcleo27. Algumas das seqüências do local da clivagem encontradas na análise de ZIKV SSHHPS estavam nos peptides do sinal que sugerem que a clivagem pudesse ocorrer co-translationally para alguns alvos. Assim, a localização da protease e do substrato na célula também precisa ser considerada nessas análises.
Os ensaios baseados em células podem ser valiosos para estabelecer um papel para a proteína hospedeira identificada (s) na infecção. Métodos que visam deter a clivagem protease viral de proteínas hospedeiras, como a adição de um inibidor de protease6 ou uma mutação no alvo hospedeiro16, podem ser usados para examinar seus efeitos na replicação viral. A superexpressão da proteína alvo também pode afetar a replicação viral28. Ensaios de placa ou outros métodos podem ser usados para quantificar a replicação viral.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

As enzimas alfavirais são sintetizadas em um único polipeptídeo. A poliproteína não estrutural (nsP) é processada por sua protease de cisteína nsP2 para produzir enzimas ativas essenciais para a replicação viral. Proteases virais são altamente específicos e reconhecem sequências conservadas de motivos do local de clivagem (~6-8 aminoácidos). Em vários vírus do Grupo IV, as sequências de motivos do local de clivagem nsP podem ser encontradas em proteínas hospedeiras específicas envolvidas na geração das respostas imunes inatas e, em alguns casos, as proteínas alvo parecem estar ligadas ao fenótipo induzido pelo vírus. Esses vírus utilizam trechos curtos de sequências de proteínas homologous de agengários de acolhimento-patógeno (SSHHPS) para destruição direcionada de proteínas hospedeiras. Para identificar sshhps o viral protease clivagem site motivo seqüências podem ser inseridas em blast e o host genoma (s) pode ser pesquisado. A clivagem inicialmente pode ser testada usando os substratos purificados de proteção viral nsP e fluorescência de ressonância (FRET) feitos em E. coli. Os substratos do FRET contêm a proteína fluorescente do ciano e do amarelo e a seqüência do local da clivagem (CFP-seqüência-YFP). Este ensaio protease pode ser usado continuamente em um leitor de placa ou descontinuadamente em géis SDS-PAGE. Modelos dos substratos peptídeos encadernados podem ser gerados em silico para orientar a seleção de substratos e estudos de mutagênese. Os substratos cfp/yfp também têm sido utilizados para identificar inibidores da protease. Estes métodos in vitro e em silico podem ser usados em combinação com ensaios baseados em células para determinar se a proteína hospedeira direcionada afeta a replicação viral.

A análise do SSHHPS da protease ZIKV ns2B/3 identificou 4 alvos proteicos hospedeiros: FOXG1, SFRP1, uma subunidadealfa de G de uma biblioteca de cDNA da retina e o NT5M mitocondrial 5',3'-nucleotidase (Figura 10)6. Notavelmente, nenhum outro método previu essas proteínas como alvos potenciais da protease ZIKV. Mutações no gene FOXG1 têm sido associadas a uma síndrome congênita caracterizada por desenvolvimento prejudicado e anormalidades estruturais cerebrais, como microcefalia. SFRP1 é uma proteína secretada relacionada com frizzled (SFRP); estes receptores solúveis podem ligar competitivamente os ligantes wnt a antagonizar e inibir a sinalização wnt. A via de sinalização Wnt está envolvida na regulação da resposta ifn durante a infecção por flavivírus36. Espera-se que a clivagem do SFRP1 melhore a replicação do flavivírus. SFRP1 também está envolvido na diferenciação de células Th1737. Alinhamentos sequenciais do SSHHPS mostraram diferenças específicas de espécies nas sequências do local de clivagem(Figura 10D). A seqüência do local da clivagem em SFRP1 era idêntica nos seres humanos e nas galinhas; ZIKV pode induzir mortalidade e microcefalia em embriões de frango38. Em roedores, o resíduo P1 altamente conservado (K/R)R'G é substituído por uma glicina (RGG). Cepas imunocompetentes de camundongos são geralmente resistentes à infecção zikv e doença39.
Parâmetros cinéticos estaduais estáveis e constantes de inibição podem ser medidos para as sequências de poliproteína viral e para as sequências de proteína hospedeira usando o ensaio contínuo em um leitor de placa31,40,41 ( Figura11A). Para informações qualitativas de clivagem, como clivagem de uma seqüência específica ou a inibição da protease por vários compostos, o ensaio descontínuo pode ser usado (Figura 11B).
A otimização do número de resíduos entre a PCP e a YFP pode ser necessária. Um modelo substrato-limitado pode ser feito usando os métodos no silico. Um modelo representativo encaixado da junção nsP1/nsP2 é mostrado na Figura 9. Para a protease veev nsP2, clivagem de um 12-aminoácido Semliki Forest Virus (SFV) seqüência tinha sido relatado (Km = 0,58 mM)33. Alongar a seqüência de substrato para 19, 22 e 25 resíduos e reduzir a força iônica do buffer levou a uma redução significativa no Km. O exame da estrutura cristalina VEEV nsP2 e embalagem de cristal também mostrou que uma parte de uma das junções foi embalado contra o domínio protease e foi helical. Assim, os substratos veev mais longos podem ligar-se melhor devido ao reconhecimento de um motivo estrutural secundário.
Para trim14, obtivemos um Km = 21 μM6,33. O Km para o substrato que transportava a sequência de proteína hospedeira foi comparável aos valores km dos substratos contendo as sequências virais do local de clivagem poliproteína (Km(V12) = 12 μM e Km(V34) = 21 μM). As seqüências do local da clivagem nas junções nsP1/nsP2, nsP2/nsP3, e nsP3/nsP4 foram cortadas com eficiências diferentes. Na célula, isso é pensado para permitir a clivagem sequencial da poliproteína42.
O cuidado deve ser tomado em interpretar resultados negativos. Se nenhuma clivagem ocorre, o local da clivagem pode ser demasiado curto ou o protease purificado pode ser inativo. Para substratos que são cortados, experimentos adicionais são necessários para confirmar a clivagem da proteína de comprimento total ou clivagem em células infectadas pelo vírus. Experimentos de acompanhamento apropriados devem ser escolhidos. Os efeitos da superexpressão ou silenciamento da proteína alvo na replicação viral também podem ser testados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Figura 1: Três mecanismos de silenciamento. Silenciar pode ocorrer no nível de DNA, RNA ou proteína. Esses algoritmos de "pesquisa e exclusão" cada um usa uma "palavra-chave" para direcionar a clivagem de um arquivo contendo a palavra. Este número foi modificado a partir de Morazzani et al.32 e as referências nele. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Figura 2: Diferenças específicas de espécies nas sequências do local de clivagem. Os domínios C-terminal PRY/SPRY dos homologogues TRIM14 são mostrados no alinhamento. O domínio PRY/SPRY pode ser identificado pelos motivos conservados destacados em cinza. O TRIM14 humano é cortado no QEAGA-G pela protease de cisteína VEEV nsP2. A sequência SSHHP é mostrada em cores. O resíduo em verde é o resíduo do P1; em azul é o resíduo P4, e em vermelho são outros resíduos conservados dentro da seqüência de motivos do local de clivagem. Equine abrigar uma versão truncada de TRIM14 sem o domínio PRY / SPRY. A lisina destacada em ciano é poli-ubiquitinada e é importante para a montagem do signalosome MAVS. O domínio C-terminal PRY/SPRY pode ser cortado transitóriamente pela protease nsP2 para prejudicar a resposta antiviral do hospedeiro intracelularmente durante uma infecção viral aguda. Em equino, este domínio está sempre ausente. Isso sugere que o domínio PRY/SPRY da TRIM14 pode ter uma função protetora contra infecções veev. Esta figura foi reproduzida a partir de Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Figura 3: Identificação sshhps usando blast. A seqüência de motivos do local de clivagem na junção VEEV nsP1/nsP2 está alinhada com a sequência sshhp na proteína hospedeira TRIM14. O resíduo colorido em verde é o resíduo p1'; em azul é o resíduo P4 e em vermelho são outros resíduos conservados da seqüência de motivos do local de clivagem. A maioria dos alinhamentos continha homologia para regiões fora do motivo conservado do local de clivagem ou não incluíam os resíduos de obrigações scissile do P1/P1. Trim14 mostrou uma correspondência de 6 resíduos em ordem sequencial, que incluiu P1 e P1'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Figura 4: Sequências de proteínas e DNA do substrato CFP-V12-YFP para a protezase cisteína VEEV nsP2. Os sites de restrição NdeI (CATATG) e XhoI (CTCGAG) são mostrados em letras maiúsculas. Em vermelho está a seqüência do local de clivagem da poliproteína viral que está entre nsP1 e nsP2. O resíduo em verde é o resíduo P1' e em azul é o resíduo P4 do local da clivagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Figura 5: Sequência de proteínas da construção de protease de cistese Trx-VEEV-nsP2. Thioredoxin (Trx) é mostrado em amarelo. O local de clivagem trombina e sua marca são mostrados em ciano. O díado de Cis-Seu são rotulados em vermelho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Figura 6: Estruturas peptídeas no MOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Figura 7: Acoplamento de peptídeo de substrato usando PyRx/AutoDock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Figura 8: Empregos em execução no cluster Biowulf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Figura 9: Modelo do substrato VEEV P12 contendo a seqüência do local de clivagem na junção nsP1/nsP2. O díado catalítico Cys-477/His-546 é mostrado em azul. Figura foi feita usando Pymol (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Figura 10: Análise SSHHPS do vírus Zika ns2B/ns3 protease. (A)Metas de proteína de hospedeiro previsto si2B/ns3 protease ZIKV. Resíduos em vermelho correspondem a uma única seqüência de local de clivagem. Resíduos em verde são tolerados no subsite e combinam resíduos em outros locais de clivagem. SFRP1 apresentou o maior número de resíduos idênticos em ordem consecutiva. (B) As proteínas CFP-substrato-YFP (~50-60 kDa) foram expressas e purificadas contendo a sequência SSHHP prevista de cada proteína hospedeira (humana). O ZIKV protease cortou foxg1 humano, SFRP1, NT5M e um Gssubunidade alfa isolado de uma biblioteca cDNA retinal. Os produtos de clivagem são aproximadamente 28-30 kDa. As sequências de substrato estão disponíveis em Morazzani et al.6 (C)Enquanto o ns2B/ns3 protease cortou SFRP1, não cortou seus homologos (SFRP2 e SFRP4). (D)O alinhamento dos locais de clivagem de diferentes espécies animais pode ser útil na seleção de um modelo animal para um vírus grupo IV. Note-se que a seqüência R'G conservada difere entre humanos e roedores em SFRP1. Figura reproduzida a partir de Morazzani et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Figura 11: Análise cinética estável do estado usando os ensaios contínuos e descontínuos. (A)Os dados cinéticos mostrados na Tabela 5 foram traçados no GraFit. A inserção mostra o enredo Lineweaver-Burk. (B) Gel SDS-PAGE mostrando os produtos de clivagem do substrato CFP-V12-YFP. Na pista 1 está o substrato "UNCUT" (48 kDa). Na pista 2 está o substrato "CUT" (31 kDa e 27 kDa). Nas pistas 3-9 compostos diferentes foram incluídos para testar sua atividade inibil. A pista 4 contém o inibidor covalente E64d. Estas reações foram executados durante a noite para ~ 17 h à temperatura ambiente. A ebulição das amostras foi necessária para atingir o padrão de faixa afiada. A protease nsP2 é visível (56 kDa) nas reações contendo enzima, mas não na pista 1. A pista 1 é o controle "sem enzimas". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

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Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Apresentamos um protocolo geral para identificar trechos curtos de sequências de proteínas homologous hospedeiras-patógenos (SSHHPS) incorporadas na poliproteína viral. SSHHPS são reconhecidos por proteases virais e direcionam a destruição direcionada de proteínas hospedeiras específicas por vários vírus do Grupo IV.

Análise do Grupo IV Viral SSHHPS usando métodos in vitro e em silico

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Mostramos que genomas virais do grupo IV codificam pequenos trechos de sequências proteicas hospedeiras. Essas sequências podem ser encontradas nos locais de decote protease viral. Eles estão sendo usados para a destruição direcionada de proteínas hospedeiras, tipicamente proteínas envolvidas na geração das respostas imunes.Uma grande vantagem do uso de ensaios protease é que ele remove a complexidade de uma célula e mostra se uma protease viral pode ou não cortar uma sequência específica. Assim, quando analisamos as sequências de Zika SSHHPS, descobrimos que a protease poderia cortar sequências em proteínas envolvidas na geração de respostas imunes e que algumas dessas proteínas também tinham papéis no desenvolvimento cerebral e ocular. Ao realizar essa técnica pela primeira vez, deve-se lembrar que se o decote não for observado, que pode ser devido a uma variedade de fatores, como a atividade da protease.Demonstrando o procedimento será Jaimee Compton, uma técnica do meu laboratório. Comece abrindo protein BLAST e coloque os 20 aminoácidos ao redor da ligação scissile e a poliproteína viral e selecione sequências proteicas não redundantes, em seguida, digite no genoma hospedeiro para ser pesquisado. Se necessário, selecione PHI-BLAST e digite uma sequência de padrão onde os suportes quadrados indicam que qualquer aminoácido dentro dos suportes pode estar na posição de substituição e, em seguida, acerte BLAST.Classificar a ordem dos hits BLAST com base no número de resíduos idênticos ou tolerados consecutivos que correspondem a uma sequência de local de decote. Na lista, selecione as proteínas contendo seis ou mais resíduos idênticos ou similares para análise nos ensaios protease. Construa um plasmídeo codificando a proteína fluorescente ciano, até 25 aminoácidos da sequência de decotes, e a proteína fluorescente amarela.Em seguida, prepare os substratos CFP e YFP inoculando quatro frascos de quatro litros com 25 mililitros de uma cultura durante a noite. Agite as culturas a 37 graus Celsius e monitore o crescimento de hora em hora pela espectroscopia UV-Vis a 600 nanômetros. Quando as bactérias atingem uma absorção de cerca de um, induza a expressão proteica adicionando 0,5 mililitros de um IPTG molar a cada frasco, em seguida, reduza a temperatura da incubadora de agitação para 17 graus Celsius e permita que a expressão continue durante a noite por 17 a 20 horas.No dia seguinte, pelota as bactérias por centrifugação a 7000 vezes g por 10 minutos a 4 graus Celsius. Remova e descarte a mídia líquida e, em seguida, armazene as pelotas a menos 80 graus Celsius ou prossiga com a lise celular. Para lise as células, prepare 100 mililitros de tampão de lise de acordo com as instruções do manuscrito, resuspenque as pelotas no buffer e transfira de 25 a 25 mililitros da suspensão para tubos cônicos descartáveis de 50 mililitros.Coloque os tubos em um béquer plástico com água gelada e insira a ponta do sonicador no tubo de modo que a ponta esteja a cerca de um centímetro da parte inferior do tubo e sonicar o lisato 10 a 20 vezes até que ele se torne fluido e liquefeito. Após a sônicação, transfira o lise para tubos de centrífugas de alta velocidade e centrifuá-lo a 20,500 x g por 30 minutos a 4 graus Celsius. Transfira o supernatante para uma garrafa limpa e descarte as pelotas.Carregue o lise na coluna de níquel e lave a coluna com dois volumes de coluna de tampão A seguidos por cinco volumes de coluna de 20% tampão B.A absorção a 280 nanômetros aumentará durante a lavagem como contaminantes elute da coluna. Continue lavando até que o A280 retorne aos valores básicos. Em seguida, elute a proteína com dois a três volumes de coluna de 100% tampão B e coletar frações de 10 mililitros, certificando-se de medir o A280 de cada fração.Prepare oito misturas de reações de acordo com as instruções do manuscrito e pipetas 45 microliters de cada mistura nos três primeiros poços de cada linha de uma placa preta de meia-área de 96 poços. Configure o leitor de placas para detecção simultânea de florescência em dois comprimentos de onda com uma configuração fixa do tubo fotomultiplier. Programe o tempo de leitura para 20 a 30 minutos com uma leitura por minuto e selecione os poços a serem lidos.Insira a placa na máquina e inicie a leitura, monitorando as relações de emissão ao longo do tempo. Execute uma leitura final da placa contendo o substrato sem cortes. Remova a placa e a pipeta cinco microliters de enzima em cada poço.Pode-se salvar a primeira coluna como um controle sem cortes. Em seguida, leia novamente a placa por 20 a 30 minutos, certificando-se de definir o leitor de placas para produzir valores absolutos. Uma vez que a leitura esteja completa, sele a placa com filme para evitar a evaporação e deixe-a durante a noite à temperatura ambiente para permitir que a enzima corte completamente o substrato.Após 24 horas, remova o filme e realize uma leitura final da placa. Média das taxas de emissão e registo-los como corte. Confirme o decote do substrato usando SDS-PAGE.Carregue um marcador de peso molecular na primeira ou última pista e carregue cinco microliters de cada mistura de reação em uma faixa do gel, começando com a reação sem cortes. Conecte os eletrodos do tanque de gel à fonte de alimentação e execute os produtos a 110 volts por 60 minutos. Remova o gel do usando uma ferramenta de rachaduras e submerse-o em cinco a dez mililitros de solução de coloração.Após uma a 24 horas, remova o excesso de mancha e submerse o gel na água. Em seguida, tire uma foto do gel usando um imager de gel. Para preparar a estrutura proteica, carregue o arquivo PDB proteico em MOE.Clique em Selecionar e Solvente e, em seguida, exclua o solvente. Abra o painel Depreparação de estrutura da barra de menu superior compute e corrija automaticamente todos os itens estruturais clicando em Corrigir. Protonar a estrutura clicando em Protonato 3D.Adicione cargas parciais à proteína abrindo o painel Cargas Parciais e selecionando AMBER 99 e Ajuste os hidrogênios e pares solitários conforme necessário. Em seguida, salve o arquivo da estrutura. Para construir a estrutura para os peptídeos do substrato e TRIM14, abra o painel Protein Builder, digite a sequência do substrato e selecione Auto Repack.Em seguida, defina Geometria como Estendida e clique em Construir. Por fim, minimize a estrutura e salve-a como um arquivo PDB. Docas os peptídeos substratos para VEEV-nsP2 usando o software PyRx AudoDock 4.2.Carregue a proteína, clique com o botão direito do mouse no nome e selecione Fazer Macromolécula para preparar o arquivo de encaixe PDBQT. Em seguida, carregue a molécula do substrato e selecione Fazer Ligand para preparar o arquivo de acoplamento de ligantes. Inicie o assistente AutoDock no painel de acoplamento na parte inferior e selecione os arquivos de ligantes e proteínas preparados.Defina o bolso de ligação de proteína ajustando manualmente a dimensão da grade e execute AuotGrid. Em seguida, execute o AutoDock e selecione o método do algoritmo genético lamarckiano. Clique em Docking Parameters e defina o número de execuções de GA para 50 e clique em Avançar para iniciar a execução de acoplamento.Quando o AutoDock estiver completo, abra o painel Analisar resultados e inspecione todas as poses de vinculação previstas. Selecione o melhor modelo com a menor energia de ligação prevista e interações de ligação razoáveis entre o cis-477 e o substrato no site de decote e, em seguida, salve-o como um arquivo PDB para novas simulações de MD. Após a leitura das poses de vinculação com AutoDock, é importante realizar análises pós-acoplamento para identificar o modelo de ligação plausível para refinamento com simulações de MD.Este protocolo foi usado para encontrar pequenos trechos de sequências de proteína hogênicas hospúricas ou SSHHPS no vírus Zika ns2B/3 protease. Foram identificados quatro alvos de proteína hospedeira. FOXGS, SFRP1, uma subunidade Gsalpha de uma biblioteca de cDNA de retina, e o mitocondrial NT5M 5'3'nucleotidase.Os alinhamentos sequenciais do SSHHPS permitiram diferenças específicas das espécies nas sequências do local do decote. A sequência SFRP1 foi idêntica em humanos e galinhas, o que é notável porque o vírus Zika pode induzir mortalidade e microcefalia em embriões de frango. O ensaio contínuo foi utilizado para medir parâmetros cinéticos de estado estável e constantes de inibição para as sequências de poliproteína viral e o ensaio descontínuo foi utilizado para obter informações qualitativas de decote, como o decote de uma determinada sequência ou a inibição da protease por vários compostos.Um modelo da junção de encefalite equina venezuelana nsP1-nsP2 foi feito utilizando-se em métodos de silico. Para o protease nsP2, alongar a sequência do substrato e reduzir a força iônica do buffer levou a uma redução significativa na constante michaelis de decote de uma sequência de vírus da Floresta Semliki. Ao tentar este procedimento, é importante executar os controles.Substratos contendo as sequências virais do local do decote protease devem ser testados antes de prosseguir com a análise da sequência SSHHPS. Se o decote de uma proteína hospedeira for observado, devem ser realizados experimentos de acompanhamento para confirmar que essa proteína hospedeira afeta a replicação viral. Isso pode ser feito superexpressando ou silenciando a proteína e, em seguida, examinando os efeitos na replicação viral.O grupo IV contém um grande número de patógenos novos e emergentes. As sequências SSHHPS conectam proteínas específicas do hospedeiro e caminhos com as proteases virais de forma muito previsível.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imunologia e Infecção

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Estabelecer uma cultura líquida, coberta de vias respiratórias humanas epiteliais Polarized Calu-3 células para estudar a resposta Cell Host para patógenos respiratórios<em&gt; In vitro</em

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Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

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Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

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Extração de proteínas e 2-D métodos Eletroforese em Gel de<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espécies

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Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

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Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

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Os métodos in vitro para Comparando meta vinculativa e CDC indução Entre anticorpos terapêuticos: Aplicações em Análise Biosimilarity

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Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

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Métodos de alternativas In Vitro para a determinação da integridade estrutural do capsídeo Viral

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

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Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Deteção de cópia baixa número de DNA Viral integrado formado por In Vitro infecção de hepatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...