Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Эта работа была поддержана Агентством по уменьшению оборонной угрозы (DTRA) номерами проектов CB-SEED-SEED09-2-0061 и CBCall4-CBM-05-2-0019, а отчасти - программой интрамальных/экстраморальных исследований фондов NCATS, NIH (XH) и военно-морской исследовательской лаборатории.

Мнения, высказанные здесь, являются мнениями авторов и не представляют мнения ВМС США, армии США, Министерства обороны США или правительства США.

Последовательность конкретных уничтожения белка или нуклеиновой кислоты руководствоваться иностранной последовательности только видели в нескольких случаях в биологии. Механизмы, показанные на рисунке 1, являются защитительными механизмами, которые защищают хозяина от вируса или вируса от узла.
Используя биоинформатические методы, мы можем определить цели, которые уничтожаются этими системами. В нашем анализе последовательностей SSHHP, мы обнаружили, что многие из них могут быть найдены в белках, необходимых для создания врожденных иммунных реакций. Некоторые из них были очевидные роли, такие как MAVS и TRIF (TIR-домен-содержащих адаптер вызывающих интерферон-я), в то время как другие были связаны с иммунитетом, хотя и более сложные механизмы (например, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Целевая информация, хранящаяся в последовательности SSHHP, имеет потенциал для выявления путей, которые имеют противовирусные эффекты против этих вирусов. Противовирусные ответы in vivo часто являются вирусными26,43. Например, подмножества белков TRIM оказывают противовирусное воздействие на различные вирусы43,44,45, некоторые из них являются факторами вирусного ограничения (например, ВИЧ и ТРИМ5). Специфика белков TRIM (70 евро были определены) до сих пор изучается44,45. Информация в SSHHPS может способствовать нашему пониманию того, как эти вирусы уклоняются от врожденных иммунных реакций. Другие закономерности и корреляции могут быть обнаружены по мере изучения большего количества SSHHPS.
Видовые различия были очевидны в нашем анализе(Рисунок 2, Рисунок 10). Эти вирусы, как известно, влияют на некоторые виды больше, чем другие. Информация о диапазоне хоста, восприимчивости хоста и защите хоста может присутствовать в SSHHPS. Например, лошади, наиболее восприимчивые виды к вирусам конского энцефалита, не хватало области человека TRIM14, который был временно сокращен протеазой VEEV nsP2. Люди редко умирают от инфекций VEEV, но могут быть инфицированы24. Человеческий белок TRIM14 нес последовательность расщепления протеазы nsP26. Присутствие места расщепления свидетельствует о том, что люди имеют защитный механизм против этих вирусов. Птицы считались потенциальными резервуарами этих вирусов46. Соответствующая последовательность SSHHP в белке TRIM14 от кур отличалась от последовательностей, встречаемых у людей и других видов. Тонкие различия, как это может сделать целевой хозяин белка дяди или более легко расщепляться. Aguirre et al.16 показали, что неудающийся мутировавший белок STRING индуцировал более высокие уровни IFN после заражения вирусом Денге и что мыши, естественно, несут версию STING, которая не вырезана протеазой Dengue ns2B3. Белок murine STING не был вырезан протеизами47. В нашем анализе SSHHPS, мы также наблюдали различия в последовательности участка расщепления протеазы, когда мы сравнили человеческие белки с белками грызунов6 (Рисунок 10D). Воспроизведение видов конкретных протеолитических расщеплений белков-хозяев может иметь важное значение в животных моделях, используемых для вирусов группы IV. Ингибирование расщепления белка хозяина также имеет последствия в отношении развития ингибиторов протеазы группы IV. В нашей предыдущей публикации, мы показали, что мы могли бы ингибировать РАСщепление TRIM14 по протеазаve VEEV nsP2 с помощью CA074 метиловый эфир6. Этот результат показывает, что небольшие молекулы ингибиторы этих протеаз может быть в состоянии модулировать врожденные иммунные реакции, которые способны подавлять инфекцию6,31.
Генетические изменения в пределах вида также имеет потенциал для того чтобы произвести разницы в протеолическом расщеплении. Тонкие различия в использовании кодона может повлиять на рибосому паузы48. Так как некоторые группы IV вирусные протеазы встроены в мембрану ER, различия в этих паузах может повлиять на расщепление цели, если расщепление происходит совместно. Некоторые из участков расщепления, которые мы определили, были в прогнозируемых последовательности пептида сигнала (например, SFRP1), в то время как другие были внутренними.
Анализ SSHHPS может дать информацию, которая отличается от других методов анализа белка хозяина. Анализ SSHHPS был недорогим и простым в использовании. Использование бактериальной системы экспрессии позволило проверить короткие сегменты (25 аминокислот) последовательностей млекопитающих без использования культуры клеток млекопитающих. Мы обнаружили, что субстраты CFP-YFP были в состоянии переносить все проверенные последовательности белка человека; однако урожайность варьировалась. В аналогичных анализах субстраты, содержащие последовательности белка человека, до тех пор, пока 63 аминокислоты были успешно выражены, очищены и использованы для кинетической анализа и ингибитора скрининга49,50,51. Поскольку для прерывистого исследования требуется лишь небольшое количество субстрата, можно изучить большое количество целей. Одним из преимуществ системы является то, что субстраты CFP/YFP могут быть использованы для анализа SDS-PAGE и для более сложных кинетический анализ (т.е. IC50, Ki, Km,Vmax). Для обнаружения наркотиков, ингибирующие соединения могут производить артефакты в флуоресцентных анализов. Таким образом, прерывистое анализ в сочетании с непрерывным анализом позволяет подтвердить расщепление или ингибирование декольте. Образцы для прерывистого SDS-PAGE-асссса могут быть взяты непосредственно из 96-колодцев. CFP / YFP субстраты были использованы для комплексного скринингабиблиотеки 52. Тем не менее, необходимы дополнительные анализы, чтобы определить, подходит ли субстрат для скрининга высокой пропускной всей входной, например, для расчетакоэффициента 53.
Одной из задач при проектировании субстрата является определение региона вокруг ножниц, которые связаны и распознаны протеаза. В приведенных здесь примерах мы начали с 12 последовательностей остатков, которые были сосредоточены вокруг ножниц. После анализа последовательности выравнивания расщепления сайтов гомологии остатков N-терминал аж ножницы была найдена для протеазы VEEV, в то время как для гомологии протеазы ЗИКВ к нескольким c-терминал остатков был найден. В силико модель состыковатого субстрата может быть использована для разработки на сайте направлены мутагенез эксперименты, которые зондируют связывающих сайтов субстрата. Так как субстрат и ферментные последовательности находятся на плазмидах, либо можно мутировать, чтобы проверить в силико-моделях или допусков подсайта. Это может быть выгодно, если кристаллическая структура связанного субстрата (ы) недоступна.
Анализ SSHHPS может также дать новую информацию о механизмах, с помощью которых вирус-индуцированные фенотипы производятся вирусными ферментами. Одна из целей ЗИКВ, SFRP1, является частью Пути Сигнализации Wnt и играет роль в развитии мозга и глаз и в иммунных реакциях36,37,54,55,56,57. Мы обнаружили, что другие белковые последовательности, которые могут быть сокращены протеазой ziKV ns2B/ns3, также содержатся в белках, участвующих в развитии мозга и глаз; аномалии в обоих наблюдались при врожденном синдроме Зика и, как полагают, являются частью вирус-индуцированного фенотипа58.
Предсказуемость взаимодействий между хозяином и патогеном может быть использована для различных применений: специфических онколитических вирусных методов; де-риск живых вирусных вакцин; уточнение, прогнозирование или выбор моделей животных; прогнозирование дальности или восприимчивости к хозяину; прогнозирование зоонозных событий; и прогнозирование защиты хозяев. Поскольку описанные методы основаны на последовательности, они могут иметь ценность для включения в программное обеспечение в будущем.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

Альфавирусные ферменты синтезируются в одном полипептиде. Неструктурный полипротеин (nsP) обрабатывается его протеазой цистеина nsP2 для производства активных ферментов, необходимых для репликации вируса. Вирусные протеазы очень специфичны и распознают сохраненные последовательности мотивов участка расщепления (аминокислоты No6-8). В нескольких группах IV вирусов, nsP протеазы (ы) расщепления сайте мотив последовательности можно найти в конкретных белков хозяина, участвующих в генерации врожденных иммунных реакций и, в некоторых случаях, целевые белки, как представляется, связаны с вирусом индуцированного фенотипа. Эти вирусы используют короткие участки гомологичных хост-патогенных белковых последовательностей (SSHHPS) для целенаправленного уничтожения белков-хозяев. Для выявления SSHHPS вирусный протеаза декольте сайте мотив последовательности могут быть введены в BLAST и геном хозяина (ы) можно искать. Расщепление первоначально может быть проверено с помощью очищенной nsP вирусной протеазы и флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET) субстратов, сделанных в кишечной палочке. Фрет субстраты содержат цианский и желтый флуоресцентный белок и последовательность участка расщепления (CFP-sequence-YFP). Этот протеаза асссе можно использовать непрерывно в считывателе плиты или discontinuously в гелях SDS-PAGE. Модели связанных пептидных субстратов могут быть созданы в силико для руководства по отбору субстратов и исследованиям мутагенеза. Субстраты CFP/YFP также использовались для выявления ингибиторов протеазы. Эти in vitro и в методах silico можно использовать в комбинации с клеточными анализами для того чтобы обусловить если пристрелнный протеин хозяина влияет на вирусную репликацию.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Мы представляем общий протокол для выявления коротких участков гомологичных хост-патогенных белковых последовательностей (SSHHPS), встроенных в вирусный полипротеин. SSHHPS распознаются вирусными протеазами и направляют целенаправленное уничтожение конкретных белков-хозяев несколькими вирусами группы IV.

Анализ группы IV Вирусные SSHHPS Использование в пробирке и в Силико методы

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Мы показали, что вирусные геномы группы IV кодируют короткие участки последовательностей белка-хозяина. Эти последовательности можно найти в вирусных сайтов расщепления протеазы. Они используются для целенаправленного уничтожения белков-хозяй, как правило, белков, участвующих в генерации иммунных реакций.Основным преимуществом использования протеазы анализов является то, что он удаляет сложность клетки и показывает, действительно ли вирусная протеаза может расщепить определенную последовательность. Итак, когда мы проанализировали последовательности вируса Зика SSHHPS, мы обнаружили, что протеаза может сократить последовательности в белках, участвующих в генерации иммунных реакций, и что некоторые из этих белков также сыграли роль в развитии мозга и глаз. При выполнении этого метода в первый раз, следует помнить, что если расщепление не наблюдается, что это может быть связано с различными факторами, такими как активность протеазы.Демонстрацией процедуры будет Джейми Комптон, техник из моей лаборатории. Начните с открытия Protein BLAST и поместите 20 аминокислот, окружающих scissile связи и вирусного полипротеина и выбрать неизлишние последовательности белка затем введать в геном хозяина для поиска. При необходимости выберите PHI-BLAST и ввемите в последовательность шаблонов, где квадратные скобки указывают на то, что либо аминокислота в скобках может быть в положении замены, а затем ударить BLAST.Порядок ранга BLAST хитов на основе количества последовательных идентичных или допускаемых остатков, которые соответствуют последовательности сайта расщепления. Из списка выберите белки, содержащие шесть или более идентичных или аналогичных остатков для анализа в протеазных анализах. Постройте плазмидную кодировку цианового флуоресцентного белка, до 25 аминокислот последовательности расщепления и желтого флуоресцентного белка.Далее подготовьтесь к субстратам CFP и YFP, привив четыре четырехлитровые колбы с 25 миллилитров ночной культуры. Встряхните культуры при 37 градусах цельсия и отслеживай рост ехай с помощью уф-виз спектроскопии на 600 нанометров. Когда бактерии достигают поглощения около одного, индуцировать выражение белка, добавив 0,5 миллилитров одного молярного IPTG к каждой колбе, а затем снизить температуру встряхивания инкубатора до 17 градусов по Цельсию и позволяют выражение продолжать на ночь в течение 17 до 20 часов.На следующий день, гранулы бактерий центрифугации в 7000 раз г в течение 10 минут при 4 градусах по Цельсию. Удалите и отбросьте жидкие средства массовой информации затем хранить гранулы при температуре минус 80 градусов по Цельсию или приступить к лизу клеток. Чтобы вылизать клетки, подготовьте 100 миллилитров буфера лиза в соответствии с рукописными указаниями, повторно посовелите гранулы в буфер и перенесите от 25 до 25 миллилитров суспензии в 50 миллилитров одноразовых конических трубок.Поместите трубки в пластиковый стакан с ледяной водой, а затем вставьте наконечник sonicator в трубку, так что кончик составляет около одного сантиметра от нижней части трубки и sonicate лисировать 10 до 20 раз, пока он не станет жидкости и liquified. После sonication, передача ликата на высокой скорости центрифуги труб и центрифуги его на 20, 500 х г в течение 30 минут при 4 градусах по Цельсию. Перенесите супернатант в чистую бутылку и отбросьте гранулы.Загрузите лисат на столбец никеля, затем вымойте столбец двумя объемами столбца буфера А, а затем пятью объемами столбца 20%buffer B.Absorbance на 280 нанометров увеличится во время стирки, так как загрязняющие вещества выходят из колонны. Продолжайте мыть, пока A280 не вернется к базовым значениям. Затем уберите белок с двумя-тремя объемами колонки 100%buffer B и соберите 10 миллилитров фракций, убедившись, что для измерения A280 каждой фракции.Подготовьте восемь смесей реакций в соответствии с рукописными указаниями и пипетку 45 микролитров каждой смеси в первые три колодца каждого ряда черной половины площади 96-колодец пластины. Настройка считыватель пластин для одновременного обнаружения флоресцев на двух длинах волн с фиксированной настройкой трубки photomultiplier. Программа времени чтения до 20 до 30 минут с одним чтением в минуту и выбрать скважины для чтения.Вставьте пластину в машину и запустите считыв, отслеживая коэффициенты выбросов с течением времени. Вы запустите конечную точку чтения пластины, содержащей необрезанный понюхать. Удалите пластину и пипетку пять микролитров фермента в каждую колодец.Первый столбец можно сохранить как необрезанный элемент управления. Затем прочитайте пластину снова в течение 20 до 30 минут, убедившись, что установить считыватель пластины для вывода абсолютных значений. После того, как чтение завершено, печать пластины с пленкой, чтобы предотвратить испарение и оставить его на ночь при комнатной температуре, чтобы фермент полностью сократить субстрат.Через 24 часа снимите пленку и выполните чтение конечной точки пластины. Среднее соотношение выбросов и записывать их как сокращение. Подтвердите расщепление субстрата с помощью SDS-PAGE.Загрузите молекулярный маркер веса в первую или последнюю полосу и загрузите пять микролитров каждой реакционной смеси в полосу геля, начиная с необрезанной реакции. Прикрепите электроды гелеобразного бака к источнику питания и запустите продукты на 110 вольт в течение 60 минут. Удалите гель из кассеты с помощью инструмента растрескивания и погрузите его в 5-10 миллилитров раствора окрашивания.Через 1-24 часа удалите лишнее пятно и погрузите гель в воду. Затем смойте гель с помощью гель-изображения. Чтобы подготовить белковую структуру, загрузите файл белка PDB в МЧС.Нажмите Выберите и Solvent, а затем удалить растворитель. Откройте панель pPreparation Structure из верхней панели меню Compute и автоматически исправите все структурные элементы, нажав на Correct. Протонировать структуру, нажав Протонат 3D.Добавьте частичные заряды к белку, открыв панель частичных зарядов и выбрав AMBER 99 и отрегулируйте водород и одинокие пары по мере необходимости. Затем сохраните файл структуры. Чтобы построить структуру для пептидов субстрата и TRIM14, откройте панель Protein Builder, введите последовательность субстрата и выберите Auto Repack.Затем установите геометрию как расширенную и нажмите на Build. Наконец свести к минимуму структуру и сохранить его в качестве файла PDB. Пристыковать пептиды субстрата к VEEV-nsP2 с помощью программного обеспечения PyRx AudoDock 4.2.Загрузите белок, нажмите правой кнопкой мыши и выберите Make Macromolecule, чтобы подготовить файл стыковки PDB'T. Затем загрузите молекулу субстрата и выберите Make Ligand, чтобы подготовить файл стыковки лиганда. Запустите мастера AutoDock на стыковочной панели внизу и выберите подготовленные лигандовые и белковые файлы.Определите белково-связывающий карман, вручную регулируя размер сетки, а затем запустите AuotGrid. Затем запустите AutoDock и выберите метод ламаркского генетического алгоритма. Нажмите на параметры стыковки и установите количество GA работает до 50 затем нажмите на вперед, чтобы начать стыковку перспективе.Когда AutoDock будет завершена, откройте панель анализировать результаты и проинспектируйте все прогнозируемые позы связывания. Выберите лучшую модель с самой низкой прогнозируемой связывающей энергией и разумными связывающими взаимодействиями между cis-477 и субстратом на сайте расщепления, затем сохраните ее в виде файла PDB для дальнейшего моделирования MD. После прочтения связывающих поз с AutoDock, важно выполнить пост-доковый анализ, чтобы определить правдоподобную модель связывания для уточнения с помощью моделирования MD.Этот протокол был использован, чтобы найти короткие участки гомологичный хост-патоген белковых последовательностей или SSHHPS в вирусе Зика ns2B/3 протеазы. Было выявлено четыре цели белка-хозяина. FOXGS, SFRP1, подразделение Gsalpha из библиотеки кДНК сетчатки и митохондриальная 5'3'нуклеотидаза NT5M.Последовательности выравнивания SSHHPS позволили видов конкретных различий в последовательности сайта расщепления. Последовательность SFRP1 была идентична у людей и кур, что примечательно, потому что вирус Зика может вызвать смертность и микроцефалию у куриных эмбрионов. Непрерывный анализ был использован для измерения устойчивых параметров состояния кинетического и ингибирования констант для вирусных последовательностьх полипротеина и прерывистый анализ был использован для получения качественной информации о расщеплении, таких как расщепление определенной последовательности или ингибирование протеазы различными соединениями.Модель венесуэльского конского энцефалита nsP1-nsP2 была сделана с использованием силико методов. Для nsP2 protease удлинение последовательности субстрата и снижение ионной прочности буфера привело к значительному сокращению постоянной расщепления последовательности вируса Semliki Forest. При попытке этой процедуры важно запускать элементы управления.Субстраты, содержащие вирусные последовательности участка расщепления протеазы, должны быть протестированы, прежде чем приступить к анализу последовательности SSHHPS. Если расщепление белка-хозяина наблюдается, последующие эксперименты должны быть проведены, чтобы подтвердить, что этот белок-хозяин влияет на репликацию вируса. Это может быть сделано путем переэкспрессии или заглушая белок, а затем изучение влияния на репликацию вируса.Группа IV содержит большое количество новых и возникающих патогенов. Последовательности SSHHPS связывают специфические протеины хозяина и пути с вирусными proteases в очень предсказуемом образе.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Генотипическая вывода ВИЧ-1 тропизм Использование Популяционные Секвенирование V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Создание жидкого покрытые культуры поляризованный человека эпителия дыхательных путей Calu-3 ячейки по изучению клетки-хозяина в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей<em&gt; В пробирке</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Количественный<em&gt; В пробирке</em&gt; Анализе на определение адгезию нейтрофилов к активированным Первичные человеческие эндотелиальные клетки микрососудов в статических условиях

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Всего экстракции белка и 2-D электрофореза в геле Методы<em&gt; Burkholderia</em&gt; Вид

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

В методах Vitro для сравнения цели связывания и CDC Индукционные Между терапевтических антител применения в анализе Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Альтернативные в Vitro методы для определения вирусного капсида структурной целостности

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Обнаружение низких копии число комплексных вирусной ДНК, образованный в Vitro инфекции гепатита B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...