Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por los números de proyecto de la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA) CB-SEED-SEED09-2-0061 y CBCall4-CBM-05-2-0019, y en parte por el programa de investigación intramuros/extramuros de los fondos base NCATS, NIH (XH) y del Laboratorio de Investigación Naval.

Las opiniones expresadas aquí son las de los autores y no representan las de la Marina de los Estados Unidos, el Ejército de los Estados Unidos, el Departamento de Defensa de los Estados Unidos o el gobierno de los Estados Unidos.

La destrucción específica de una proteína o un ácido nucleico guiado por una secuencia extraña sólo se ve en unos pocos casos en biología. Los mecanismos que se muestran en la Figura 1 son mecanismos defensivos que protegen a un host de un virus o un virus de un host.
Utilizando métodos bioinformáticos podemos identificar los objetivos que son destruidos por estos sistemas. En nuestros análisis de secuencias SSHHP, descubrimos que muchas de ellas se podían encontrar en las proteínas necesarias para generar respuestas inmunitarias innatas. Algunos tenían funciones obvias como MAVS y TRIF (TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-- , mientras que otros estaban relacionados con la inmunidad a través de mecanismos más complejos (por ejemplo, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. La información de destino almacenada en la secuencia SSHHP tiene el potencial de identificar vías que tienen efectos antivirales contra estos virus. Las respuestas antivirales in vivo suelen ser específicas del virus26,43. Por ejemplo, subconjuntos de proteínas TRIM tienen efectos antivirales en diferentes virus43,44,45, algunos son factores de restricción viral (por ejemplo, VIH y TRIM5). La especificidad de las proteínas TRIM (se han identificado 70 euros) todavía se está examinando44,45. La información dentro de SSHHPS puede contribuir a nuestra comprensión de cómo estos virus evaden las respuestas inmunitarias innatas. Otros patrones y correlaciones pueden ser descubiertos a medida que se examinan más SSHHPS.
Las diferencias específicas de las especies fueron evidentes en nuestros análisis(Figura 2, Figura 10). Se sabe que estos virus afectan a algunas especies más que a otras. La información sobre el rango de host, la susceptibilidad del host y las defensas del host puede estar presente en SSHHPS. Por ejemplo, equino, la especie más susceptible a los virus de la encefalitis equina, carecía de la región de TRIM14 humano que fue cortada transitoriamente por la proteasa VEEV nsP2. Los seres humanos rara vez mueren a causa de infecciones por VEEV, pero pueden estar infectados24. La proteína humana TRIM14 llevaba una secuencia de escote de proteasa nsP26. La presencia del sitio de escisión sugiere que los seres humanos tienen un mecanismo de defensa contra estos virus. Se ha pensado que las aves son posibles reservorios de estos virus46. La secuencia SSHHP correspondiente en la proteína TRIM14 de los pollos difería de las secuencias encontradas en humanos y otras especies. Las diferencias sutiles como estas pueden hacer que una proteína huésped objetivo ativable o más fácilmente se cierre. 16 mostraron que una proteína STRING mutada inducible indujo niveles más altos de IFN después de la infección por el virus del dengue y que los ratones llevan naturalmente una versión de STING que no es cortada por la proteasa dengue ns2B3. La proteína murina STING no fue cortada por la proteasa ZIKV47. En nuestro análisis SSHHPS, también observamos diferencias en las secuencias de sitio de escisión de proteasa ZIKV cuando comparamos las proteínas humanas con las de los roedores6 (Figura 10D). La reproducción de las escotes proteolíticas específicas de la especie de proteínas huésped puede ser importante en los modelos animales utilizados para los virus del Grupo IV. La inhibición del escote de proteína huésped también tiene implicaciones con respecto al desarrollo de inhibidores de la proteasa del Grupo IV. En nuestra publicación anterior, mostramos que podríamos inhibir el escote TRIM14 por la proteasa VEEV nsP2 usando el éster metilo CA0746. Este resultado sugiere que los inhibidores de moléculas pequeñas de estas proteasas pueden ser capaces de modular las respuestas inmunitarias innatas que son capaces de suprimir la infección6,31.
La variación genética dentro de una especie también tiene el potencial de producir diferencias en el escote proteolítico. Diferencias sutiles en el uso de codón podrían afectar a la pausa ribosoma48. Dado que algunas proteasas virales del Grupo IV están incrustadas en la membrana er, las diferencias en estas pausas podrían afectar a la escisión de un objetivo si la escisión se produce de forma co-traduccional. Algunos de los sitios de escisión que identificamos estaban en secuencias de péptidos de señal pronosticadas (por ejemplo, SFRP1) mientras que otros eran internos.
El análisis SSHHPS puede producir información que difiere de otros métodos de análisis de proteínas huésped. El análisis SSHHPS era barato y fácil de emplear. El uso de un sistema de expresión bacteriana permitió la prueba de segmentos cortos (25 aminoácidos) de secuencias de mamíferos sin el uso del cultivo celular de mamíferos. Encontramos que los sustratos de CFP-YFP eran capaces de tolerar todas las secuencias de proteínas humanas probadas; sin embargo, los rendimientos variaron. En ensayos similares, sustratos que contienen secuencias de proteínas humanas hasta 63 aminoácidos fueron expresados, purificados y utilizados con éxito para análisis cinéticos y cribado de inhibidores49,50,51. Dado que sólo se necesitan pequeñas cantidades del sustrato para el ensayo discontinuo, se puede explorar un gran número de objetivos. Una ventaja del sistema es que los sustratos CFP/YFP se pueden utilizar para análisis SDS-PAGE y para análisis cinéticos más elaborados (es decir, IC50,Ki, Km, Vmáx.). Para el descubrimiento de fármacos, los compuestos inhibitorios pueden producir artefactos en ensayos fluorescentes. Por lo tanto, el ensayo discontinuo en combinación con un ensayo continuo permite confirmar el escote o la inhibición del escote. Las muestras para el ensayo discontinuo SDS-PAGE se pueden sacar directamente de las placas de 96 pocillos. Los sustratos CFP/YFP se han utilizado para el cribado de bibliotecas compuestas52. Sin embargo, se requieren análisis adicionales para determinar si un sustrato es adecuado para la detección de alto rendimiento, como el cálculo de un factor Z53.
Un desafío en el diseño de un sustrato es identificar la región alrededor de la unión escisil que está unida y reconocida por la proteasa. En los ejemplos que se muestran aquí, comenzamos con 12 secuencias de residuos que se centraron alrededor de la unión escisil. Después de analizar las alineaciones de secuencia de los sitios de escote se encontró la homología a los residuos N-terminal de la unión escisil para la proteasa VEEV, mientras que para la homología proteasa ZIKV a varios de los residuos C-terminal se encontró. Un modelo in silico del sustrato acoplado se puede utilizar para diseñar experimentos de mutagénesis dirigidos por el sitio que sondean los sitios de unión del sustrato. Dado que las secuencias de sustrato y enzimas están en plásmidos, cualquiera de los dos puede ser mutado para probar los modelos in silico o tolerancias subsitio. Esto puede ser ventajoso si una estructura cristalina del sustrato (s) unido (s) no está disponible.
El análisis SSHHPS también puede producir nueva información sobre los mecanismos por los cuales los fenotipos inducidos por virus son producidos por enzimas virales. Uno de los objetivos de ZIKV, SFRP1, es parte de la vía de señalización Wnt y tiene funciones tanto en el desarrollo del cerebro como de los ojos y en las respuestas inmunitarias36,37,54,55,56,57. Encontramos que las otras secuencias de proteínas que podrían ser cortadas por la proteasa ZIKV ns2B/ns3 también estaban en proteínas involucradas en el desarrollo del cerebro y los ojos; se han observado anomalías en ambos en el síndrome de Zika congénito y se cree que forman parte del fenotipo58inducido por el virus.
La previsibilidad de las interacciones huésped-patógeno podría ser aprovechada para una variedad de aplicaciones: terapias virales oncolíticas específicas de objetivos; desariesgo rinde riesgo a las vacunas contra los virus vivos; perfeccionamiento, predicción o selección de modelos animales; predicción del alcance del host o susceptibilidad; predicción de eventos zoonóticos; y la predicción de las defensas de los anfitriones. Dado que los métodos descritos se basan en secuencias, pueden ser de valor para incorporar en el software en el futuro.

La evidencia de la transferencia horizontal de genes del virus al huésped, o del huésped al virus, se puede encontrar en una variedad de genomas1,2,3,4. Ejemplos de endogenización viral son las secuencias espaciadoras CRISPR que se encuentran en los genomas del huésped bacteriano4. Recientemente, hemos encontrado evidencia de secuencias de proteínas huésped incrustadas en las poliproteínas no estructurales de virus (+)ssRNA Group IV. Estas secuencias dentro de las regiones codificacionales del genoma viral se pueden propagar generacionalmente. Los tramos cortos de secuencias de proteínas homólogas-patógenas (SSHHPS) se encuentran en el virus y el host5,6. SSHHPS son las secuencias de motivos del sitio de escisión conservadas reconocidas por las proteasas virales que tienen homología con proteínas anfitrionas específicas. Estas secuencias dirigen la destrucción de proteínas huésped específicas.
En nuestra publicación anterior6, compilamos una lista de todas las proteínas anfitrionas que fueron objetivo de las proteasas virales y encontramos que la lista de objetivos no era aleatoria(Tabla 1). Dos tendencias eran evidentes. En primer lugar, la mayoría de las proteasas virales que cortan las proteínas huésped pertenecían a virus del Grupo IV (24 de los 25 casos implicados en proteasas virales del Grupo IV), y una proteasa pertenecía a los retrovirus del Grupo VI (VIH, virus de inmunodeficiencia humana)7. En segundo lugar, las dianas de proteína huésped cortadas por las proteasas virales generalmente estaban involucradas en la generación de las respuestas inmunitarias innatas que sugerían que los escotes estaban destinados a antagonizar las respuestas inmunitarias del huésped. La mitad de las proteínas huésped atacadas por las proteasas virales eran componentes conocidos de las cascadas de señalización que generan interferón (IFN) y citoquinas proinflamatorias (Tabla 1). Otros participaron en la transcripción de la célula anfitriona8,9,10 o traducción11. 4han demostrado que muchas secuencias de protoespaciales CRISPR corresponden a genes implicados en la conjugación o replicación del plásmido4.
El Grupo IV incluye, entre otros, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae y Togaviridae. Varios patógenos nuevos y emergentes pertenecen al Grupo IV, como el virus del Zika (ZIKV), el Nilo Occidental (WNV), el Chikungunya (CHIKV), el virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y el virus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). El genoma (+)ssRNA es esencialmente un pedazo de ARNm. Para producir las enzimas necesarias para la replicación del genoma, primero debe traducirse el genoma (+)ssRNA. En alfavirus y otros virus del Grupo IV, las enzimas necesarias para la replicación se producen en una sola poliproteína (es decir, nsP1234 para el VEEV). La poliproteína no estructural (nsP) se procesa proteolíticamente (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) por la proteasa nsP2 para producir enzimas activas12 (Figura 1). El escote de la poliproteína por la proteasa nsP2 es esencial para la replicación viral; esto se ha demostrado mediante la eliminación y mutagénesis dirigida por el sitio de la cisteína del sitio activo de la proteasa nsP213,14. En particular, la traducción de proteínas virales precede a los eventos de replicación del genoma. Por ejemplo, nsP4 contiene la ARN polimerasa dependiente del ARN necesaria para replicar el genoma del ARN (+). La replicación del genoma puede producir intermedios dsRNA; estos intermedios pueden desencadenar las respuestas inmunitarias innatas del huésped. Por lo tanto, estos virus pueden separar las proteínas de respuesta inmune innatas del huésped al principio de la infección con el fin de suprimir sus efectos15,16,17.
El silenciamiento puede ocurrir a nivel de ADN, ARN y proteína. Lo que es común a cada uno de los mecanismos de silenciamiento mostrados en la Figura 1 es que se utilizan secuencias cortas de ADN extraño, ARN o proteínas para guiar la destrucción de objetivos específicos para antagonizar su función. Los mecanismos de silenciamiento son análogos a los programas de "búsqueda y eliminación" que se han escrito en tres idiomas diferentes. La secuencia de sitio de escisión corta es análoga a una "palabra clave". Cada programa tiene una enzima que reconoce la coincidencia entre la secuencia corta (la "palabra clave") y una palabra en el "archivo" que se va a eliminar. Una vez que se encuentra una coincidencia, la enzima corta ("elimina") la secuencia de destino más grande. Los tres mecanismos que se muestran en la Figura 1 se utilizan para defender al huésped de virus o para defender un virus del sistema inmunitario de un huésped.
Las proteasas virales reconocen secuencias de motivos cortos del sitio de escisión entre los aminoácidos de 2 a 11 años; en nucleótidos, esto correspondería a 6-33 bases. A modo de comparación, las secuencias de espaciadores CRISPR son de 26-72 nucleótidos y los ARNi son de 20 a 22 nucleótidos18,19. Aunque estas secuencias son relativamente cortas, se pueden reconocer específicamente. Dada la mayor diversidad de aminoácidos, la probabilidad de un evento de escisión aleatoria es relativamente baja para una proteasa viral que reconoce secuencias de proteínas de 6-8 aminoácidos o más. La predicción de SSHHPS en proteínas huésped dependerá en gran medida de la especificidad de la proteasa viral que se está examinando. Si la proteasa tiene requisitos estrictos de especificidad de secuencia, la posibilidad de encontrar una secuencia de sitio de escisión es de 1/206 a 1 en 64 millones o 1/208 a 1 en 25.600 millones; sin embargo, la mayoría de las proteasas tienen tolerancias de subsitio variables (por ejemplo, R o K pueden tolerarse en el sitio S1). Por lo tanto, no hay ningún requisito para la identidad de secuencia entre las secuencias encontradas en el host frente al virus. Para las proteasas virales que tienen requisitos de secuencia más flexibles (como los que pertenecen a Picornaviridae) la probabilidad de encontrar un sitio de escisión en una proteína huésped puede ser mayor. Muchas de las entradas de la Tabla 1 son de la familia Picornaviridae.
La notación Schechter & Berger20 se utiliza comúnmente para describir los residuos en un sustrato de proteasa y los subsitios a los que se unen, utilizamos esta notación en todo. Los residuos en el sustrato que son N-terminal de la unión scissile se indican como P3-P2-P1, mientras que los que son C-terminal se indican como P1'-P2'-P3'. Los subsitios correspondientes en la proteasa que unen estos residuos de aminoácidos son S3-S2-S1 y S1'-S2'-S3', respectivamente.
Para determinar qué proteínas huésped están siendo atacadas, podemos identificar SSHHPS en los sitios de escisión de poliproteína viral y buscar las proteínas huésped que las contienen. En este documento, delineamos procedimientos para identificar SSHHPS utilizando secuencias de sitios de escisión de proteasa viral conocidas. Los métodos bioinformáticos, los ensayos de proteasa y los métodos de silico descritos están destinados a utilizarse junto con ensayos basados en células.
Las alineaciones secuenciales de las proteínas huésped a las que se dirigen las proteasas virales han revelado diferencias específicas de cada especie dentro de estas secuencias cortas del sitio de escisión. Por ejemplo, se encontró que la proteasa del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) nsP2 cortó la proteína humana TRIM14, un motivo tripartito (TRIM)6. Algunas proteínas TRIM son factores de restricción viral (por ejemplo,TRIM5-21), la mayoría se cree que son ligasas de ubiquitina E3. TRIM14 carece de un dominio RING (realmente interesante nuevo gen) y no se cree que sea una ligasa E322. SE ha propuesto que TRIM14 sea un adaptador en el mechondriés antiviral mitocondrial (MAVS)22, pero puede tener otras funciones antivirales23. La alineación de las secuencias TRIM14 de varias especies muestra que el equino carece del sitio de escisión y alberga una versión truncada de TRIM14 que le falta el dominio PRY/SPRY del terminal C. Este dominio contiene un sitio de poliubiquitinación(Figura 2). En equino, estos virus son altamente letales (20-80% de mortalidad) mientras que en los seres humanos sólo el 1% muere a causa de las infecciones por VEEV24. El escote del dominio PRY/SPRY puede cortocircuitar transitoriamente la cascada de señalización MAVS. Esta cascada puede ser desencadenada por dsRNA y conduce a la producción de interferón y citoquinas proinflamatorias. Por lo tanto, la presencia del SSHHPS puede ser útil para predecir qué especies tienen sistemas de defensa contra virus específicos del Grupo IV.
En los virus del Grupo IV, se cree que los mecanismos de antagonismo IFN multiplican redundantes25. El escote de proteína huésped puede ser transitorio durante la infección y las concentraciones pueden recuperarse con el tiempo. Encontramos en las células que los productos de escisión TRIM14 podrían detectarse muy temprano después de la transfección (6 h) con un plásmido que codifica la proteasa (promotor del citomegalovirus). Sin embargo, en períodos más largos, no se detectaron los productos de escisión. En las células infectadas por virus, la cinética era diferente y los productos de escisión podían detectarse entre 6-48 h6. Otros han reportado la aparición de productos de escote de proteína huésped tan pronto como 3-6 h después de la infección9,11.
La actividad proteolítica en las células es a menudo difícil de detectar; los productos de escote pueden variar en su solubilidad, concentración, estabilidad y vida útil. En los ensayos a base de células, no se puede suponer que los productos de escote se acumularán en una célula o que las intensidades de la banda de proteínas cortadas y no cortadas mostrarán aumentos y disminuciones compensatorias, ya que la proteína cortada puede degradarse muy rápidamente y no puede ser detectable en una mancha occidental a un peso molecular esperado (MW) (por ejemplo, la región que contiene el epitope podría ser cortada por otros proteases del huésped o podría ser ubinada). Si el sustrato de la proteasa viral es una proteína de respuesta inmune innata, su concentración puede variar durante la infección. Por ejemplo, algunas proteínas de respuesta inmune innatas están presentes antes de la infección viral y son inducidas aún más por el interferón26. Por lo tanto, la concentración de la proteína diana puede fluctuar durante la infección y la comparación de los lysates celulares infectados no infectados puede ser difícil de interpretar. Además, es posible que todas las células no estén transfiguradas o infectadas de forma uniforme. Los ensayos de proteasa in vitro que utilizan proteínas purificadas de E. coli, por otro lado, tienen menos variables para controlar y tales ensayos se pueden hacer usando SDS-PAGE en lugar de inmunoblots. Las proteasas contaminantes pueden inhibirse en los primeros pasos de la purificación proteica del sustrato de CFP/YFP, y las proteasas virales mutadas se pueden purificar y probar como controles para determinar si el escote se debe a la proteasa viral o a una proteasa bacteriana contaminante.
Una limitación de los ensayos de proteasa in vitro es que carecen de la complejidad de una célula de mamífero. Para que una enzima corte su sustrato, los dos deben ser colocalizados. Las proteasas virales del grupo IV difieren en la estructura y la localización. Por ejemplo, la proteasa ZIKV está incrustada en la membrana de retículo endoplasmático (ER) y se enfrenta al citosol, mientras que la proteasa VEEV nsP2 es una proteína soluble en el citoplasma y el núcleo27. Algunas de las secuencias de sitios de escote encontradas en el análisis DE ZIKV SSHHPS estaban en péptidos de señal que sugieren que el escote podría ocurrir de forma co-traduccional para algunos objetivos. Por lo tanto, la ubicación de la proteasa y el sustrato en la célula también debe ser considerado en estos análisis.
Los ensayos a base de células pueden ser valiosos para establecer un papel para las proteínas huésped identificadas en la infección. Los métodos que tienen como objetivo detener la escisión de la proteasa viral de proteínas huésped como la adición de un inhibidor de la proteasa6 o una mutación en la dianahuésped 16 se pueden utilizar para examinar sus efectos en la replicación viral. La sobreexpresión de la proteína dirigida también puede afectar la replicación viral28. Los ensayos de placa u otros métodos se pueden utilizar para cuantificar la replicación viral.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

Las enzimas alfavirales se sintetizan en un solo polipéptido. La poliproteína no estructural (nsP) es procesada por su nsP2 cisteína proteasa para producir enzimas activas esenciales para la replicación viral. Las proteasas virales son muy específicas y reconocen secuencias de motivos de sitios de escote conservadas (6-8 aminoácidos). En varios virus del Grupo IV, las secuencias de motivos del sitio de escisión de la proteasa nsP se pueden encontrar en proteínas de huésped específicas implicadas en la generación de las respuestas inmunitarias innatas y, en algunos casos, las proteínas dirigidas parecen estar vinculadas al fenotipo inducido por el virus. Estos virus utilizan tramos cortos de secuencias de proteínas homolopégicos de patógenos del huésped (SSHHPS) para la destrucción específica de proteínas huésped. Para identificar SSHHPS, se pueden introducir secuencias de motivos de sitios de proteasa viral en BLAST y se pueden buscar los genomas del huésped. El escote inicialmente se puede probar utilizando los sustratos purificados de proteasa viral nsP y transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) fabricados en E. coli. Los sustratos de FRET contienen proteína fluorescente cian y amarilla y la secuencia del sitio de escisión (CFP-sequence-YFP). Este ensayo de proteasa se puede utilizar continuamente en un lector de placas o de forma discontinua en geles SDS-PAGE. Los modelos de los sustratos peptídicos unidos se pueden generar en silico para guiar la selección del sustrato y los estudios de mutagénesis. Los sustratos de CFP/YFP también se han utilizado para identificar inhibidores de la proteasa. Estos métodos in vitro e in sálico se pueden utilizar en combinación con ensayos basados en células para determinar si la proteína huésped dirigida afecta la replicación viral.

El análisis SSHHPS de la proteasa ZIKV ns2B/3 identificó 4 dianas de proteína huésped: FOXG1, SFRP1, una subunidad alfa Gs de una biblioteca de ADNc de retina, y la midtocondrial NT5M 5',3'-nucleotidase (Figura 10)6. En particular, ningún otro método predijo estas proteínas como objetivos potenciales de la proteasa ZIKV. Las mutaciones en el gen FOXG1 se han relacionado con un síndrome congénito caracterizado por deterioro del desarrollo y anomalías cerebrales estructurales como la microcefalia. SFRP1 es una proteína secreta relacionada con el encrespado (SFRP); estos receptores solubles pueden unir competitivamente los ligandos Wnt para antagonizar e inhibir la señalización Wnt. La vía de señalización Wnt participa en la regulación de la respuesta IFN durante la infección por Flavivirus36. Se espera que el escote de SFRP1 mejore la replicación de flavivirus. SFRP1 también participa en la diferenciación de células Th1737. Las alineaciones de secuencia del SSHHPS mostraron diferencias específicas de especies en las secuencias de sitios de escisión(Figura 10D). La secuencia del sitio de escisión en SFRP1 era idéntica en humanos y pollos; ZIKV puede inducir mortalidad y microcefalia en embriones de pollo38. En los roedores, el residuo P1 altamente conservado (K/R)R-G se sustituye por una glicina (RGG). Las cepas inmunocompetentes de ratones son generalmente resistentes a la infección por ZIKV y a la enfermedad39.
Los parámetros cinéticos en estado estacionario y las constantes de inhibición se pueden medir para las secuencias de poliproteínas virales y para las secuencias de proteínas anfitrionas utilizando el ensayo continuo en un lector de placas31,40,41 (Figura 11A). Para obtener información cualitativa sobre el escote, como el escote de una secuencia determinada o la inhibición de la proteasa por diversos compuestos, se puede utilizar el ensayo discontinuo(Figura 11B).
Puede ser necesaria la optimización del número de residuos entre CFP y YFP. Se puede hacer un modelo ligado al sustrato utilizando los métodos in silico. En la Figura 9se muestra un modelo acoplado representativo del cruce nsP1/nsP2. Para la proteasa VEEV nsP2, se había notificado el escote de una secuencia del virus del bosque de Semliki (SFV) de 12 aminoácidos (Km a 0,58 mM)33. Alargar la secuencia del sustrato a 19, 22 y 25 residuos y reducir la resistencia iónica del tampón condujo a una reducción significativa de Km. El examen de la estructura cristalina y el embalaje de cristal ESEV nsP2 también mostró que una parte de una de las uniones estaba empaquetada contra el dominio de la proteasa y era helicoidal. Por lo tanto, los sustratos VEEV más largos pueden unirse mejor debido al reconocimiento de un motivo estructural secundario.
Para TRIM14, obtuvimos un Km a 21 M6,33. La Km para el sustrato que transporta la secuencia de proteína sornte fue comparable a los valores DeK m de los sustratos que contienen las secuencias de sitio de escisión de poliproteína viral (Km(V12) a 12 m y Km(V34) a 21 oM). Las secuencias de sitio de escote en las uniones nsP1/nsP2, nsP2/nsP3 y nsP3/nsP4 se cortaron con diferentes eficiencias. En la célula, esto se piensa para permitir el escote secuencial de la poliproteína42.
Se debe tener precaución al interpretar los resultados negativos. Si no se produce escote, el sitio de escote puede ser demasiado corto o la proteasa purificada puede estar inactiva. Para los sustratos que se cortan, se necesitan experimentos adicionales para confirmar la escisión de la proteína de longitud completa o el escote en las células infectadas por virus. Deben elegirse los experimentos de seguimiento adecuados. También se pueden probar los efectos de la sobreexpresión o silenciamiento de la proteína diana en la replicación viral.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Figura 1: Tres mecanismos de silenciamiento. El silenciamiento puede ocurrir a nivel de ADN, ARN o proteína. Estos algoritmos de "búsqueda y eliminación" utilizan cada uno una "palabra clave" para dirigir el escote de un archivo que contiene la palabra. Esta cifra ha sido modificada de Morazzani et al.32 y sus referencias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Figura 2: Diferencias específicas de especies en secuencias de sitios de escote. Los dominios PRY/SPRY del terminal C de los homólogos TRIM14 se muestran en la alineación. El dominio PRY/SPRY se puede identificar por los motivos conservados resaltados en gris. Human TRIM14 se corta en QEAGA-G por la proteasa de cisteína VEEV nsP2. La secuencia SSHHP se muestra en color. El residuo en verde es el residuo P1'; en azul es el residuo P4, y en rojo son otros residuos conservados dentro de la secuencia de motivos del sitio de escote. Equine harbor una versión truncada de TRIM14 que carece del dominio PRY/SPRY. La lisina resaltada en cian es poli-ubiquitinada y es importante para el montaje del signalosoma MAVS. El dominio C-terminal PRY/SPRY puede ser cortado transitoriamente por la proteasa nsP2 para afectar la respuesta antiviral del huésped intracelularmente durante una infección viral aguda. En equino, este dominio siempre está ausente. Esto sugiere que el dominio PRY/SPRY de TRIM14 puede tener una función protectora contra las infecciones por EVE. Esta figura ha sido reproducida de Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Figura 3: Identificación SSHHPS mediante BLAST. La secuencia de motivos del sitio de escote en la unión VEEV nsP1/nsP2 se alinea con la secuencia SSHHP en la proteína huésped TRIM14. El residuo coloreado en verde es el residuo P1'; en azul es el residuo P4 y en rojo son otros residuos conservados de la secuencia de motivos del sitio de escote. La mayoría de las alineaciones contenían homología con regiones fuera del motivo del sitio de escisión conservado o no incluían los residuos de la unión escisil del P1/P1'. TRIM14 mostró una coincidencia con 6 residuos en orden secuencial que incluía N1 y P1'. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Figura 4: Secuencias de proteínas y ADN del sustrato CFP-V12-YFP para la proteasa de cisteína vev nsP2. Los sitios de restricción NdeI (CATATG) y XhoI (CTCGAG) se muestran en mayúsculas. En rojo es la secuencia del sitio de escote de la poliproteína viral que está entre nsP1 y nsP2. El residuo en verde es el residuo P1' y en azul es el residuo P4 del sitio de escote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Figura 5: Secuencia de proteínas de la construcción de proteasa de cisteína Trx-VEEV-nsP2. La tioredoxina (Trx) se muestra en amarillo. El sitio de escote de trombina y su etiqueta se muestran en cian. Los Cys-Su dyad están etiquetados en rojo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Figura 6: Estructuras de péptidos en MOE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Figura 7: Acoplamiento del péptido de sustrato utilizando PyRx/AutoDock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Figura 8: Trabajos que se ejecutan en el clúster de Biowulf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Figura 9: Modelo del sustrato VEEV P12 que contiene la secuencia del sitio de escisión en la unión nsP1/nsP2. El diadido catalítico Cys-477/His-546 se muestra en azul. Figura se hizo usando Pymol (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Figura 10: Análisis SSHHPS del virus del Zika ns2B/ns3 proteasa. (A) Objetivos de proteína huésped previstas de la proteasa ZIKV ns2B/ns3. Los residuos en rojo coinciden con una sola secuencia de sitio de escote. Los residuos en verde se toleran en el subsitio y coinciden con los residuos en otros sitios de escote. SFRP1 tenía el mayor número de residuos idénticos en orden consecutivo. (B) las proteínas CFP-sustrato-YFP (50-60 kDa) se expresaron y purificaron con teniendo la secuencia SSHHP pronosticada de cada proteína huésped (humana). La proteasa ZIKV corta la subunidadalfade corte de proteasa DE ZIKV a isla aislada de una biblioteca de ADNc. Los productos de escote son de aproximadamente 28-30 kDa. Las secuencias de sustrato están disponibles en Morazzani et al.6 (C) Mientras que el corte proteasa ns2B/ns3 SFRP1, no cortó sus homólogos (SFRP2 y SFRP4). (D) La alineación de los sitios de escisión de diferentes especies animales puede ser útil para seleccionar un modelo animal para un virus del Grupo IV. Tenga en cuenta que la secuencia R-G conservada difiere entre humanos y roedores en SFRP1. 6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Figura 11: Análisis cinético en estado estacionario utilizando los ensayos continuos y discontinuos. (A) Los datos cinéticos mostrados en la Tabla 5 se trazaron en GraFit. El recuadro muestra la gráfica Lineweaver-Burk. (B) Gel SDS-PAGE que muestra los productos de escisión del sustrato CFP-V12-YFP. En el carril 1 se encuentra el sustrato "UNCUT" (48 kDa). En el carril 2 se encuentra el sustrato "CUT" (31 kDa y 27 kDa). En los carriles 3-9 diferentes compuestos fueron incluidos para probar su actividad inhibitoria. El carril 4 contiene el inhibidor covalente E64d. Estas reacciones se ejecutaron durante la noche durante 17 h a temperatura ambiente. La ebullición de las muestras era necesaria para lograr el patrón de bandas afiladas. La proteasa nsP2 es visible (56 kDa) en las reacciones que contienen enzima, pero no en el carril 1. El carril 1 es el control "sin enzimas". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Presentamos un protocolo general para identificar tramos cortos de secuencias de proteínas homolopégicos de patógenos de host (SSHHPS) incrustadas en la poliproteína viral. SSHHPS son reconocidos por proteasas virales y dirigen la destrucción dirigida de proteínas huésped específicas por varios virus del Grupo IV.

Análisis de SSHHPS Viral del Grupo IV utilizando métodos In Vitro y In Silico

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Hemos demostrado que los genomas virales del grupo IV codifican tramos cortos de secuencias de proteínas huésped. Estas secuencias se pueden encontrar dentro de los sitios de escisión de proteasa viral. Se están utilizando para la destrucción dirigida de proteínas huésped, típicamente proteínas implicadas en la generación de las respuestas inmunitarias.Una de las principales ventajas de utilizar ensayos de proteasa es que elimina la complejidad de una célula y muestra si una proteasa viral puede cortar o no una secuencia en particular. Así que cuando analizamos las secuencias SSHHPS de Zika, descubrimos que la proteasa podía cortar secuencias en proteínas involucradas en la generación de respuestas inmunitarias y que algunas de estas proteínas también tenían funciones en el desarrollo del cerebro y los ojos. Al realizar esta técnica por primera vez, hay que recordar que si no se observa escisión, que puede deberse a una variedad de factores como la actividad de la proteasa.Demostrando el procedimiento estará Jaimee Compton, un técnico de mi laboratorio. Comience abriendo Protein BLAST y coloque los 20 aminoácidos que rodean el enlace de la scisile y la poliproteína viral y seleccione secuencias de proteínas no redundantes y escriba en el genoma del huésped que se buscará. Si es necesario, seleccione PHI-BLAST y escriba una secuencia de patrones donde los corchetes indiquen que cualquiera de los aminoácidos dentro de los corchetes puede estar en la posición de suplente y, a continuación, pulse BLAST.Ordene el orden de los hits BLAST en función del número de residuos idénticos o tolerados consecutivos que coincidan con una secuencia de sitio de escote. En la lista, seleccione las proteínas que contengan seis o más residuos idénticos o similares para su análisis en los ensayos de proteasa. Construir un plásmido que codifica la proteína fluorescente cian, hasta 25 aminoácidos de la secuencia de escote, y la proteína fluorescente amarilla.A continuación, prepare los sustratos CFP y YFP inoculando cuatro matraces de cuatro litros con 25 mililitros de un cultivo nocturno. Agitar los cultivos a 37 grados centígrados y monitorear el crecimiento cada hora por espectroscopia UV-Vis a 600 nanómetros. Cuando las bacterias alcancen una absorbancia de aproximadamente uno, induzca la expresión de proteínas añadiendo 0,5 mililitros de un IPTG molar a cada matraz, luego reduzca la temperatura de la incubadora de temblores a 17 grados centígrados y permita que la expresión continúe durante la noche durante 17 a 20 horas.Al día siguiente, peletiza las bacterias por centrifugación a 7000 veces g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Retire y deseche el medio líquido y luego almacene los pellets a menos 80 grados Centígrados o proceda con la lelisis celular. Para la persecia de las células, prepare 100 mililitros de tampón de lelisis de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, resuspendir los pellets en el tampón y transferir de 25 a 25 mililitros de la suspensión a tubos cónicos desechables de 50 mililitros.Coloque los tubos en un vaso de precipitados de plástico con agua helada y luego inserte la punta del sonicador en el tubo de modo que la punta esté a un centímetro de la parte inferior del tubo y sonice el lisato de 10 a 20 veces hasta que se vuelva fluido y licuado. Después de la sonicación, transfiera el izado a los tubos centrífugos de alta velocidad y centrifugarlo a 20, 500 x g durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a una botella limpia y deseche los pellets.Cargue el izado en la columna de níquel y luego lave la columna con dos volúmenes de columna del búfer A seguidos de cinco volúmenes de columna de 20%buffer B.La absorción a 280 nanómetros aumentará durante el lavado a medida que los contaminantes se eluen de la columna. Continúe lavando hasta que A280 vuelva a los valores de línea base. A continuación, eluda la proteína con volúmenes de dos a tres columnas de 100%buffer B y recoger fracciones de 10 mililitros, asegurándose de medir el A280 de cada fracción.Preparar ocho mezclas de reacciones de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y pipeta 45 microlitros de cada mezcla en los tres primeros pozos de cada fila de una placa negra de media área de 96 pozos. Configure el lector de placas para la detección simultánea de florescencia en dos longitudes de onda con un ajuste de tubo fotomultiplicador fijo. Programe el tiempo de lectura de 20 a 30 minutos con una lectura por minuto y seleccione los pozos que desea leer.Inserte la placa en la máquina e inicie la lectura, monitoreando las relaciones de emisión a lo largo del tiempo. Ejecute una lectura de punto final de la placa que contiene el sustrato sin cortar. Retire la placa y la pipeta cinco microlitros de enzimas en cada pozo.Se puede guardar la primera columna como un control sin cortar. A continuación, vuelva a leer la placa durante 20 a 30 minutos, asegurándose de ajustar el lector de placas a los valores absolutos de salida. Una vez finalizada la lectura, selle la placa con película para evitar la evaporación y déjela durante la noche a temperatura ambiente para permitir que la enzima corte completamente el sustrato.Después de 24 horas, retire la película y realice una lectura final de la placa. Promediar las relaciones de emisión y registrarlas como cortadas. Confirme el escote del sustrato utilizando SDS-PAGE.Cargue un marcador de peso molecular en el primer o último carril y cargue cinco microlitros de cada mezcla de reacción en un carril del gel, comenzando con la reacción sin cortar. Conecte los electrodos del depósito de gel a la fuente de alimentación y ejecute los productos a 110 voltios durante 60 minutos. Retire el gel del cassette con una herramienta de agrietamiento y sumerjalo en cinco a 10 mililitros de solución de tinción.Después de una a 24 horas, retire el exceso de manchas y sumerja el gel en agua. A continuación, tome una foto del gel con un gel imager. Para preparar la estructura proteica, cargue el archivo PDB de proteína en MOE.Haga clic en Seleccionar y disolvente y, a continuación, elimine el disolvente. Abra el panel Estructura pPreparación en la barra de menús superior Calcular y corrija automáticamente todos los elementos estructurales haciendo clic en Corregir. Protonar la estructura haciendo clic Protonar 3D.Agregue cargas parciales a la proteína abriendo el panel Cargas parciales y seleccionando AMBER 99 y Ajustar hidrógenos y pares solitarios según sea necesario. A continuación, guarde el archivo de estructura. Para construir la estructura de los péptidos de sustrato y TRIM14, abra el panel Creador de proteínas, introduzca la secuencia de sustrato y seleccione Reempaque automático.A continuación, establezca Geometría como Extendida y haga clic en Generar. Finalmente minimice la estructura y guárdela como un archivo PDB. Acote los péptidos de sustrato a VEEV-nsP2 utilizando el software PyRx AudoDock 4.2.Cargue la proteína, haga clic con el botón derecho en el nombre y seleccione Crear macromolécula para preparar el archivo de acoplamiento PDBQT. A continuación, cargue la molécula de sustrato y seleccione Hacer ligando para preparar el archivo de acoplamiento de ligando. Inicie el asistente AutoDock en el panel de acoplamiento de la parte inferior y seleccione los archivos de ligando y proteínas preparados.Defina el bolsillo de unión a proteínas ajustando manualmente la dimensión de la cuadrícula y, a continuación, ejecute AuotGrid. A continuación, ejecute AutoDock y seleccione el método de algoritmo genético lamarckian. Haga clic en Parámetros de acoplamiento y establezca el número de ejecuciones de GA en 50 y, a continuación, haga clic en Reenviar para iniciar la ejecución de acoplamiento.Cuando AutoDock esté completo, abra el panel Analizar resultados e inspeccione todas las posturas de encuadernación previstas. Seleccione el mejor modelo con la energía de unión pronosticada más baja e interacciones de unión razonables entre el cis-477 y el sustrato en el sitio de escisión y, a continuación, guárdelo como un archivo PDB para más simulaciones MD. Después de leer las posturas de encuadernación con AutoDock, es importante realizar análisis posteriores al acoplamiento para identificar el modelo de encuadernación plausible para el refinamiento con simulaciones MD.Este protocolo se utilizó para encontrar tramos cortos de secuencias de proteínas homógenas del huésped o SSHHPS en la proteasa del virus del Zika ns2B/3. Se identificaron cuatro dianas de proteína huésped. FOXGS, SFRP1, una subunidad Gsalpha de una biblioteca de ADNc de retina, y la mitocondrial NT5M 5'3'nucleotidasa.Las alineaciones de secuencia del SSHHPS permitieron diferencias específicas de especies en las secuencias de sitio de escisión. La secuencia SFRP1 fue idéntica en humanos y pollos, lo que es digno de mención porque el virus del Zika puede inducir mortalidad y microcefalia en embriones de pollo. El ensayo continuo se utilizó para medir los parámetros cinéticos en estado estacionario y las constantes de inhibición de las secuencias de poliproteínas virales y el ensayo discontinuo se utilizó para obtener información de escisión cualitativa, como el escote de una secuencia particular o la inhibición de la proteasa por varios compuestos.Se hizo un modelo de la unión de la encefalitis equina venezolana nsP1-nsP2 utilizando métodos silico. Para la proteasa nsP2, alargar la secuencia de sustrato y reducir la resistencia iónica del tampón condujo a una reducción significativa en la constante Michaelis de escisión de una secuencia de virus del bosque de Semliki. Al intentar este procedimiento, es importante ejecutar los controles.Los sustratos que contienen las secuencias de sitio de escisión de proteasa viral deben probarse antes de proceder con el análisis de secuencia SSHHPS. Si se observa escisión de una proteína huésped, se deben llevar a cabo experimentos de seguimiento para confirmar que esa proteína huésped afecta la replicación viral. Esto se puede hacer sobreexpresando o silenciando la proteína, y luego examinando los efectos sobre la replicación viral.El grupo IV contiene un gran número de patógenos nuevos y emergentes. Las secuencias SSHHPS vinculan proteínas y vías específicas del huésped con las proteasas virales de una manera muy predecible.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Investigación

Inmunología e Infección

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em&gt; Burkholderia</em&gt; Especies

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Métodos in vitro para comparar la unión de diana y la inducción de CDC entre anticuerpos terapéuticos: Aplicaciones en análisis de biosimilitud

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Métodos alternativos In Vitro para la determinación de la integridad estructural de la cápside Viral

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detección de copia baja número DNA Viral integradora formada por In Vitro la infección Hepatitis B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...