Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Defense Threat minskning Agency (DTRA) projektnummer CB-SEED-SEED09-2-0061 och CBCall4-CBM-05-2-0019, och delvis av intramural/Extramural forskningsprogram av NCATS, NIH (XH) och marin forskning laboratorie bas fonder.

Åsikterna uttryckte här är de av författarna och föreställer inte de av US-marinen, US-armé, US-departement av försvar, eller US-regeringen.

Sekvens-specifik förstörelse av ett protein eller en nukleinsyra styrs av en utländsk sekvens ses endast i ett fåtal fall i biologi. Mekanismerna som visas i figur 1 är defensiva mekanismer som skyddar en värd från ett virus, eller ett virus från en värd.
Med hjälp av bioinformatiska metoder kan vi identifiera de mål som förstörs av dessa system. I våra analyser av SSHHP sekvenser upptäckte vi att många av dem kunde hittas i proteiner som behövs för att generera medfödda immunsvar. Vissa hade uppenbara roller som Mavs och TRIF (TIR-domän-innehållande adapter-inducerande interferon-β), medan andra var relaterade till immunitet men mer komplexa mekanismer (t. ex., histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Målinformationen som lagras i SSHHP-sekvensen har potential att identifiera vägar som har antivirala effekter mot dessa virus. Antivirala svar in vivo är ofta virusspecifika26,43. Till exempel, delmängder av trim proteiner har antiviral effekter på olika virus43,44,45, vissa är virus begränsning faktorer (t. ex., hiv och TRIM5α). Specificiteten hos trim proteiner (~ 70 har identifierats) fortfarande undersöks44,45. Informationen inom SSHHPS kan bidra till vår förståelse av hur dessa virus kringgå det medfödda immunsvaret. Andra mönster och korrelationer kan avslöjas som mer SSHHPS undersöks.
Artspecifika skillnader var uppenbara i våra analyser (figur 2, figur 10). Dessa virus är kända för att påverka vissa arter mer än andra. Information om värd omfång, värdmottaglighet och värd försvar kan förekomma inom SSHHPS. Till exempel, Equine, de mest mottagliga arter till Equine encefalit virus, saknade den region av Human TRIM14 som var transitivt skuren av VEEV nsP2 proteas. Människor dör sällan från VEEV infektioner men kan infekteras24. Human TRIM14 proteinet bar en nsP2 proteas klyvning sekvens6. Närvaron av klyvning webbplats tyder på att människor har en försvarsmekanism mot dessa virus. Fåglar har tros vara potentiella reservoarer av dessa virus46. Motsvarande SSHHP sekvens i TRIM14 protein från kycklingar skilde sig från de sekvenser som finns i människor och andra arter. Subtila skillnader som dessa kan göra ett mål värd protein uncleavable eller mer lätt klyvs. Aguirre et al.16 visade att en uncleavable MUTERAT String protein inducerade högre nivåer av IFN efter denguefeber infektion och att möss naturligtvis bära en version av STING som inte skärs av Dengue ns2B3 proteas. Det murina STING proteinet klipptes inte av ZIKV-proteasen47. I vår SSHHPS-analys observerade vi också skillnader i ZIKV proteashämmare-klyvningssekvenserna när vi jämförde människans proteiner med de hos gnagare6 (figur 10D). Reproduktion av artspecifika proteolytiska klyvning av värd proteiner kan vara viktigt i djurmodeller som används för grupp IV virus. Hämning av Host protein klyvning har också konsekvenser när det gäller utvecklingen av grupp IV proteashämmare. I vår tidigare publikation visade vi att vi kunde hämma TRIM14 klyvning av VEEV nsP2 proteas med CA074 metylester6. Detta resultat tyder på att små molekyler hämmare av dessa proteaser kan kunna modulera den medfödda immunsvar som kan undertrycka infektionen6,31.
Genetisk variation inom en art har också potential att producera skillnader i proteolytisk klyvning. Subtila skillnader i kodon användning kan påverka ribosom pausa48. Eftersom vissa grupp IV virala proteaser är inbäddade i ER-membranet, kan skillnader i dessa pauser påverka klyvning av ett mål om klyvning sker samtranslationellt. Några av de klyvning webbplatser som vi identifierade var i förväntad signal peptid sekvenser (t. ex., SFRP1) medan andra var interna.
SSHHPS analys kan producera information som skiljer sig från andra metoder för värd protein analyser. SSHHPS analys var billig och lätt att anställa. Användningen av ett bakteriellt uttrycks system tillät testning av korta segment (~ 25 aminosyror) av däggdjurs sekvenser utan användning av däggdjurscell kulturer. Vi konstaterade att den gemensamma fiskeripolitiken-YFP-substrat kunde tolerera alla testade humana proteinsekvenser; avkastningen varierade dock. I liknande analyser, substrat som innehåller mänskliga proteinsekvenser så länge som 63 aminosyror var framgångsrikt uttryckt, renas, och utnyttjas för kinetiska analyser och inhibitor screening49,50,51. Eftersom endast små mängder av substratet behövs för den diskontinuerliga analysen, kan ett stort antal mål utforskas. En fördel med systemet är att den gemensamma fiskeripolitiken/YFP-substrat kan användas för SDS-PAGE analyser och för mer avancerade kinetiska analyser (dvs. IC50, ki, km, VMax). För läkemedels upptäckt, inhibitoriska föreningar kan producera artefakter i fluorescerande analyser. Sålunda, den diskontinuerliga analysen i kombination med en kontinuerlig analys tillåter en att bekräfta klyvning eller hämning av klyvning. Proverna för den diskontinuerliga SDS-PAGE-analysen kan tas direkt ur plattorna 96-well. CFP/YFP-substrat har använts för sammansatt biblioteks screening52. Emellertid, ytterligare analyser krävs för att avgöra om ett substrat är lämplig för hög genomströmning screening såsom beräkning av en Z-faktor53.
En utmaning i utformningen av ett substrat är att identifiera regionen runt scissile Bond som är bunden och erkänd av proteasen. I exemplen som visas här, började vi med 12 rester sekvenser som var centrerad kring scissile Bond. Efter att ha analyserat sekvens anpassningar av klyvning platser homologi till rester N-terminalen av scissile Bond hittades för Veev proteashämmare, medan för zikv proteashämmare homologi till flera av C-terminalen rester hittades. En in silico modell av det dockade underlaget kan användas för att utforma platsriktade mutagenes experiment som sond bindningsställen av underlaget. Eftersom substrat och enzymsekvenser är på plasmider, antingen kan muteras för att testa i silico modeller eller under plats toleranser. Detta kan vara fördelaktigt om en kristallstruktur av det bundna underlaget (s) inte är tillgänglig.
SSHHPS analys kan också ge ny information om de mekanismer genom vilka virusinducerade fenotyper produceras av virala enzymer. En av de zikv mål, SFRP1, är en del av WNT signalvägen och har roller i både hjärna och ögon utveckling och i immunsvar36,37,54,55,56,57. Vi fann att de andra proteinsekvenser som skulle kunna skäras av ZIKV ns2B/NS3 proteashämmare var också i proteiner inblandade i hjärnans och ögats utveckling; avvikelser i båda har observerats i medfött zika syndrom och tros vara en del av den virusinducerade fenotyp58.
Förutsägbarheten för interaktioner mellan värd och patogener kan utnyttjas för en mängd olika tillämpningar: målspecifika onkolytiska virus terapier. de-riskera levande virusvacciner; förfining, förutsägelse eller urval av djurmodeller; förutsägelse av värd-spänna eller mottaglighet; Prediktion av zoonotiska händelser. och Prediktion av Host-försvar. Eftersom metoderna som beskrivs är sekvensbaserade, kan de vara av värde att införliva i programvara i framtiden.

Bevis på horisontell genöverföring från virus till värd, eller värd för virus, kan hittas i en mängd av genomen hos1,2,3,4. Exempel på viral endogenisering är CRISPR-distanserna som finns i bakteriernas värd-genomen hos4. Nyligen har vi funnit bevis på värd proteinsekvenser inbäddade i icke-strukturella polyproteiner av (+) ssRNA grupp IV virus. Dessa sekvenser inom kodnings regionerna i viral genomet kan spridas generationellt. Den korta sträckor av homolog värd-patogen proteinsekvenser (sshhps) finns i viruset och värd5,6. SSHHPS är den bevarade klyvning webbplats motiv sekvenser erkänns av virala proteaser som har homologi till specifika värd proteiner. Dessa sekvenser direkt förstörelsen av specifika värd proteiner.
I vår tidigare publikation6, vi sammanställt en lista över alla de värden proteiner som var riktade av virala proteaser och fann att listan över mål var icke-slumpmässigt (tabell 1). Två trender var uppenbara. Först, majoriteten av de virala proteaser som skär värd proteiner tillhörde grupp IV virus (24 av 25 fall inblandade grupp IV virala proteaser), och en proteas tillhörde (+) ssRNA grupp VI retrovirus (HIV, humant immunbristvirus)7. För det andra var värd protein mål som skärs av virala proteaser i allmänhet inblandade i att generera den medfödda immunsvar tyder på att klyvning var avsedda att motverka värdens immunsvar. Hälften av de värden proteiner riktade av virala proteaser var kända komponenter av signalering kaskader som genererar interferon (IFN) och proinflammatoriska cytokiner (tabell 1). Andra var inblandade i värdcelltranskription8,9,10 eller Translation11. Intressant, SHmakov et al.4 har visat att många CRISPR protospacer sekvenser motsvarar gener inblandade i plasmid konjugering eller replikering4.
Grupp IV omfattar bland annat Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae och togaviridae. Flera nya och framväxande patogener tillhör grupp IV såsom zika virus (ZIKV), West Nile (WNV), chikungunya (CHIKV), svår akut respiratorisk syndrom virus (SARS) och Mellanöstern respiratoriskt syndrom virus (MERS). Den (+) ssRNA arvsmassan är i huvudsak en bit av mRNA. För att producera de enzymer som krävs för genomreplikering måste (+) ssRNA-genomet först översättas. I alphaviruses och andra grupp IV virus, de enzymer som krävs för replikering produceras i en enda polyprotein (dvs., nsP1234 för VEEV). Den icke-strukturella polyprotein (nsP) är proteolytically bearbetas (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) av nsP2 proteas att producera aktiva enzymer12 (figur 1). Klyvning av polyprotein av nsP2 proteas är viktigt för viral replikering; Detta har visats genom radering och platsriktade mutagenes av den aktiva webbplatsen cystein av nsP2 proteas13,14. I synnerhet, översättningen av virala proteiner föregår genomreplikering händelser. Till exempel innehåller nsP4 RNA-beroende RNA-polymeras som behövs för att replikera (+) ssRNA-genomet. Genomreplikering kan producera dsRNA-intermediärer. dessa intermediärer kan utlösa värdens medfödda immunsvar. Sålunda, dessa virus kan klyva värd medfödda immunsvar proteiner tidigt i infektionen för att undertrycka deras effekter15,16,17.
Ljuddämpning kan förekomma på DNA-, RNA-och proteinnivå. Vad som är gemensamt för var och en av de ljuddämpnings metoder som visas i figur 1 är att korta främmande DNA-, RNA-eller proteinsekvenser används för att vägleda förstörelsen av specifika mål för att motverka deras funktion. Ljuddämpnings mekanismerna är analoga med "Sök och ta bort"-program som har skrivits på tre olika språk. Den korta klyvning webbplats sekvens är jämförbar med ett "nyckelord". Varje program har ett enzym som erkänner matchen mellan den korta sekvensen ("sökordet") och ett ord i "filen" som ska raderas. När en match hittas, minskar enzymet ("raderar") den större målsekvensen. De tre mekanismerna som visas i figur 1 används för att försvara värden från virus, eller för att försvara ett virus från värdens immunförsvar.
Virala proteaser erkänna korta klyvning webbplats motiv sekvenser mellan ~ 2-11 aminosyror; i nucleotides, skulle detta motsvara till 6-33 baser. För jämförelse är CRISPR spacer sekvenser ~ 26-72 nukleotider och RNAi är ~ 20-22 nukleotider18,19. Även om dessa sekvenser är relativt korta, kan de kännas igen specifikt. Med tanke på den högre mångfalden av aminosyror, sannolikheten för en slumpmässig klyvning händelse är relativt låg för en viral proteas erkänner proteinsekvenser av 6-8 aminosyror eller längre. Prediktion av SSHHPS i värd proteiner kommer till stor del bero på specificiteten hos viral proteas undersöks. Om proteasen har strikta sekvens specificitet krav chansen att hitta en klyvning webbplats sekvens är 1/206 = 1 i 64 000 000 eller 1/208 = 1 i 25 600 000 000; de flesta proteaser har dock variabla toleranser för underwebbplatsen (t. ex. kan R eller K tolereras på S1-platsen). Därför finns det inget krav för sekvens identitet mellan sekvenser som finns i värden kontra viruset. För virala proteaser som har lösare sekvenskrav (t. ex. de som tillhör Picornaviridae) kan sannolikheten för att hitta en klyvning plats i ett värd protein vara högre. Många av posterna i tabell 1 är från familjen Picornaviridae .
Schechter & Berger notation20 används ofta för att beskriva resterna i ett proteassubstrat och de underwebbplatser som de binder, vi använder denna notation hela. Resterna i substratet som är N-terminalen på scissile Bond betecknas som P3-P2-P1 medan de som är C-Terminal betecknas som P1'-P2'-P3 ". Motsvarande underwebbplatser i proteasen som binder dessa aminosyrerester är S3-S2-S1 och S1'-S2'-S3 respektive.
För att avgöra vilka värden proteiner som riktas, kan vi identifiera SSHHPS i viral polyprotein klyvning platser och söka efter de värden proteiner som innehåller dem. Häri beskriver vi procedurer för att identifiera SSHHPS med hjälp av kända viral proteas klyvning webbplats sekvenser. De bioinformatiska metoderna, proteasanalyserna och de beskrivna silico-metoderna är avsedda att användas tillsammans med cellbaserade analyser.
Sekvensanpassningar av värden proteiner riktade av virala proteaser har avslöjat artspecifika skillnader inom dessa korta klyvning webbplatssekvens. Till exempel konstaterades att det venezuelanska Equine encefalit-viruset (VEEV) nsP2 proteashämmare var att skära humant TRIM14, ett treparts motiv (TRIM) protein6. Vissa TRIMPROTEINER är virala begränsnings faktorer (t. ex. TRIM5α21), de flesta tros vara ubiquitin E3 Ligaser. TRIM14 saknar en RING (riktigt intressant ny gen) domän och är inte tänkt att vara en E3 Ligase22. TRIM14 har föreslagits vara en adapter i mitokondrie antiviral signalosome (MAVS)22, men kan ha andra antivirala funktioner23. Anpassning av TRIM14 sekvenser från olika arter visar att Equine saknar klyvning plats och hamn en stympad version av TRIM14 som saknar C-terminalen PRY/SPRY domän. Denna domän innehåller en polvubiquitinering webbplats (figur 2). I Equine, dessa virus är mycket dödliga (~ 20-80% dödlighet) medan hos människor endast ~ 1% dör från VEEV infektioner24. Klyvning av PRY/SPRY-domänen kan transitivt kortslutning MAVS signalering kaskad. Denna kaskad kan utlösas av dsRNA och leder till produktion av interferon och pro-inflammatoriska cytokiner. Således kan närvaron av SSHHPS vara användbart för att förutsäga vilka arter har försvarssystem mot specifika grupp IV virus.
I grupp IV-virus tros IFN-antagonism-mekanismer multiplicera överflödig25. Host protein klyvning kan vara övergående under infektion och koncentrationer kan återhämta sig med tiden. Vi hittade i celler som TRIM14 klyvning produkter kan upptäckas mycket tidigt efter transfektion (6 h) med en Plasmid kodning proteasen (cytomegalovirus promotor). Vid längre perioder upptäcktes dock inte klyvning produkter. I virusinfekterade celler var kinetikerna olika och klyvning produkter kunde upptäckas mellan 6-48 h6. Andra har rapporterat uppkomsten av Host protein klyvning produkter så tidigt som 3-6 h post infektion9,11.
Proteolytisk aktivitet i celler är ofta svårt att fånga; klyvning produkter kan variera i deras löslighet, koncentration, stabilitet, och livslängd. I cellbaserade analyser kan man inte utgå från att klyvbara produkter ackumuleras i en cell eller att bandintensiteten i snitt och oklippt protein kommer att Visa kompenserande ökningar och minskningar eftersom det skurna proteinet kan brytas ned mycket snabbt och inte kan upptäckas i en västerländsk blot vid en förväntad molekylvikt (MW) (t. ex. den region som innehåller epitopen kan klyvas av andra värd proteaser eller kan vara ubiquitinated). Om substrat för viral proteas är ett medfödda immunsvar protein, dess koncentration kan variera under infektion. Till exempel, vissa medfödda immunsvar proteiner är närvarande före virusinfektion och induceras ytterligare av interferon26. Koncentrationen av målproteinet kan därför fluktuera under infektion och jämförelse av icke-infekterade vs. infekterade celllysat kan vara svåra att tolka. Dessutom, alla celler kan inte vara enhetligt transfekterade eller infekterade. In vitro-proteasanalyser med renade proteiner från E. coli å andra sidan har färre variabler för vilka man kan kontrollera och sådana analyser går att göra med SDS-Page snarare än Immunoblots. Kontaminerande proteaser kan hämmas i de tidiga stegen av Proteinrening av den gemensamma fiskeripolitiken/YFP-substrat, och muterade virala proteaser kan renas och testas som kontroller för att avgöra om klyvning beror på viral proteas eller en förorenande bakteriell proteas.
En begränsning av in vitro-proteasanalyser är att de saknar komplexiteten hos en däggdjurscell. För ett enzym att skära dess substrat, de två måste vara co-lokaliserade. Grupp IV viral proteaser skiljer sig åt i struktur och lokalisering. Till exempel är ZIKV proteashämmare inbäddad i endoplasmatiska Retikulum (ER) membranet och ansikten Cytosol, medan VEEV nsP2 proteashämmare är ett lösligt protein i cytoplasman och Nucleus27. Några av de klyvning webbplats sekvenser hittades i ZIKV SSHHPS analys var i signal peptider tyder på att klyvning kan förekomma samtranslationellt för vissa mål. Därför måste även placeringen av proteasen och underlaget i cellen övervägas i dessa analyser.
Cellbaserade analyser kan vara värdefulla för att fastställa en roll för de identifierade värd proteinet (-erna) vid infektion. Metoder som syftar till att stoppa viral proteas klyvning av värd proteiner såsom tillsats av en proteashämmare6 eller en mutation i värd mål16 kan användas för att undersöka deras effekter på viral replikering. Överuttryck av det riktade proteinet kan också påverka viral replikering28. Plack analyser eller andra metoder kan användas för att kvantifiera viral replikering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

Alphaviral enzymer syntetiseras i en enda polypeptid. Den icke-strukturella polyprotein (nsP) bearbetas av dess nsP2 cystein proteashämmare att producera aktiva enzymer som är viktiga för viral replikering. Viral proteaser är mycket specifika och erkänna bevaras klyvning webbplats motiv sekvenser (~ 6-8 aminosyror). I flera grupp IV-virus, kan nsP protease (s) klyvning webbplats motiv sekvenser hittas i specifika värd proteiner som är involverade i att generera det medfödda immunsvaret och, i vissa fall, de riktade proteinerna verkar vara kopplade till den virusinducerade fenotypen. Dessa virus utnyttjar korta sträckor av homolog värd-patogen proteinsekvenser (SSHHPS) för riktad förstörelse av värd proteiner. För att identifiera SSHHPS kan virus proteas klyvning av platssekvenserna matas in i BLAST och värd genomet (s) kan sökas. Klyvning initialt kan testas med hjälp av renad NSP viral proteas och fluorescens resonans energiöverföring (FRET) substrat gjorda i E. coli. BANDET substrat innehåller cyan och gult fluorescerande protein och klyvning webbplatssekvens (CFP-sekvens-YFP). Denna proteasanalys kan användas kontinuerligt i en Plattläsare eller inte kontinuerligt på SDS-PAGE Gels. Modeller av de bundna peptid substrat kan genereras i silico för att vägleda substrat urval och mutagenes studier. CFP/YFP-substrat har också utnyttjats för att identifiera proteashämmare. Dessa in vitro-och silico-metoder kan användas i kombination med cellbaserade analyser för att avgöra om det riktade värd proteinet påverkar virusreplikation.

SSHHPS analys av ZIKV ns2B/3 proteas identifierade 4 värd protein mål: FOXG1, SFRP1, en Gs alfa-subenhet från en retinal cDNA bibliotek, och NT5M mitokondrie 5 ', 3 '-nukleotidase (figur 10)6. Särskilt, ingen annan metod förutspådde dessa proteiner som potentiella mål för ZIKV proteas. Mutationer i FOXG1-genen har kopplats till ett medfött syndrom som kännetecknas av försämrad utveckling och strukturella störningar i hjärnan såsom mikrocefali. SFRP1 är ett utsöndras Frizzled-relaterat protein (SFRP); dessa lösliga receptorer kan konkurrenskraftigt binda WNT ligander att motverka och hämma WNT signalering. Den WNT signalering vägen är involverad i regleringen av IFN svar under flavivirus infektion36. Klyvning av SFRP1 skulle förväntas förbättra och replikering. SFRP1 är också involverad i Th17-celldifferentiering37. Sekvensanpassningar av SSHHPS visade artspecifika skillnader i klyvning webbplatssekvens (figur 10D). Klyvning webbplats sekvens i SFRP1 var identisk hos människor och kycklingar; ZIKV kan framkalla dödlighet och mikrocefali i kyckling embryon38. I gnagare ersätts den mycket bevarade P1-återstoden (K/R) R ↓ G med en glycin (RGG). Immunkompetenta stammar av möss är i allmänhet resistenta mot ZIKV infektion och sjukdom39.
Steady state kinetiska parametrar och hämning konstanter kan mätas för viral polyproteinsekvenser och för värden proteinsekvenser med hjälp av kontinuerlig analys i en tallrik läsare31,40,41 (figur 11a). För kvalitativ klyvning, till exempel klyvning av en viss sekvens eller hämning av proteas av olika föreningar, kan den diskontinuerliga analysen användas (figur 11B).
Det kan krävas optimering av antalet restsubstanser mellan den gemensamma fiskeripolitiken och YFP. En substrat bunden modell kan göras med hjälp av in silico metoder. En representativ dockad modell av korsningen nsP1/nsP2 visas i figur 9. För VEEV nsP2 proteas hade klyvning av en 12-Amino Acid Semliki Forest virus (SFV) sekvens rapporterats (Km = 0,58 mM)33. Att förlänga substrat ordningen till 19, 22 och 25 rester och minska den joniska styrkan hos bufferten ledde till en signifikant minskning av Km. Undersökning av VEEV nsP2 kristallstruktur och kristall packning visade också att en del av en av korsningar var packad mot proteashämmare domänen och var spiralformade. Därför kan de längre VEEV-substrat binda bättre på grund av erkännandet av ett sekundärt konstruktions motiv.
För TRIM14 erhöll vi ett Km = 21 μm6,33. Km för underlaget som bär värd proteinsekvensen var jämförbar med km -värdena för de substrat som innehåller de virala polyproteinklyvningssekvenserna (km(V12) = 12 μm och km(V34) = 21 μm). Den klyvning webbplats sekvenser på nsP1/nsP2, nsP2/nsP3, och nsP3/nsP4 korsningar klipptes med olika effektivitetsvinster. I cellen, detta är tänkt att möjliggöra sekventiell klyvning av polyprotein42.
Försiktighet bör iakttas vid tolkning av negativa resultat. Om ingen klyvning inträffar kan klyvnings platsen vara för kort eller så kan den renade proteasen vara inaktiv. För substrat som skärs, behövs ytterligare experiment för att bekräfta klyvning av full längd protein eller klyvning i virusinfekterade celler. Lämpliga uppföljningsexperiment bör väljas. Effekterna av överuttryck eller Tystning av målproteinet på virusreplikation kan också testas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Figur 1: tre dämpnings metoder. Ljuddämpning kan förekomma på DNA-, RNA-eller proteinnivå. Dessa "Sök och ta bort" algoritmer varje använder ett "nyckelord" för att styra klyvning av en fil som innehåller ordet. Denna siffra har modifierats från Morazzani et al.32 och referenserna däri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Figur 2: artspecifika skillnader i webbplatsekvenser för klyvning. C-terminalen PRY/Spry domäner TRIM14 homologer visas i justeringen. Den PRY/SPRY domän kan identifieras genom bevarade motiv markerade i grått. Human TRIM14 skärs vid QEAGA ↓ G av VEEV nsP2 cystein proteas. SSHHP-sekvensen visas i färg. Restmaterialet i grönt är P1-rester. i blått är P4-rester, och i rött finns andra bevarade rester inom klyvning webbplats motiv sekvens. Equine Harbor en stympad version av TRIM14 saknar PRY/SPRY domän. Den lysin markeras i cyan är Poly-ubiquitinated och är viktigt för montering av MAVS signalosome. C-terminalen PRY/SPRY domän kan vara transitivt skära av nsP2 proteashämmare att försämra värdens antivirala svar intracellulärt under en akut virusinfektion. I Equine är denna domän alltid frånvarande. Detta tyder på att PRY/SPRY domän TRIM14 kan ha en skyddande funktion mot VEEV infektioner. Denna siffra har reproducerats från Morazanni et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Figur 3: SSHHPS identifiering med blast. Den klyvning webbplats motiv sekvens vid VEEV nsP1/nsP2 korsningen är i linje med SSHHP sekvensen i Host protein TRIM14. Återstoden färgade i grönt är P1 restsubstanser; i blått är P4 rester och i rött är andra bevarade rester av klyvning webbplats motiv sekvens. De flesta anpassningar innehöll homologi till regioner utanför det bevarade klyvningsområdet eller omfattade inte P1/P1 ' scissile Bond-rester. TRIM14 visade en matchning till 6 rester i sekventiell ordning som inkluderade P1 och P1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Figur 4: protein och DNA-sekvenser av den gemensamma fiskeripolitiken-V12-YFP substrat för VEEV nsP2 cystein proteas. Restriktionssajterna NdeI (CATATG) och XhoI (CTCGAG) visas med versaler. I rött är klyvning webbplatssekvens från viral polyprotein som är i mellan nsP1 och nsP2. Återstoden i grönt är P1 restprodukt och i blått är P4 rester av klyvning platsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Figur 5: proteinsekvens av TRX-VEEV-nsP2 cystein proteas konstruera. Tioredoxin (TRX) visas i gult. Den trombin klyvning webbplats och hans-tagg visas i cyan. CYS-hans dyad är märkta i rött. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Figur 6: peptid strukturer i Moe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Figur 7: dockning av substrat peptid med PyRx/autodock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Figur 8: jobb som körs på Biowulf-klustret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Figur 9: modell av VEEV P12-substrat som innehåller klyvningsplatssekvens vid nsP1/nsP2-korsningen. CYS-477/his-546 katalytisk dyad visas i blått. Figur gjordes med pymol (https://pymol.org). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Figur 10: SSHHPS-analys av zikaviruset ns2B/Ns3-proteas. (A) förväntade värd protein mål för Zikv ns2B/NS3-proteasen. Rester i rött matchar en enda klyvning webbplatssekvens. Rester i grönt tolereras på under platsen och matchar rester vid andra klyvning platser. SFRP1 hade det högsta antalet identiska rester i ordningsföljd. (B) CFP-substrat-yfp-proteiner (~ 50-60 kDa) uttrycktes och renades innehållande den förutspådda sshhp-sekvensen från varje värd protein (human). Den zikv proteashämmare klippa Human FOXG1, SFRP1, NT5M och en Gsalfa subenhet isolerade från en retinal cDNA bibliotek. Klyvning produkterna är cirka 28-30 kDa. Underlaget sekvenser finns i morazzani et al.6 (C) medan ns2B/NS3 proteas skära SFRP1, det inte klippa sina homologer (SFRP2 och SFRP4). Danpassning av klyvningssajter från olika djurarter kan vara användbar vid val av en djurmodell för ett grupp IV-virus. Observera att den bevarade R ↓ G-sekvensen skiljer sig mellan människor och gnagare i SFRP1. Figur återges från Morazzani et al.6<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Figur 11: steady state kinetisk analys med kontinuerliga och diskontinuerliga analyser. Ade kinetiska data som visas i tabell 5 har ritades i GraFit. Den infälld visar Lineweaver-burk tomt. B) gel av SDS-Page som visar klyvningsprodukterna i den gemensamma fiskeripolitiken-V12-yfp-substrat. I Lane 1 är "UNCUT" substrat (48 kDa). I Lane 2 är "CUT" substrat (31 kDa och 27 kDa). I Lanes 3-9 ingick olika föreningar för att testa deras hämmande aktivitet. Lane 4 innehåller E64d kovalent hämmare. Dessa reaktioner kördes över natten för ~ 17 h vid rumstemperatur. Kokande av proverna krävdes för att uppnå skarpa ränder mönster. Den nsP2 proteasen är synlig (56 kDa) i de reaktioner som innehåller enzymet, men inte i Lane 1. Lane 1 är "No enzym"-kontrollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Vi presenterar ett allmänt protokoll för att identifiera korta sträckor av homolog värd-patogen proteinsekvenser (SSHHPS) inbäddade i viral polyprotein. SSHHPS erkänns av virala proteaser och rikta den riktade förstörelsen av specifika värd proteiner av flera grupp IV virus.

Analys av grupp IV viral SSHHPS med in vitro-och silico-metoder

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Vi har visat att grupp IV virusgenom kodar korta sträckor av värdproteinsekvenser. Dessa sekvenser kan hittas inom de virala proteas klyvningsställena. De används för riktad förstörelse av värdproteiner, vanligtvis proteiner som är inblandade i att generera immunsvar.En stor fördel med att använda proteasanalyser är att den tar bort en cells komplexitet och visar om ett viralt proteas kan klyva en viss sekvens eller inte. Så när vi analyserade Zika SSHHPS sekvenser, fann vi att proteas kunde skära sekvenser i proteiner som deltar i att generera immunsvar och att vissa av dessa proteiner också hade roller i hjärnan och ögat utveckling. När man utför denna teknik för första gången bör man komma ihåg att om klyvning inte observeras, att det kan bero på en mängd olika faktorer såsom aktiviteten hos proteasen.Demonstrerar proceduren blir Jaimee Compton, en tekniker från mitt laboratorium. Börja med att öppna Protein BLAST och sätta de 20 aminosyror som omger scissile bond och den viral polyprotein och välj icke-redundanta protein sekvenser sedan skriva in värdgenomet som skall sökas. Om det behövs, välj PHI-BLAST och skriv in i en mönstersekvens där fattningsfästen indikerar att antingen aminosyran inom fästena kan vara vid ersättningspositionen, slå sedan BLAST.Rank order blast träffarna baserat på antalet på varandra följande identiska eller tolererade rester som matchar en klyvning webbplatssekvens. Välj från listan de proteiner som innehåller sex eller fler identiska eller liknande rester för analys i proteasanalyserna. Konstruera en plasmid kodning cyan fluorescerande protein, upp till 25 aminosyror av klyvning sekvens, och den gula fluorescerande protein.Därefter förbereder du CFP och YFP-substraten genom att inokupa fyra fyra literskolvar med 25 milliliter av en övernattningskultur. Skaka kulturerna i 37 grader Celsius och övervaka tillväxten varje timme genom UV-Vis-spektroskopi vid 600 nanometer. När bakterierna når en absorbans på ungefär ett, inducera proteinuttryck genom att lägga till 0,5 milliliter av en molar IPTG till varje kolv, sedan sänka temperaturen på skakningar inkubatorn till 17 grader Celsius och låta uttrycket fortsätta över natten i 17 till 20 timmar.Nästa dag pelletar bakterierna genom centrifugation vid 7000 gånger g i 10 minuter vid 4 grader Celsius. Ta bort och kassera flytande media sedan lagra pellets på minus 80 grader Celsius eller fortsätt med cell lys. För att tona cellerna, preparera 100 milliliter lysbuffert enligt manuskriptriktningar, återanvända pelletsen i bufferten och överför 25 till 25 milliliter av suspensionen till 50 milliliter disponibla koniska rör.Placera rören i en plastbägare med isvatten sedan sätta in sonicator spetsen i röret så att spetsen är ungefär en centimeter från botten av röret och sonikera lysate 10 till 20 gånger tills det blir vätska och liquified. Efter ultraljudsbehandling, överföra lysate till hög hastighet centrifugrör och centrifug det på 20, 500 x g i 30 minuter vid 4 grader Celsius. Överför supernatanten till en ren flaska och kasta pelletsen.Ladda lysate på nickel kolumnen sedan tvätta kolumnen med två kolumn volymer av buffert A följt av fem kolumn volymer av 20%buffert B.Absorbance vid 280 nanometer kommer att öka under tvätten som föroreningar elute från kolumnen. Fortsätt tvätta tills A280 återgår till baslinjevärden. Sedan elute proteinet med två till tre kolumn volymer av 100%buffert B och samla 10 milliliter fraktioner, se till att mäta A280 av varje fraktion.Förbered åtta reaktioner blandar enligt manuskriptriktningar och pipetter 45 mikroliter av varje mix i de tre första brunnarna i varje rad av en svart halvarea 96-brunnsplatta. Ställ in plattan läsaren för samtidig detektering av florescence vid två våglängder med en fast photomultiplier röret inställning. Programmera lästiden till 20 till 30 minuter med en avläst per minut och välj de brunnar som ska läsas.Sätt in plattan i maskinen och starta avläsningen, övervaka emissionskvoterna över tid. Kör en ändpunktsläsning av plattan som innehåller det oklippta substratet. Ta bort plattan och pipetten fem mikroliter av enzym i varje brunn.Man kan spara den första kolumnen som en oklippt kontroll. Sedan läsa plattan igen i 20 till 30 minuter, se till att ställa in plattan läsaren till utgång absoluta värden. När avläsningen är klar, försegla plattan med film för att förhindra avdunstning och lämna den över natten vid rumstemperatur så att enzymet helt skära underlaget.Efter 24 timmar, ta bort filmen och utföra en endpoint läsa av plattan. Medelvärdet av utsläppskvoterna och registrera dem som skuren. Bekräfta underlagets klyvning med hjälp av SDS-PAGE.Ladda en molekylviktsmarkör in i första eller sista körfältet och ladda fem mikroliter av varje reaktionsblandning i ett körfält av gelen, med början i den oklippta reaktionen. Fäst elektroderna i geltanken på strömförsörjningen och kör produkterna på 110 volt i 60 minuter. Ta ut gelen från kassetten med hjälp av ett sprickverktyg och dränk den i fem till tio milliliter färgningslösning.Efter en till 24 timmar, ta bort överflödig fläck och dränka gelén i vatten. Ta sedan en bild av gelen med hjälp av en gel-imager. För att förbereda proteinstrukturen, ladda protein PDB-filen i MOE.Klicka på Markera och lösningsmedel och ta sedan bort lösningsmedlet. Öppna panelen Structure pPreparation från den översta menyraden För beräkning och korrigera alla strukturella objekt automatiskt genom att klicka på Korrigera. Protonera strukturen genom att klicka på Protonat 3D.Tillsätt partiella laddningar till proteinet genom att öppna panelen Partiella avgifter och välja AMBER 99 och Justera vätgaser och ensamma par som krävs. Spara sedan strukturfilen. För att bygga strukturen för substratpeptiderna och TRIM14 öppnar du panelen Protein Builder, går in i substratsekvensen och väljer Auto Repack.Därefter ställer geometri som utökat och klicka på Bygg. Slutligen minimera strukturen och spara den som en PDB-fil. Docka substratpeptider till VEEV-nsP2 med pyrx AudoDock 4.2-programvara.Ladda proteinet, högerklicka på namnet och välj Make Macromolecule för att förbereda PDBQT-dockningsfilen. Ladda sedan substratmolekylen och välj Make Ligand för att förbereda den liganda dockningsfilen. Starta guiden Autodock på dockningspanelen längst ner och välj de förberedda ligand- och proteinfilerna.Definiera den proteinbindande fickan genom att justera rutnätsdimensionen manuellt, kör sedan AuotGrid. Därefter kör AutoDock och välj lamarckian genetiska algoritm metoden. Klicka på Dockning parametrar och ställa in antalet GA körs till 50 klicka sedan på Vidarebefordra för att starta dockningskörningen.När AutoDock är klar öppnar du panelen Analysera resultat och inspekterar alla förutsagda bindningsställningar. Välj den bästa modellen med den lägsta förutsagda bindningsenergin och rimliga bindningsinteraktioner mellan cis-477 och substrat på klyvningsstället sparar den sedan som en PDB-fil för ytterligare MD-simuleringar. Efter att ha läst bindningen utgör med AutoDock är det viktigt att utföra post-dockningsanalys för att identifiera den rimliga bindningsmodellen för förfining med MD-simuleringar.Detta protokoll användes för att hitta korta sträckor av homologa host-patogen protein sekvenser eller SSHHPS i Zika virus ns2B/3 proteas. Fyra värdproteinmål identifierades. FOXGS, SFRP1, en Gsalpha-underenhet från ett retinal cDNA-bibliotek, och NT5M mitokondriell 5'3'nucleotidase.Sekvensjusteringar av SSHHPS tillät artspecifika skillnader i klyvningsplatssekvenserna. SFRP1-sekvensen var identisk hos människor och kycklingar, vilket är anmärkningsvärt eftersom Zika-viruset kan framkalla dödlighet och mikrocefali hos kycklingembryon. Den kontinuerliga analysen användes för att mäta steady state kinetiska parametrar och hämningskonstanter för de virala polyproteinsekvenserna och den diskontinuerliga analysen användes för att erhålla kvalitativ klyvningsinformation, såsom klyvning av en viss sekvens eller inhibering av proteasen av olika föreningar.En modell av den venezuelanska equine encefalit nsP1-nsP2 korsningen gjordes med hjälp av i silico metoder. För nsP2 proteas, förlängning av substrat sekvens och minska joniska styrkan i bufferten ledde till en betydande minskning av Michaelis konstanten av klyvning av en Semliki Forest virussekvens. När du försöker med den här proceduren är det viktigt att kontrollerna körs.Substrat som innehåller de virala proteasens sekvenser för klyvning ska testas innan man fortsätter med SSHHPS-sekvensanalys. Om klyvning av ett värdprotein observeras, bör uppföljningsexperiment utföras för att bekräfta att det värdproteinet påverkar virusreplikation. Detta kan göras genom att överuttrycka eller tysta proteinet, och sedan undersöka effekterna på virusreplikation.Grupp IV innehåller ett stort antal nya och framväxande patogener. SSHHPS-sekvenserna länkar specifika värdproteiner och -vägar med virusproteaserna på ett mycket förutsägbart sätt.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypisk Inferens av HIV-1 Tropism Använda Befolkning-sekvensering av V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analys för att mäta neutrofilvidhäftning till Aktiverade primära humana mikrovaskulära endotelceller under statiska förhållanden

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction och 2-D-gelelektrofores Metoder för<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arter

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In vitro- metoder för att jämföra målbindning och CDC-induktion mellan terapeutiska antikroppar: applikationer i biosimilaritetsanalys

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternativa In Vitro -metoder för bestämning av Viral kapsid strukturell integritet

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Identifiering av låg exemplar nummer integrerat virus-DNA bildas av In Vitro hepatit B-infektion

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...