Name: analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods
Uploaded: 2019-12-21T12:00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Bu çalışma, Savunma Tehdit Azaltma Ajansı (DTRA) proje numaraları CB-SEED-SEED09-2-0061 ve CBCall4-CBM-05-2-0019 ve kısmen NCATS, NIH (XH) ve Deniz Araştırma Laboratuvarı baz fonlarının Intramural/Extramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir.

Burada ifade edilen görüşler yazarların görüşleridir ve ABD Donanması, ABD Ordusu, ABD Savunma Bakanlığı veya ABD hükümetinin görüşlerini temsil etmemaktadır.

Bir proteinin veya yabancı bir dizinin yönlendirilen nükleik asitin diziye özgü yıkımı biyolojide sadece birkaç vakada görülür. Şekil 1'de gösterilen mekanizmalar, bir ana bilgisayarı virüsten veya bir virüsten koruyan savunma mekanizmalarıdır.
Biyoinformatik yöntemleri kullanarak bu sistemler tarafından yok edilen hedefleri belirleyebiliriz. SSHHP dizileri üzerinde yaptığımız analizlerde, bunların çoğunun doğuştan gelen bağışıklık yanıtları üretmek için gerekli proteinlerde bulunabileceğini keşfettik. Bazı MAVS ve TRIF (TIR-etki alanı içeren adaptör-interferon-β indükleyici) gibi bariz rolleri vardı, diğerleri daha karmaşık mekanizmalar olsa bağışıklık ile ilgili iken (örneğin, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. SSHHP dizisinde depolanan hedef bilgiler, bu virüslere karşı antiviral etkiye sahip yolları belirleme potansiyeline sahiptir. Vivo antiviral yanıtlar genellikle virüse özgü26,43. Örneğin, TRIM proteinlerinin alt kümelerinin farklı virüsler üzerinde antiviral etkileri vardır43,44,45, bazıları viral kısıtlama faktörleridir (örneğin, HIV ve TRIM5α). TRIM proteinlerinin özgüllüğü (~70 tespit edilmiştir) halen44,45incelenmektedir. SSHHPS içindeki bilgiler, bu virüslerin doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarından nasıl kaçtığını anlamamıza katkıda bulunabilir. Daha fazla SSHHPS incelendiğinde diğer desenler ve korelasyonlar ortaya çıkarılabilir.
Analizlerimizde türe özgü farklılıklar belirgindi(Şekil 2, Şekil 10). Bu virüslerin bazı türleri diğerlerinden daha fazla etkilediği bilinmektedir. SSHHPS'de ana bilgisayar aralığı, ana bilgisayar duyarlılığı ve ev sahibi savunması hakkında bilgiler bulunabilir. Örneğin, at ensefalit iliklerine en yatkın türler olan at, VEEV nsP2 proteazı tarafından geçici olarak kesilen insan TRIM14 bölgesinden yoksundu. İnsanlar nadiren VEEV enfeksiyonlarından ölürler ancak24enfeksiyon kapılabilir. İnsan TRIM14 protein bir nsP2 proteaz dekolte dizisi6taşıdı. Dekolte alanının varlığı insanların bu virüslere karşı bir savunma mekanizması olduğunu göstermektedir. Kuşlar bu virüslerin potansiyel rezervuarları olduğu düşünülmektedir46. TRIM14 proteinindeki karşılık gelen SSHHP dizisi tavuklardan insanlarda ve diğer türlerde bulunan dizilerden farklıydı. Bu gibi ince farklılıklar bir hedef konak protein amcaavable veya daha kolay cleaved yapabilir. Aguirre ve ark.16 bir amcaavable mutasyona uğramış STRING protein Dang virüs enfeksiyonu sonra IFN yüksek düzeyde indüklenen ve fareler doğal Olarak Dang ns2B3 proteaz tarafından kesilmez STING bir sürümünü taşımak gösterdi. Murine STING proteini ZIKV proteaz47tarafından kesilmedi. SSHHPS analizimizde, zikv proteaz bölünme alanı dizilerinde insan proteinlerini kemirgen6(Şekil 10 D)ile karşılaştırdığımızda farklılıklar gözlemledik. Grup IV virüsleriçin kullanılan hayvan modellerinde konak proteinlerin türlerine özgü proteolitik dekoltelerinin çoğaltılması önemli olabilir. Konak protein bölünmesiinin inhibisyonu da Grup IV proteaz inhibitörlerinin gelişimi ile ilgili etkileri vardır. Bir önceki yayınımızda, CA074 metil ester6kullanarak VEEV nsP2 proteazı ile TRIM14 dekoltesini inhibe edebileceğimizi gösterdik. Bu sonuç, bu proteazların küçük molekül inhibitörleri enfeksiyonu bastırma yeteneğine sahip doğuştan gelen bağışıklık yanıtları modüle etmek mümkün olabileceğini düşündürmektedir6,31.
Bir tür içindeki genetik varyasyon da proteolitik bölünme farklılıkları üretmek için potansiyele sahiptir. Kodon kullanımındaki ince farklılıklar ribozom duraklamaetkileyebilir 48. Bazı Grup IV viral proteazlar ER membranına gömülü olduğundan, bölünme eş-çeviri selami oluşursa bu duraklamalarda farklılıklar hedefin bölünmesini etkileyebilir. Tespit ettiğimiz dekolte bölgelerinin bazıları tahmin edilen sinyal peptid dizilerinde (örn. SFRP1) iken diğerleri dahiliidi.
SSHHPS analizi, diğer konak protein analiz yöntemlerinden farklı bilgiler üretebilir. SSHHPS analizi ucuz ve kullanımı kolaydı. Bakteriyel ekspresyon sisteminin kullanılması, memeli hücre kültürünü kullanmadan memeli dizilerinin kısa segmentlerinin (~25 amino asitleri) test edilmesine olanak sağladı. CFP-YFP substratlarının test edilen tüm insan protein dizilerine tahammül edebildiğini bulduk; ancak, verimleri çeşitlidir. Benzer tahlillerde, 63 amino asit kadar insan protein dizileri içeren substratlar başarıyla ifade edildi, saflaştırılmış, ve kinetik analizler ve inhibitör tarama için kullanılan49,50,51. Kesintili titrek için sadece küçük miktarlarda substrat gerektiğinden, çok sayıda hedef araştırılabilir. Sistemin bir avantajı CFP /YFP yüzeyleri SDS-PAGE analizleri ve daha ayrıntılı kinetik analizler için kullanılabilir (yani, IC50, Ki, Km, Vmax). İlaç keşfi için, inhibitör bileşikler floresan tahliller eserler üretebilir. Böylece, sürekli bir test ile birlikte sürekli test bir dekolte veya dekolte inhibisyonu onaylamak için izin verir. Kesintili SDS-PAGE teşrisi örnekleri doğrudan 96 kuyulu plakalardan alınabilir. CFP/YFP yüzeyleri bileşik kütüphane taraması için kullanılmıştır52. Ancak, bir alt tabakazın Z-faktör53'ünhesaplanması gibi yüksek iş elde taraması için uygun olup olmadığını belirlemek için ek analizler gereklidir.
Bir substrat tasarımında bir sorun bağlı ve proteaz tarafından tanınan makas bağ etrafında bölge tespit etmektir. Burada gösterilen örneklerde, makas bağı etrafında ortalanmış 12 kalıntı dizisi ile başladık. Veev proteazı için dekolte bölgelerinin homolojisi kalıntılarına homolojinin dizi hizalamaları analiz edildikten sonra, ZIKV proteaz homolojisinde ise C-terminal kalıntılarının bir çoğuna rastlandı. Kenetlenmiş substrat bir silico modeli substrat bağlayıcı siteleri araştırmak site yönettiği mutagenez deneyleri tasarlamak için kullanılabilir. Substrat ve enzim dizileri plazmidler üzerinde olduğundan, silico modellerinde veya alt sektör toleranslarında test etmek için mutasyona uğrayabilir. Bağlı substrat(lar)ın kristal yapısı mevcut değilse bu avantajlı olabilir.
SSHHPS analizi, virüse bağlı fenotiplerin viral enzimler tarafından üretilme mekanizmaları hakkında da yeni bilgiler verebilir. ZikV hedeflerinden biri, SFRP1, Wnt sinyal yolunun bir parçasıdır ve beyin ve göz gelişiminde ve bağışıklık yanıtlarında rolleri vardır36,37,54,55,56,57. ZIKV ns2B/ns3 proteazı ile kesilebilen diğer protein dizilerinin beyin ve göz gelişiminde yer alan proteinlerde de bulunduğunu bulduk; her ikisinde de konjenital Zika sendromunda anormallikler gözlenmiştir ve virüse bağlı fenotip58'inbir parçası olduğu düşünülmektedir.
Konak-patojen etkileşimlerinin öngörülebilirliği çeşitli uygulamalar için kullanılabilir: hedefe özgü onkolitik viral tedaviler; canlı virüs aşılarının risksiz; hayvan modellerinin iyileştirilmesi, tahmin edilmesi veya seçilmesi; konak aralığı veya duyarlılık tahmini; zoonotik olayların tahmini; ve ev sahibi savunma tahmini. Açıklanan yöntemler sıra tabanlı olduğundan, gelecekte yazılıma dahil edilmeleri açısından değerli olabilir.

Virüsten konakveya virüse ev sahipliği yapmak için yatay gen transferi kanıtı, çeşitli genomlarda bulunabilir1,2,3,4. Viral endojenizasyona örnek olarak bakteriyel konak genomlarında bulunan CRISPR spacer dizileri4. Son zamanlarda,(+)ssRNA Grup IV virüslerinin yapısal olmayan poliproteinlerine gömülü konak protein dizilerinin kanıtlarını bulduk. Viral genomun kodlama bölgelerindeki bu diziler nesilsel olarak yayılabilir. Homolog konak-patojen protein dizilerinin (SSHHPS) kısa uzantıları virüste bulunur ve5,6. SSHHPS, spesifik konak proteinlere homolojisi olan viral proteazlar tarafından tanınan korunmuş dekolte yeri motif dizileridir. Bu diziler belirli konak proteinlerinin yok oluşuna yönlendirir.
Bir önceki yayınımızda6,viral proteazlar tarafından hedeflenen tüm konak proteinlerin bir listesini derledik ve hedef listesinin rastgele olmadığını tespit ettik(Tablo 1). İki eğilim belirgindi. İlk olarak, konak proteinleri kesen viral proteazların çoğu Grup IV virüslere (24'ü Grup IV viral proteazlar dahil 25 vakadan 24'ü) ve bir proteaz (+)ssRNA Group VI retroviruses (HIV, insan immün yetmezlik virüsü)7'yeaitti. İkinci olarak, viral proteazlar tarafından kesilen konak protein hedefleri genellikle dekoltelerin konakçının bağışıklık yanıtlarını antagonize etmek için tasarlandığını düşündüren doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarının oluşmasında rol almıştır. Viral proteazların hedef açtığı konak proteinlerin yarısı interferon (IFN) ve proinflamatuar sitokinler üreten sinyal basamaklarının bilinen bileşenleridir(Tablo 1). Diğerleri ev sahibi hücre transkripsiyon8,9,10 veya çeviri11dahil edildi. İlginçtir, Shmakov ve ark.4 birçok CRISPR protospacer dizileri plazmid konjugasyon veya çoğaltma4dahil genlere karşılık olduğunu göstermiştir.
Grup IV, diğerleri arasında, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae ve Togaviridaeiçerir. Zika virüsü (ZIKV), Batı Nil (WNV), Chikungunya (CHIKV), şiddetli akut solunum sendromu virüsü (SARS) ve Orta Doğu solunum sendromu virüsü (MERS) gibi birçok yeni ve yeni ortaya çıkan patojen Grup IV'e aittir. (+)ssRNA genomu aslında bir mRNA parçasıdır. Genom replikasyonu için gerekli enzimleri üretmek için önce (+)ssRNA genomu tercüme edilmelidir. Alfavirüsler ve diğer Grup IV virüslerde, replikasyon için gerekli enzimler tek bir poliproteinde (yani VEEV için nsP1234) üretilir. Yapısal olmayan poliprotein (nsP) proteolyically işlenir (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) nsP2 proteaz tarafından aktif enzimler üretmek için12 (Şekil 1). NsP2 proteaz ile poliprotein bölünmesi viral çoğaltma için gereklidir; bu nsP2 proteaz13,14aktif site sistein delemesi ve site yönelimli mutagenez ile gösterilmiştir. Özellikle, viral proteinlerin çevirisi genom replikasyon olaylarından önce gelir. Örneğin, nsP4 (+)ssRNA genomunu çoğaltmak için gereken RNA'ya bağımlı RNA polimeraz içerir. Genom replikasyonu dsRNA ara üretebilir; bu ara lar konakçının doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını tetikleyebilir. Böylece, Bu virüsler etkilerini bastırmak için enfeksiyon erken konak doğuştan gelen bağışıklık yanıtı proteinleri cleave olabilir15,16,17.
Susturma DNA, RNA ve protein düzeyinde oluşabilir. Şekil 1'de gösterilen susturma mekanizmalarının her birinde yaygın olan şey, işlevlerini antagonize etmek için belirli hedeflerin yok edilmesine rehberlik etmek için kısa yabancı DNA, RNA veya protein dizilerinin kullanılmasıdır. Susturma mekanizmaları, üç farklı dilde yazılmış "arama ve silme" programlarına benzerdir. Kısa dekolte site sırası bir "anahtar kelime" benzer. Her program kısa sıra ("anahtar kelime") ve silinecek olan "dosya" bir kelime arasındaki eşleşmeyi tanıyan bir enzim vardır. Bir eşleşme bulunduğunda, enzim daha büyük hedef sırasını keser ("siler"). Şekil 1'de gösterilen üç mekanizma, konakçıyı virüslerden korumak veya bir virüsü bir ev sahibinin bağışıklık sisteminden korumak için kullanılır.
Viral proteazlar ~ 2-11 amino asitler arasında kısa bölünme site motif dizileri tanımak; nükleotitlerde bu 6-33 baza karşılık gelir. Karşılaştırma için, CRISPR spacer dizileri ~ 26-72 nükleotit ve RNAi ~ 20-22 nükleotitler18,19vardır. Bu diziler nispeten kısa olsa da, özellikle tanınabilir. Amino asitlerin yüksek çeşitliliği göz önüne alındığında, rastgele bir bölünme olayı olasılığı nispeten düşük bir viral proteaz 6-8 amino asit veya daha uzun protein dizileri tanıyan için. Konak proteinlerde SSHHPS'nin tahmini büyük ölçüde incelenen viral proteazın özgüllüğüne bağlıdır. Proteaz ın kesin dizi özgüllük gereksinimleri varsa, dekolte site dizisi bulma şansı 1/206 = 1 64 milyonda veya 1/208 = 1'dir 25,6 milyarda; ancak proteazların çoğunda değişken alt alan toleransları vardır (örneğin, R veya K S1 bölgesinde tolere edilebilir). Sonuç olarak, ana bilgisayarda bulunan diziler ile virüs arasında dizi kimliği gereksinimi yoktur. Daha gevşek dizi gereksinimleri olan viral proteazlar için (Picornaviridae'ye ait olanlar gibi) bir konak proteinde dekolte bölgesi bulma olasılığı daha yüksek olabilir. Tablo 1'deki girişlerin çoğu Picornaviridae ailesindendir.
Schechter & Bergergösterimi 20 yaygın bir proteaz substrat ve onlar bağlamak alt siteleri kalıntılar tanımlamak için kullanılır, biz boyunca bu gösterim kullanmak. Makas bağının N-terminali olan substrattaki kalıntılar P3-P2-P1 olarak gösterilirken, C-terminali olanlar P1'-P2'-P3' olarak gösterilir. Bu amino asit kalıntıları bağlamak proteaz karşılık gelen alt siteleri Sırasıyla S3-S2-S1 ve S1'-S2'-S3', vardır.
Hangi ana proteinlerin hedeflendiğini belirlemek için viral poliprotein bölünme bölgelerindeki SSHHPS'yi belirleyebilir ve bunları içeren konak proteinleri arayabiliyoruz. Burada, bilinen viral proteaz dekolte site dizilerini kullanarak SSHHPS'nin tanımlanmasına yönelik prosedürleri ana hatlar. Biyoinformatik yöntemler, proteaz testleri ve tanımlanan silico metodlarında hücre bazlı tahlillerle birlikte kullanılması amaçlanmıştır.
Viral proteazların hedef açtığı konak proteinlerin dizi dizileri bu kısa bölünme alanı dizileri içinde türe özgü farklılıklar ortaya koymuştur. Örneğin, Venezuela at ensefaliti virüsü (VEEV) nsP2 proteaz insan TRIM14, üçlü motif (TRIM) protein6kesmek bulundu. Bazı TRIM proteinleri viral restriksiyon faktörleridir (örneğin, TRIM5α21),çoğu ubiquitin E3 ligazları olduğu düşünülmektedir. TRIM14 bir RING yoksun (gerçekten ilginç yeni gen) etki alanı ve bir E3 ligase olduğu düşünülmemaktadır22. TRIM14 mitokondriyal antiviral sinyalozom bir adaptör olduğu ileri sürülmuştur (MAVS)22, ancak diğer antiviral fonksiyonları olabilir23. Trim14 dizilerinin çeşitli türlerden hizalanması, atların dekolte alanından yoksun olduğunu ve C-terminal PRY/SPRY etki alanını eksik olan TRIM14'ün kesilmiş bir sürümünü barındırdığını göstermektedir. Bu etki alanı bir poliubiquitination sitesi içerir (Şekil 2). At, bu virüsler son derece ölümcül (~ 20-80% mortalite) insanlarda ise sadece ~ 1% VEEV enfeksiyonları24ölür. PRY/SPRY etki alanının bölünmesi, MAVS sinyalajı basamaklama da geçici olarak kısa devre yapabilir. Bu basamak dsRNA tarafından tetiklenebilir ve interferon ve pro-inflamatuar sitokinüretimine yol açar. Bu nedenle, SSHHPS varlığı belirli Grup IV virüslere karşı hangi türlerin savunma sistemleri olduğunu tahmin etmek için yararlı olabilir.
Grup IV virüslerde IFN antagonizm mekanizmalarının25'içarpın. Konak protein bölünmesi enfeksiyon sırasında geçici olabilir ve konsantrasyonlar zamanla düzelebilir. Hücrelerde TRIM14 dekolte ürünlerinin transfeksiyondan sonra çok erken tespit edilebildiğini (6 saat) proteazı (sitomegalovirüs organizatörü) kodlayan bir plazmid ile bulduk. Ancak, daha uzun sürelerde, dekolte ürünleri tespit edilmedi. Virüs enfekte hücrelerde kinetik ler farklıydı ve dekolte ürünleri 6-48 h6arasında tespit edilebilir. Diğerleri erken 3-6 h sonrası enfeksiyon9,11gibi erken konak protein dekolte ürünlerinin görünümünü bildirdin.
Hücrelerde proteolitik aktivite genellikle yakalamak zordur; dekolte ürünleri çözünürlüğü, konsantrasyonu, stabilitesi ve kullanım ömrü açısından değişebilir. Hücre bazlı tahlillerde, dekolte ürünlerinin bir hücrede birikeceği veya kesilen ve kesilmemiş proteinin bant yoğunluklarının kompansatuar artışlar göstereceği ve kesilen proteinin çok hızlı bir şekilde bozulabileceği ve beklenen molekül ağırlığında (MW) batı lekesinde tespit edilemeyeceği varsayılamaz (örneğin, epite içeren bölge diğer konakçı proteasesveya bedide verilebilir). Viral proteaz substrat doğuştan gelen bir bağışıklık yanıtı proteiniseniz, konsantrasyonu enfeksiyon sırasında değişebilir. Örneğin, bazı doğuştan gelen immün yanıt proteinleri viral enfeksiyon öncesinde mevcut ve interferon tarafından daha fazla indüklenen26. Bu nedenle hedef proteinin konsantrasyonu enfeksiyon sırasında dalgalanabilir ve enfekte olmayan hücre lisatlarının karşılaştırılması zor olabilir. Ayrıca, tüm hücreler düzgün transfected veya enfekte olmayabilir. Öte yandan E. coli saflaştırılmış proteinler kullanılarak in vitro proteaz tahlilleri kontrol etmek için daha az değişken var ve bu tür tahliller immünoblots yerine SDS-PAGE kullanılarak yapılabilir. Kontamine proteazlar CFP /YFP substrat protein saflaştırma erken aşamalarında inhibe edilebilir, ve mutasyona uğramış viral proteazlar saflaştırılmış ve dekolte viral proteaz veya kontamine bakteriyel proteaz nedeniyle olup olmadığını belirlemek için kontrol olarak test edilebilir.
In vitro proteaz tahlillerinin bir sınırlaması, bir memeli hücresinin karmaşıklığından yoksun olmalarıdır. Bir enzimin substratını kesmesi için ikisinin birlikte lokalize olması gerekir. Grup IV viral proteazlar yapı ve lokalizasyon açısından farklılık gösterir. Örneğin, ZIKV proteazendilazmik retikulum gömülü ve sitosol yüzleri, VEEV nsP2 proteaz sitoplazma ve çekirdek27çözünür bir protein ise . ZIKV SSHHPS analizinde bulunan bazı dekolte site dizileri sinyal peptidlerinde olup dekoltenin bazı hedefler için birlikte çevrim selamiyet olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle bu analizlerde proteazın ve hücredeki substratların yeri de göz önünde bulundurulmalıdır.
Hücre bazlı tahliller, enfeksiyonda tanımlanan konak protein(ler) için bir rol oluşturmak için değerli olabilir. Konak proteinlerin viral proteaz dekoltesini durdurmayı amaçlayan yöntemler, örneğin proteaz inhibitörü6 veya konak hedef16'da mutasyon gibi viral çoğalma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Hedeflenen proteinin aşırı ekspresyonu da viral replikasyonu etkileyebilir28. Plak tahlilleri veya diğer yöntemler viral replikasyon ölçmek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>125472500</td>
			<td>Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS49954L-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Prime Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA XK 16/20 Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28988937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC901096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0166</td>
			<td>Danger: Allergic reactions (skin or breathing).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0575-02</td>
			<td>Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>RPI</td>
			<td>C61000</td>
			<td>Danger: May cause cancer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Tubing Clips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI68011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PD-10 Desalting Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>D11000-50.0</td>
			<td>Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Acros Organics (Fisher)</td>
			<td>15892-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4034-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>301870010</td>
			<td>Danger: Toxic, Irritant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#946;-D-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>Calbiochem (Millipore Sigma)</td>
			<td>420291</td>
			<td>Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Agar</td>
			<td>Fluka (Millipore Sigma)</td>
			<td>L3027-1KG</td>
			<td>Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani Media</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4919-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Nalgene (Thermo Scientific)</td>
			<td>3119-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M1335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>N73-500</td>
			<td>Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C600003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher)</td>
			<td>C606003</td>
			<td>May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet15b plasmid DNA</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69661</td>
			<td>GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pet32b</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>69016-3</td>
			<td>The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32955</td>
			<td>Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Extraction Reagent</td>
			<td>Novagen (Millipore Sigma)</td>
			<td>70584-4</td>
			<td>BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0510-01</td>
			<td>Anion exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue (12%) 17-well PAGE gels</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>BCG01227</td>
			<td>Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue 20x SDS Running Buffer</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>NXB50500</td>
			<td>Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RunBlue Instant Blue Gel Stain</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Do not dilute, use as directed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator</td>
			<td>Branson Ultrasonics (VWR)</td>
			<td>Model No. 101-063-346R</td>
			<td>Sonicator was used on level 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 6-8 kD MWCO</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>132645T</td>
			<td>Dialysis Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP-Sepharose Fast Flow</td>
			<td>G.E. Healthcare</td>
			<td>17-0729-01</td>
			<td>Cation exchange resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6634-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td>Caution: Eye/Skin Irritant</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of group iv viral sshhps using in vitro and in silico methods

Alfaviral enzimler tek bir polipeptit içinde sentezlenir. Yapısal olmayan poliprotein (nsP) viral replikasyon için gerekli aktif enzimler üretmek için onun nsP2 sistein proteaz tarafından işlenir. Viral proteazlar son derece spesifiktir ve korunmuş dekolte yeri motif dizilerini tanırlar (~6-8 amino asitler). Bazı Grup IV virüslerinde, nsP proteaz(lar) dekolte yeri motif dizileri doğuştan gelen immün yanıtların oluşmasında rol oynayan belirli konak proteinlerde bulunabilir ve bazı durumlarda hedeflenen proteinler virüse bağlı fenotipile bağlantılı görünür. Bu virüsler, konak proteinlerin hedefli imhası için homolog konak-patojen protein dizilerinin (SSHHPS) kısa uzantılarını kullanırlar. SSHHPS'i tanımlamak için viral proteaz dekolte sit motif dizileri BLAST'a girilebilir ve konak genom(lar) aranabilir. Dekolte başlangıçta saflaştırılmış nsP viral proteaz ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) substratları E. coliyapılan kullanılarak test edilebilir. FRET yüzeyleri siyan ve sarı floresan protein ve dekolte alanı dizisi (CFP-sequence-YFP) içerir. Bu proteaz tsay sürekli bir plaka okuyucu veya sds-PAGE jelleri sürekli olarak kullanılabilir. Bağlı peptid substrat modelleri substrat seçimi ve mutagenez çalışmaları rehberlik silico oluşturulabilir. CFP/YFP substratları da proteaz inhibitörlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bu in vitro ve in silico yöntemleri, hedeflenen konak proteininin viral replikasyonu etkileyip etkilemediğini belirlemek için hücre bazlı tahlillerle birlikte kullanılabilir.

ZikV ns2B/3 proteazS analizi 4 konak protein hedefleri tespit: FOXG1, SFRP1, retinal cDNA kütüphanesinden bir Gs alfa alt birimi, ve NT5M mitokondriyal 5',3'-nükleotidaz (Şekil 10)6. Özellikle, başka hiçbir yöntem zikv proteaz potansiyel hedefleri olarak bu proteinlertahmin. FOXG1 genindeki mutasyonlar, mikrosefali gibi gelişme bozukluğu ve yapısal beyin anormallikleri ile karakterize konjenital sendromla bağlantılıdır. SFRP1 salgılanan kıvırcık ilişkili bir proteindir (SFRP); bu çözünür reseptörler, Wnt sinyalini antagonize etmek ve inhibe etmek için Wnt ligandlarını rekabetçi bir şekilde bağlayabilir. Wnt sinyal yolu Flavivirus enfeksiyonu sırasında IFN yanıtının düzenlenmesinde yer almaktadır36. SFRP1 dekoltesi flavivirüs replikasyongeliştirmek için beklenebilir. SFRP1 ayrıca Th17 hücre farklılaşması nda da rol oynar37. SSHHPS dizi hizalamaları dekolte alanı dizilerinde türe özgü farklılıklar göstermiştir(Şekil 10D). SFRP1'deki dekolte yeri dizisi insanlarda ve tavuklarda aynıydı; ZIKV tavuk embriyolarında mortalite ve mikrosefali neden olabilir38. Kemirgenlerde, yüksek oranda korunmuş P1 kalıntısı (K/R)R(R)G bir glisin (RGG) ile ikame edilir. Farelerin immünyonsi genellikle ZIKV enfeksiyonuna ve hastalığa karşı dirençlidir39.
Sabit durum kinetik parametreleri ve inhibisyon sabitleri viral poliprotein dizileri ve bir plaka okuyucu31,40,41 (Şekil 11A)sürekli tsömede kullanılarak konak protein dizileri için ölçülebilir. Belirli bir dizinin bölünmesi veya proteazın çeşitli bileşikler tarafından inhibisyonu gibi nitel bölünme bilgileri için, sürekli olmayan test kullanılabilir(Şekil 11B).
CFP ve YFP arasındaki kalıntı sayısının optimizasyonu gerekebilir. Substrata bağlı bir model in silico yöntemleri kullanılarak yapılabilir. Şekil 9'dansP1/nsP2 bağlantısının temsili bir docked modeli gösterilmiştir. VEEV nsP2 proteazı için, 12-amino asit Semliki Orman Virüsü (SFV) dizisinin dekoltesi bildirilmiştir (Km = 0.58 mM)33. Substrat dizisini 19, 22 ve 25'e kadar uzatmak ve tamponun iyonik mukavemetini azaltmak Km'deönemli bir azalmaya yol açmıştır. VEEV nsP2 kristal yapısı ve kristal ambalajı incelenmesi de kavşaklardan birinin bir kısmının proteaz etki alanına karşı paketlenmiş ve sarmal olduğunu göstermiştir. Böylece, ikincil bir yapısal motifin tanınması nedeniyle DAHA uzun VEEV yüzeyleri daha iyi bağlanabilir.
TRIM14 için Km = 21 μM6,33elde ettik. Konak protein dizisini taşıyan substrat için Km, viral poliprotein bölünme site dizilerini (Km(V12) = 12 μM ve Km(V34) = 21 μM içeren substratların Km değerleri ile karşılaştırılabilirdi. NsP1/nsP2, nsP2/nsP3 ve nsP3/nsP4 kavşaklarında dekolte yeri dizileri farklı verimliliklerle kesildi. Hücrede, bu poliprotein in sıralı dekolte için izin düşünülmektedir42.
Olumsuz sonuçların yorumlanmasında dikkatli olunmalıdır. Bölünme meydana gelmezse, dekolte bölgesi çok kısa olabilir veya saflaştırılmış proteaz etkin olmayabilir. Kesilen substratlar için, virüs bulaşmış hücrelerde tam uzunlukta protein veya dekolte bölünmesi onaylamak için ek deneyler gereklidir. Uygun takip deneyleri seçilmelidir. Hedef proteinin aşırı ekspresyonu veya susturulması nın viral replikasyon üzerindeki etkileri de test edilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig1a.jpg"> Şekil 1: Susturma üç mekanizma. Susturma DNA, RNA veya protein düzeyinde oluşabilir. Bu "arama ve silme" algoritmalarının her biri, sözcüğü içeren bir dosyanın bölünmesini yönlendirmek için bir "anahtar kelime" kullanır. Bu rakam Morazzani ve ark.32 ve buradaki kaynaklardan değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig2a.jpg"> Şekil 2: Bölünme alanı dizilerinde türe özgü farklılıklar. TRIM14 homologlarının C-terminal PRY/SPRY etki alanları hizada gösterilir. PRY/SPRY etki alanı, gri renkle vurgulanan korunmuş motiflerle tanımlanabilir. İnsan TRIM14 QEAGA-G'de VEEV nsP2 sistein proteazı ile kesilir. SSHHP dizisi renkli olarak gösterilir. Yeşilkin kalıntısı P1' kalıntısıdır; mavi P4 kalıntısı, ve kırmızı dekolte site motif dizisi içinde diğer korunmuş kalıntılar vardır. AT, PRY/SPRY etki alanından yoksun TRIM14'ün kesilmiş bir sürümünü barındırıyor. Siyan'da vurgulanan lizin poli-ubiquitinated ve MAVS signalozom montajı için önemlidir. C-terminal PRY/SPRY etki alanı, akut viral enfeksiyon sırasında hücre içi olarak konakçının antiviral yanıtını bozacak şekilde nsP2 proteazı tarafından geçici olarak kesilebilir. At, bu etki alanı her zaman yok. Bu, TRIM14'ün PRY/SPRY etki alanının VEEV enfeksiyonlarına karşı koruyucu bir fonksiyona sahip olabileceğini düşündürmektedir. Bu rakam Morazanni ve ark.6'dan<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig2large.jpg" target="_blank">çoğaltılmıştır.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig3a.jpg"> Şekil 3: BLAST kullanılarak SSHHPS tanımlaması. VEEV nsP1/nsP2 kavşağındaki bölünme yeri motif ilü, ev sahibi protein TRIM14'teki SSHHP dizisi ile uyumludur. Yeşil renkli kalıntı P1' kalıntısıdır; mavi P4 kalıntısı ve kırmızı dekolte site motif dizisinin diğer korunmuş kalıntılar vardır. Çoğu hizalama korunmuş dekolte alanı motifi dışındaki bölgelere homoloji içeriyordu veya P1/P1'in makas bağı kalıntılarını içermiş. TRIM14, P1 ve P1'i içeren sırayla 6 kalıntıya bir eşleşme gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig4a.jpg"> Şekil 4: VEEV nsP2 sistein proteazı için CFP-V12-YFP substratının protein ve DNA dizileri. NdeI (CATATG) ve XhoI (CTCGAG) kısıtlama siteleri büyük harflerle gösterilir. Kırmızı nsP1 ve nsP2 arasında olan viral poliproteinden dekolte site dizisidir. Yeşilkin kalıntısı P1' kalıntısı, mavi renkte ise dekolte bölgesinin P4 kalıntısıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig5a.jpg"> Şekil 5: Trx-VEEV-nsP2 sistein proteaz yapısının protein dizisi. Thioredoxin (Trx) sarı olarak gösterilir. Trombin dekolte sit alanı ve His-tag siyan içinde gösterilir. Cys-His dyad kırmızı etiketli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig6a.jpg"> Şekil 6: MOE'deki peptit yapıları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig7a.jpg"> Şekil 7: PyRx/AutoDock kullanılarak substrat peptidin yanaşma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig8a.jpg"> Şekil 8: Biowulf kümesinde çalışan işler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig9a.jpg"> Şekil 9: NsP1/nsP2 kavşağında dekolte yeri dizisini içeren VEEV P12 substrat modeli. Cys-477/His-546 katalitik dyad mavi gösterilir. Şekil Pymol (https://pymol.org) kullanılarak yapılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig10a.jpg"> Şekil 10: SSHHPS Zika virüsü ns2B/ns3 proteaz analizi. (A) ZIKV ns2B/ns3 proteazının öngörülen konak protein hedefleri. Kırmızı daki kalıntılar tek bir dekolte alanı dizisiyle eşleşir. Yeşil kalıntılar alt bölgede tolere edilir ve diğer dekolte bölgelerindeki kalıntılarla eşleşir. SFRP1 ardışık sırayla en yüksek özdeş kalıntı sayısına sahipti. (B) CFP-substrat-YFP proteinleri (~50-60 kDa) her konak proteinden (insan) öngörülen SSHHP dizisini içeren ifade edildi ve saflaştırılmıştır. ZIKV proteaz insan FOXG1, SFRP1, NT5M ve bir Retina cDNA kütüphaneden izole bir Gsalfa alt birimi kesti. Dekolte ürünleri yaklaşık 28-30 kDa'dır. Substrat dizileri Morazzani et al.6 (C) ns2B/ns3 proteaz SFRP1 keserken, homologlarını kesmedi (SFRP2 ve SFRP4). (D) Farklı hayvan türlerinin dekolte alanlarının hizalanması, Grup IV virüsü için bir hayvan modeli nin seçilmesinde yararlı olabilir. Korunmuş RG dizisinin SFRP1'deki insanlar ve kemirgenler arasında farklılık olduğunu unutmayın. Morazzani ve ark.6'dançoğaltılan<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig10large.jpg" target="_blank">şekil, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60421/60421fig11a.jpg"> Şekil 11: Sürekli ve sürekli tahliller kullanılarak kararlı durum kinetik analizi. (A) Tablo 5'te gösterilen kinetik veriler GraFit'te çizilmiştir. Inset Lineweaver-Burk arsa gösterir. (B) CFP-V12-YFP substratının dekolte ürünlerini gösteren SDS-PAGE jeli. Şerit 1'de "UNCUT" substratı (48 kDa) bulunur. Şerit 2 "CUT" substrat (31 kDa ve 27 kDa) olduğunu. Şeritlerde 3-9 farklı bileşikler onların inhibitör aktivitesini test etmek için dahil edildi. Lane 4, E64d kovalent inhibitörü içerir. Bu reaksiyonlar oda sıcaklığında ~ 17 saat için bir gecede çalıştırıldı. Keskin bantlama desenine ulaşmak için örneklerin kaynatması gerekiyordu. NSP2 proteazenzim içeren reaksiyonlarda görünür (56 kDa), ancak şerit 1 değil. Lane 1 "enzim yok" kontrolüdür. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60421/60421fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods at JoVE.com

Analysis of Group IV Viral SSHHPS Using In Vitro and In Silico Methods

Viral poliproteine gömülü homolog konak-patojen protein dizilerinin (SSHHPS) kısa uzantılarını belirlemek için genel bir protokol sayılmiyoruz. SSHHPS viral proteazlar tarafından tanınan ve çeşitli Grup IV virüsler tarafından belirli konak proteinlerin hedefli imha doğrudan.

Grup IV Viral SSHHPS In Vitro ve In Silico Yöntemleri Kullanılarak Analizi

Alphaviral enzymes are synthesized in a single polypeptide. The nonstructural polyprotein (nsP) is processed by its nsP2 cysteine protease to produce ...

Grup IV viral genomların konak protein dizilerinin kısa uzantılarını kodladığını gösterdik. Bu sekanslar viral proteaz dekolte sitelerinde bulunabilir. Konak proteinlerin hedefli imhası için kullanılıyorlar, tipik olarak bağışıklık tepkilerini üreten proteinler.Proteaz tahlilleri kullanmanın en büyük avantajı, bir hücrenin karmaşıklığını ortadan kaldırmasI ve viral bir proteazın belirli bir diziyi kıdap bırakıp çıkaramayacağını göstermesidir. Zika SSHHPS dizilerini analiz ettiğimizde, proteazın bağışıklık yanıtları üreten proteinlerdeki dizileri kesebileceğini ve bu proteinlerin bazılarının beyin ve göz gelişiminde de rol aldığını gördük. Bu tekniği ilk kez yaparken, bölünme gözlenmezise, proteaz aktivitesi gibi çeşitli faktörlere bağlı olabileceğini unutmamak gerekir.Prosedürü gösteren Jaimee Compton, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. Protein BLAST açarak başlayın ve makas bağı ve viral poliprotein çevreleyen 20 amino asitler koymak ve yedeksiz olmayan protein dizileri seçin sonra aranacak konak genom yazın. Gerekirse PHI-BLAST'ı seçin ve kare köşeli ayraçların parantez içindeki amino asitlerin yedek konumda olabileceğini gösterdiği bir desen sırasını yazın ve blast tuşuna basın.Blast'ın, bir dekolte alanı dizisiyle eşleşen ardışık özdeş veya tolere edilen kalıntı sayısına göre isabet sırasını sıralayın. Listeden, proteaz tahlillerinde analiz için altı veya daha fazla özdeş veya benzer kalıntı içeren proteinleri seçin. Siyan floresan proteinini, dekolte dizisinin 25 amino asitini ve sarı floresan proteinini kodlayan bir plazmid inşa edin.Daha sonra, cfp ve YFP yüzeyleri bir gecede kültür 25 mililitre ile dört litre lik şişe aşılayarak hazırlayın. Kültürleri 37 santigrat derecede sallayın ve 600 nanometrede UV-Vis spektroskopisi ile büyümeyi saatlik olarak izleyin. Bakteri yaklaşık bir emiciulaştığında, her şişeye bir molar IPTG 0.5 mililitre ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin, sonra sallayarak inkübatörün sıcaklığını 17 dereceye düşürün ve ifadenin bir gecede 17 ila 20 saat devam etmesine izin verin.Ertesi gün, 4 santigrat derece 10 dakika için 7000 kez g santrifüj ile bakteri pelet. Sıvı ortamı çıkarın ve atın, ardından peletleri eksi 80 derecede saklayın veya hücre lisi ile devam edin. Hücreleri eşitlemek için, el yazması talimatlara göre 100 mililitre lysis tampon hazırlayın, arabellekteki peletleri yeniden askıya alın ve süspansiyonun 25 ila 25 mililitresini 50 mililitrelik tek kullanımlık konik tüplere aktarın.Tüpleri buzlu suyla plastik bir kabın içine yerleştirin ve sonikucu ucunu tüpün altından yaklaşık bir santimetre olacak şekilde tüpün içine yerleştirin ve sıvı hale gelene kadar 10 ila 20 kez lysate sonicate. Sonication sonra, yüksek hızlı santrifüj tüpler için lysate aktarın ve 4 santigrat derece 30 dakika için 20, 500 x g santrifüj. Supernatant temiz bir şişe ye aktarın ve pelet atın.Nikel sütununa lysate yükleyin sonra tampon A iki sütun hacimleri ile sütun yıkamak 280 nanometre de tampon B.Absorbance beş sütun hacimleri kolon dan kirletici olarak yıkama sırasında artacaktır. A280 temel değerlere dönene kadar yıkamaya devam edin. Daha sonra proteini %100 tampon B'nin iki ila üç sütun hacmiyle eforuzlayın ve her fraksiyonun A280'ini ölçtüğünden emin olarak 10 mililitre fraksiyon toplayın.El yazması yönlere ve pipete göre her karışımın 45 mikrolitresi, siyah yarım alanlı 96 kuyuluk bir plakanın her bir sırasının ilk üç kuyusu içine sekiz reaksiyon karışımı hazırlayın. Sabit fotoçarpan tüp ayarı ile iki dalga boyunda floresans eşzamanlı algılama için plaka okuyucu ayarlayın. Okuma süresini dakikada bir okuma ile 20 ila 30 dakikaya kadar programlayın ve okunacak kuyuları seçin.Plakayı makineye takın ve zaman içinde emisyon oranlarını izleyerek okumaya başlayın. Kesilmemiş alt katmanı içeren plakanın bitiş noktası okumasını çalıştırın. Her kuyuya plaka ve pipet beş mikrolitre enzim çıkarın.Bir kesilmemiş denetim olarak ilk sütun kaydedebilirsiniz. Daha sonra plakayı 20-30 dakika boyunca tekrar okuyun ve plaka okuyucuyu mutlak değerlere göre ayarladık. Okuma tamamlandıktan sonra, buharlaşmayı önlemek için plakayı filmle kapatın ve enzimin substratı tamamen kesmesini sağlamak için oda sıcaklığında bir gece bekletin.24 saat sonra, filmi çıkarın ve plakayı bir bitiş noktası okuma gerçekleştirin. Emisyon oranlarını ortalamave kesilmiş olarak kaydedin. SDS-PAGE kullanarak substrat bölünmesini doğrulayın.Moleküler ağırlık işaretleyicisini ilk veya son şeride yükleyin ve her reaksiyon karışımından beş mikrolitreyi jelin bir şeridine yükleyin, kesilmemiş reaksiyondan başlayarak. Jel tankının elektrotlarını güç kaynağına takın ve ürünleri 110 voltta 60 dakika çalıştırın. Bir çatlama aleti kullanarak jeli kasetten çıkarın ve 5 ila 10 mililitre boyama çözeltisine batırın.1 ila 24 saat sonra, fazla lekeyi çıkarın ve jeli suya batırın. Sonra jel görüntüleyici kullanarak jel bir resim çekmek. Protein yapısını hazırlamak için, protein PDB dosyasını MOE'ye yükleyin.Seç ve Çözücü'yi tıklatın ve ardından çözücüyciyi silin. İşlem üst menü çubuğundan Yapı pPreparation panelini açın ve Düzelt'e tıklayarak tüm yapısal öğeleri otomatik olarak düzeltin. Protonate 3D'ye tıklayarak yapıyı protonate edin.Kısmi Yükler panelini açarak ve AMBER 99'u seçerek proteine kısmi yükler ekleyin ve Hidrojen ve Yalnız Çiftleri Gerektiği gibi ayarlayın. Ardından yapı dosyasını kaydedin. Substrat peptidleri ve TRIM14 için yapı oluşturmak için Protein Oluşturucu panelini açın, alt katman sırasını girin ve Otomatik Yeniden Paket'i seçin.Ardından, Geometri'yi Genişletilmiş olarak ayarlayın ve Oluştur'a tıklayın. Son olarak yapıyı en aza indirin ve pdb dosyası olarak kaydedin. PyRx AudoDock 4.2 yazılımını kullanarak substrat peptidlerini VEEV-nsP2'ye sabitleyin.Proteini yükleyin, adı sağ tıklatın ve PDBQT yerleştirme dosyasını hazırlamak için Makromolekül'ü yapın'ı seçin. Sonra substrat molekülü yükleyin ve ligand yerleştirme dosyasını hazırlamak için Ligand olun'u seçin. AutoDock sihirbazını en alttaki yerleştirme panelinden başlatın ve hazırlanan ligand ve protein dosyalarını seçin.Izgara boyutunu manuel olarak ayarlayarak protein bağlayıcı cebini tanımlayın, ardından AuotGrid'i çalıştırın. Ardından, AutoDock'u çalıştırın ve Lamarckian genetik algoritma yöntemini seçin. Yerleştirme Parametrelerini tıklatın ve GA çalışır sayısını 50'ye ayarlayın ve ardından yerleştirme çalışmasını başlatmak için İleri'yi tıklatın.AutoDock tamamlandığında, Sonuçları Analiz Et panelini açın ve tahmin edilen tüm bağlama pozlarını inceleyin. Cis-477 ve dekolte yerindeki substrat arasındaki en düşük tahmin edilen bağlama enerjisine ve makul bağlama etkileşimlerine sahip en iyi modeli seçin ve ardından daha fazla MD simülasyonu için PDB dosyası olarak kaydedin. AutoDock ile bağlayıcı pozlar okuduktan sonra, MD simülasyonları ile arıtma için makul bağlama modelini belirlemek için yerleştirme sonrası analizi gerçekleştirmek önemlidir.Bu protokol, Zika virüsü ns2B/3 proteazında homolog konak-patojen protein dizilerinin veya SSHHPS'nin kısa uzantılarını bulmak için kullanılmıştır. Dört konak protein hedefi belirlendi. FOXGS, SFRP1, retinal cDNA kütüphanesinden bir Gsalpha alt ünitesi, ve NT5M mitokondriyal 5'3'nükleotidaz.SSHHPS'nin dizi hizalamaları, bölünme alanı dizilerinde türe özgü farklılıklara izin verdi. Zika virüsü tavuk embriyolarında mortalite ve mikrosefali neden olabilir, çünkü SFRP1 dizisi insanlar ve tavuklarda aynıydı. Sürekli test, viral poliprotein dizileri için sabit durum kinetik parametrelerini ve inhibisyon sabitlerini ölçmek için kullanıldı ve belirli bir dizinin bölünmesi veya proteazın çeşitli bileşikler tarafından inhibisyonu gibi nitel bölünme bilgilerini elde etmek için sürekli test edildi.Venezüella at ensefaliti nsP1-nsP2 kavşak modeli silico yöntemleri kullanılarak yapılmıştır. nsP2 proteaz için, substrat dizisini uzatmak ve tamponun iyonik gücünü azaltmak, Semliki Ormanı virüs dizisinin Michaelis sabitinde önemli bir azalmaya yol açtı. Bu yordamı denerken, denetimleri çalıştırmak önemlidir.SSHHPS dizi analizine geçmeden önce viral proteaz bölünme sitsıralarını içeren substratlar test edilmelidir. Bir konak proteinin bölünmesi gözlenirse, konak proteinin viral replikasyonu etkilediğini doğrulamak için takip deneyleri yapılmalıdır. Bu aşırı ifade veya protein susturma ve daha sonra viral çoğaltma üzerindeki etkileri inceleyerek yapılabilir.Grup IV çok sayıda yeni ve yeni ortaya çıkan patojen içerir. SSHHPS dizileri spesifik konak proteinlerini ve yollarını viral proteazlarla çok öngörülebilir bir şekilde birbirine bağlar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Toplam Protein Ekstraksiyon ve 2-D Jel Elektroforez Yöntemleri<em&gt; Burkholderia</em&gt; Türler

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Terapötik Antikorlar Arasındaki Hedef Bağlanma ve CDC İndüksiyonunu Karşılaştırmak İçin İn Vitro Yöntemler: Biyoeşdeğerlik Analizindeki Uygulamalar

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Algılama düşük kopya sayısı Vitro hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...