Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

نشكر جيمس بيس وبروس بورمان علي المشورة وتوفير سلالات c. اليجنز ، دون مورمان ، كوتا ميزوموتو ، ومعهد علوم الحياة مرفق التصوير الاساسيه لتقاسم المعدات والكاشفات ، أوى Hiroyasu ، ليزا فرناندو ، مين جي كيم للحفاظ علي c. اليجنز والقراءة النقدية لمخطوطنا. ويدعم عملنا مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) ، (RGPIN-2019-04442).

1. اعداد حبه البوليسترين لاصقه
ملاحظه: هذا البروتوكول لا يتطلب تقنيه العقيم.
<ol><li>تزن 10 ملغ من الخرز البوليسترين المعدلة الكربوكسيل في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL.</li>
	<li>لغسل الخرز ، أضافه 1 مل من 2-(ن-مورفينو) حمض اثانيسولفونيك (MES) العازلة في الأنبوب. منذ MES العازلة لا تحتوي...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+pharynx:+a+model+for+organogenesis.">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li><li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+intestine.">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Manipulation+of+Embryonic+Cells.">Culture and Manipulation of Embryonic Cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li><li>Stein, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+eggshell.">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li><li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines,+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests.">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li><li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tyrosine+aminotransferase+by+affinity+chromatography.">Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).</li><li>Sugioka, K., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+contact+cues+specify+cell+division+orientation+by+directing+cortical+myosin+flows.">Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows.</a> Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).</li><li>Park, F. D., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

أعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية المبسطة سوف تسمح للباحثين لاختبار ادوار أنماط الاتصال خليه محدده في جوانب مختلفه من التكوين. لقد استخدمنا هذه التقنية لإظهار ان محور تقسيم الخلية يتم التحكم من قبل الاتصال المادي مع الخرز لاصقه10. كما مواصفات محور الشعبة أمر حاسم للتنمية متعد?...

خلال التنمية متعددة الخلايا ، يتم تحديد السلوكيات الخلوية (علي سبيل المثال ، محور القسمة) للخلايا الفردية بواسطة الإشارات الكيميائية والفيزيائية المختلفة. لفهم كيفيه الخلية الفردية يفسر هذه المعلومات ، وكيف انها تنظم التجمع متعدد الخلايا كخاصيه الناشئة هي واحده من الأهداف النهائية للدراسات التكوين. وقد ساهم الكائن النموذجي c. اليجانسيس بشكل كبير في فهم التنظيم علي مستوي الخلوية من تخلق مثل قطبيه الخلية1، الخلية تقسيم زخرفه1، الخلية مصير القرار2، واللوائح علي نطاق الانسجه مثل الأسلاك العصبية3 والعضوي4،5. علي الرغم من وجود العديد من الاداات الجينية المتاحة ، فان أساليب هندسه الانسجه محدوده.
طريقه هندسه الانسجه الأكثر نجاحا في الدراسة c. اليجايليس هو العزلة الكلاسيكية البدائية6; كما ج. وتحيط الاجنه الجنينية بقشره البيض وحاجز نفاذيه7، وأزالها هي واحده من الإجراءات الرئيسية لهذا الأسلوب. في حين ان هذه الطريقة العزلة الاريميه تمكن من أعاده الاتصال خليه خليه بطريقه مبسطه ، فانه لا يسمح للقضاء علي العظة غير المرغوب فيها ؛ الاتصال الخلية لا تزال تشكل كلا الميكانيكية (علي سبيل المثال ، التصاق) والعظة الكيميائية ، مما يحد من قدرتنا علي تحليل كامل للعلاقة السببية بين السلوك جديلة والخلوية.
تستخدم الطريقة المعروضة في هذه الورقة حبات البوليسترين المعدلة الكربوكسيل التي يمكن ان ترتبط بشكل خاص بأي جزيئات الأمين-التفاعلية بما في ذلك البروتينات كما ligands. علي وجه الخصوص ، استخدمنا شكل أمين التفاعلية من رومامين الأحمر-X باعتبارها يجند لجعل الخرز علي حد سواء بصريا تتبعها ولاصق إلى الخلية. وتقترن مجموعات الكربوكسيل من السطح حبه ومجموعات أمين الاوليه من الجزيئات القابلة للذوبان في الماء كربوديوميد 1-ايثيل-3-(ديميثيلامينوبروبيل) كربوديوميد (edac)8،9. الحصول علي حبات لاصقه تسمح للآثار من جديلة الميكانيكية علي ديناميات الخلوية10. لقد استخدمنا هذه التقنية لتحديد الإشارات الميكانيكية المطلوبة لتوجيه انقسام الخلية10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

في النظم متعددة الخلايا ، وتحيط الخلية الفردية من العظة الفيزيائية والكيميائية المختلفة القادمة من الخلايا المجاورة والبيئة. وهذا التعقيد النسيجي يخلط بين تحديد العلاقة السببية بين العظة الخارجة والديناميكيات الخلوية. ويتغلب النظام المتعدد الخلايا المعاد تشكيله بشكل صناعي علي هذه المشكلة من خلال تمكين الباحثين من اختبار جديلة معينه مع القضاء علي الآخرين. هنا ، نقدم طريقه لأعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية مع معزولة Caenorhabditis البدائية والخرز البوليسترين لاصقه. وتشمل الإجراءات أزاله قشر البيض ، وعزل الخلايا البدائية عن طريق تعطيل التصاق خليه الخلية ، واعداد الخرز البوليسترين لاصقه ، وأعاده تشكيل خليه خليه أو خليه حبه الاتصال. وأخيرا ، نقدم تطبيق هذه الطريقة للتحقيق في اتجاه محاور الانقسام الخلوية التي تساهم في تنظيم الزخرفة الخلوية المكانية ومواصفات مصير الخلية في تطوير الاجنه. تمكن هذه الطريقة القوية والقابلة للتكرار ومتعددة الاستعمالات في المختبر من دراسة العلاقات المباشرة بين أنماط الاتصال بالخلايا المكانية والاستجابات الخلوية.

لاعداد الخرز ، ونحن تحديد المبلغ الأمثل من روامين الأحمر-X استر الناجحة لسلاله المحورة وراثيا التعبير عن GFP-ميوسين الثانية و mCherry-histone (الشكل 1ا-د). استخدمنا mcherry الموسومة هيستون كعلامة علي تطور دوره الخلية. لان كلا من رونامين الأحمر-x و mcherry ستكون مضيئه بواسطة ليزر 561 n...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

تعقيدات الانسجه من أنظمه متعددة الخلايا العثور علي تحديد العلاقة السببية بين العظة خارج الخلية والسلوكيات الخلوية الفردية. هنا ، نقدم طريقه لدراسة الصلة المباشرة بين الإشارات التي تعتمد علي الاتصال ومحاور القسمة باستخدام الكريات البدائية الجنينية c. والخرز البوليسترين لاصقه.

في المختبر أعاده تشكيل الخلية المكانية أنماط الاتصال مع المعزولة Caenorhabditis الاجنه البدائية والخرز البوليسترين لاصقه

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

الأنسجة متعددة الخلايا المعقدة، وهذا البروتوكول يعيد تشكيل السلوك الخلوي بطريقة مبسطة. شيء واحد هو هذه التقنية لدراسة العلاقات المباشرة بين البروتونات الموصل الخلوية والاستجابة الخلوية. يستخدم هذا البروتوكول الخرز البوليسترين وظيفية كيميائيا لإعادة تكوين البروتونات موصل الخلوية.الخرز يمكن قطع مع أي بروتونات من الفائدة، لاختبار آثارها على الاستجابة الخلوية. لقد استخدمنا هذه الطريقة في C-الأناقة على أجنة الماوس. لذلك ، يمكن أن يكون هذا البروتوكول منتصبًا في دراسات الكائنات الحية الواسعة.كما الأجنة هشة بعد ارتفاع المعالجة الكلوريت الكامل، مطلوب ممارسة كبيرة قبل واحد يمكن أن تعمل على عزل بنجاح blastomere. سوف العرض التوضيحي البصرية توفير فهم أكبر لكيفية واحد ينبغي التعامل مع الشعيرات الدموية أثناء أساليب عزل blastomere. للبدء, تزن 10 ملليمتر غرام من الخرز البوليسترين تعديل carboxylate في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 مل لتر.إضافة ملليمتر واحد لتر من المخزن المؤقت MES في أنبوب لغسل. دوامة الأنبوب لخلط الخرز. تدور أنبوب لمدة 60 ثانية في 2000XG عن طريق جهاز طرد مركزي مقاعد البدلاء.Dicard المابير عن طريق الأنابيب بعناية خارج المخزن المؤقت. غسل الخرز مرة أخرى مع واحد ملي لتر من المخزن المؤقت MES. بعد الغسيل، أضف ميلي لتر واحد من حاجز MES الذي يحتوي على 10 مللي جرام من EDAC في الأنبوب، لتنشيط مجموعات الكربوكسيل السطحية.دوامة الأنبوب لخلط الخرز. تدوير واحتضان أنبوب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تدور أسفل الخرز لمدة 60 ثانية في 2000XG.تجاهل supernatant عن طريق pippetting بعناية خارج المخزن المؤقت ، وغسل مع واحد ملليمتر لتر من برنامج تلفزيوني. دوامة أنبوب لخلط الخرز وتكرار غسل برنامج تلفزيوني مرة أخرى. إعداد ملليمتر واحد لتر من واحد, 10, 100, واحد ألف مرة سلسلة التخفيف من رودامين الأحمر X من 0.65 مل لتر رودامين الأحمر-X حل الأسهم.Pippette 20 ميكرو ليتر من الخرز في كل أنبوب تخفيف المسلسل. تدوير واحتضان الأنابيب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخرز مرتين مع واحد ملي لتر من برنامج تلفزيوني.بعد الغسيل، أضف ميلي لتر واحد من برنامج تلفزيوني في الأنابيب وتخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أسابيع. تحقق من شدة الفلوريسنس من الخرز تحت المجهر المستخدم للتصوير الحي. عقد كل نهاية من الشعرية الصغيرة بسعة 10 ميكرو ليتر مع اليد اليمنى واليسرى.سحب الشعيرات الدموية الصغيرة نحو كلا الطرفين لتطبيق التوتر وجلب مركز الشعيرات الدموية على الموقد لجعل اثنين من الشعيرات الدموية التي سحبت باليد. تحت المجهر تشريح، تقليم نصائح من الشعيرات الدموية التي سحبت باليد مع ملقط. جعل اثنين من الأحجام فتح طرف مرتين تقريبا، ومرات واحدة على طول الوصول قصيرة من الأجنة C-الأناقة لنقل الجنين وإزالة قشر البيض على التوالي.إرفاق الشعيرات الدموية المسحوبة في جهاز الفم pippetting. Pippette 45 ميكرو ليتر من حل أملاح البيض على بئر من شريحة متعددة جيدا. ضع خمسة إلى 10 الكبار C-الأناقة على البئر.للحصول على الأجنة C-Elegance المبكرة تقطع البالغين إلى قطع عن طريق وضع إبرتين إلى اليمين واليسار من جسم C-Elegance، وانزلاق الإبر الماضية بعضها البعض. Pippette 45 ميكرو لتر من محلول هيبوكلوريت على بئر بجوار محلول ملح البيض الذي يحتوي على البئر والميبست 45 ميكرو ليتر من شلتون متوسط النمو على الآبار الثلاثة اللاحقة. نقل مرحلة خلية واحدة واثنين من أوائل الأجنة مرحلة الخلية في حل هيبوكلوريت عن طريق pippette الفم مع فتحة أكبر حجما والانتظار لمدة 40 إلى 55 ثانية.غسل الأجنة عن طريق نقلها إلى الآبار الثلاثة المقبلة مع شلتون النمو المتوسط. مع 1-2 ثانية في كل من أول بئرين. باستخدام شعري مرسومة باليد مع فتحة أصغر حجم تكرار بعناية pippetting الجنين لإزالة قشر البيض.بعد ذلك، باستمرار pippette مع شعري مرسومة باليد لفصل blastomeres مرحلة من خليتين. بعد إزالة قشر البيض، تقليل قوة في pippetting الأجنة صعودا وهبوطا لمنع انفجار. إعداد غرفة التصوير عن طريق وضع غطاء على حامل غطاء وشريط حواف الغطاء لطعنه.قم بقلب حامل الغطاء، وارسم دائرة على الغطاء مع قلم مزهر. إضافة شيلتون 'sنمو المتوسطة داخل الدائرة التي رسمها علامة مبيدة للماء، ونقل blastomere معزولة إلى غرفة التصوير داخل الدائرة. الآن، الاستغناء عن حجم صغير من الخرز وظيفية كيميائيا على غطاء باستخدام الشعيرات الدموية مرسومة باليد مع فتحة أكبر.السيطرة على موقف من الخرز عن طريق تهب في شعرية مرسومة باليد حتى تعلق الخرز على blastomere معزولة. قم بتركيب الغطاء لتجنب تبخر المتوسط وأداء التصوير الحي باستخدام مجهر مقلوب. في هذه الدراسة, إشارة الفلورسنت من حبة تعامل مع 0.005 ميكرو غرام لكل مللي لتر رودامين الأحمر-X Succinimidyl استر لسلالة المعدلة وراثيا التعبير عن ميوزين-2 و M-cherihistone كانت ضعيفة جدا.من ناحية أخرى، كانت إشارة الفلورسنت من الخرز المعالجة بخمسة ميكرو جرام لكل مللي لتر رودامين الأحمر-X Succinimidyl إستر قوية جدا. وكان تركيز رودامين الأحمر-X Succinimidyl إستر في 0.5 غرام صغير لكل مللي لتر الأمثل لهذه السلالة المعدلة وراثيا خاصة. وخلال التصوير الحي تم تحديد طائرة حيث تم محاذاة اثنين من ال centrosomes عموديا.الطائرة مع زائد أو ناقص زاوية 90 درجة من هذا المستوى هو الطائرة المغزل. زاوية اتجاه المغزل نسبة إلى واجهة الاتصال خلية / حبة بعد السيتوكينات يظهر أن كلا الخلايا ابنة كانت تعلق على حبة في خط يمر كل من مشاهد الاتصال تم استخدامه كتوجه الاتصال. يحتاج المرء إلى معرفة كيفية رد فعل الأجنة وقشر البيض على بعض القوى الخارجية التي يطبقها pippette الفم.نظريا، يمكن دراسة أي استجابة الخلوية، على سبيل المثال، يمكن دراسة مواصفات كبريتات من قبل الخلايا زراعة والاتصال مع الخرز لاصقة على مدى أطول. وقد استخدمت هذه التقنية لفهم الاتصال التابعة لـ آلية توجيه تقسيم الخلايا. تم استخدام مرشح PTF لمنع استنشاق أبخرة محلول هيبوكلوريت عن طريق pippette الفم.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

تطبيق الحواجز غير نفاذ جنبا إلى جنب مع المرشح عامل الخرز غارقة لدراسة إشارات الاستقرائي في الفرخ

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

فؤاد وميكرورهيولوجي في الخلية صفار الجنين الزرد

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

التثبيت من ايليجانس كاينورهابديتيس "تحليل النقل داخل الخلايا" في الخلايا العصبية

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

تقييم "الليزوزومية الغدق" في "الأمعاء ومن يعيش" ايليجانس كاينورهابديتيس

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

ميكانيكا خلية السبر مع ملاقط خالية من حبة الضوئية في الجنين المورفولوجية

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...