Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

Vi takker James Priess og Bruce Bowerman for rådgivning og giver C. elegans stammer, Don Moerman, Kota mizumoto, og Life Sciences Institute Imaging Core facilitet til deling af udstyr og reagenser, AOI Hiroyasu, Lisa Fernando, min Jee Kim til vedligeholdelse af C. elegans og kritisk læsning af vores manuskript. Vores arbejde er støttet af Canadas naturvidenskabelige og tekniske Forskningsråd (NSERC) (RGPIN-2019-04442).

1. fremstilling af klæbende polystyren perle
Bemærk: denne protokol kræver ikke aseptisk teknik.
<ol><li>10 mg carboxylat-modificerede polystyren-perler vejes i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.</li>
	<li>For at vaske perlerne tilsættes 1 mL 2-(N-morpholino) ethanesulfonsyre (MES) buffer ind i røret. Da MES buffer ikke indeholder fosfat og acetat, som kan reducere reaktiviteten af carbodiimide, det er egnet til brug i protein kobling reaktion. Vortex røret for at blande perlerne.</li>
	<...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+pharynx:+a+model+for+organogenesis.">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li><li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+intestine.">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Manipulation+of+Embryonic+Cells.">Culture and Manipulation of Embryonic Cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li><li>Stein, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+eggshell.">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li><li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines,+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests.">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li><li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tyrosine+aminotransferase+by+affinity+chromatography.">Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).</li><li>Sugioka, K., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+contact+cues+specify+cell+division+orientation+by+directing+cortical+myosin+flows.">Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows.</a> Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).</li><li>Park, F. D., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

Rekonstitution af forenklede celle kontakt mønstre vil lade forskerne teste rollerne for specifikke celle kontakt mønstre i forskellige aspekter af morphogenesis. Vi har brugt denne teknik til at vise, at celle divisions aksen styres af den fysiske kontakt med klæbe perler10. Som division Axis specifikation er afgørende for flercellede udvikling ved at bidrage til morfogenesis14, stamcelle division15,16, og væv...

Under multi cellulær udvikling, er den cellulære adfærd (f. eks, division akse) af individuelle celler specificeret af forskellige kemiske og fysiske signaler. At forstå, hvordan individuelle celle fortolker disse oplysninger, og hvordan de regulerer flercellet samling som en emergent ejendom er et af de ultimative mål for morfogenese undersøgelser. Den model organisme C. elegans har bidraget væsentligt til forståelsen af cellulære-niveauregulering af morfogenesis såsom celle polaritet1, celle division mønster1, celle skæbne beslutning2, og vævs-skala regler såsom neuronal ledningsføring3 og organogenesen4,5. Selv om der er forskellige genetiske værktøjer til rådighed, vævsteknik metoder er begrænset.
Den mest succesfulde vævsteknik metode i C. elegans undersøgelse er den klassiske blastomerkerneoverførsel isolation6; som C. elegans embryo er omgivet af en æggeskal og en permeabilitet barriere7, deres fjernelse er en af de vigtigste procedurer for denne metode. Mens denne blastomerkerneoverførsel isolationsmetode muliggør rekonstitution af celle celle kontakt på en forenklet måde, giver den ikke mulighed for eliminering af uønskede signaler; celle kontakt stadig udgør både mekaniske (f. eks, vedhæftning) og kemiske signaler, og dermed begrænse vores evne til fuldt ud at analysere årsagssammenhæng mellem cue og cellulære adfærd.
Metoden præsenteret i dette papir bruger carboxylat modificerede polystyren perler, der kan kovalent binde sig til nogen Amin-reaktive molekyler, herunder proteiner som ligands. Især, vi brugte en Amin-reaktiv form af Rhodamine rød-X som en ligand at gøre perler både visuelt track bare og klæbemiddel til cellen. Carboxylgrupper grupper af perle overflade og primære Amin grupper af ligand molekyle er koblet af vandopløselige carbodiimide 1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Opnået klæbende perler giver mulighed for virkningerne af den mekaniske cue på cellulære Dynamics10. Vi har brugt denne teknik til at identificere mekaniske signaler, der kræves for celledeling orientering10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

I flercellede systemer er individuelle celler omgivet af de forskellige fysiske og kemiske signaler, der kommer fra tilstødende celler og miljøet. Denne vævs kompleksitet behersker identifikationen af årsagssammenhæng mellem ydre signaler og cellulær dynamik. Et syntetisk rekonstitueret multicellulært system overvinder dette problem ved at gøre det muligt for forskerne at teste for en bestemt cue og samtidig eliminere andre. Her præsenterer vi en metode til at rekonstruere celle kontakt mønstre med isolerede caenorhabditis elegans blastomerkerneoverførsel og klæbende polystyren perler. Procedurerne involverer ægge fjernelse, blastomerkerneoverførsel isolation ved at forstyrre celle-celle vedhæftning, fremstilling af klæbende polystyren perler, og rekonstitution af celle-celle eller celle-perle kontakt. Endelig præsenterer vi anvendelsen af denne metode til at undersøge orienteringen af cellulære division akser, der bidrager til reguleringen af rumlige cellulære mønsterog celle skæbne specifikation i at udvikle embryoner. Denne robuste, reproducerbare og alsidige in vitro-metode gør det muligt at studere direkte relationer mellem fysiske celle kontakt mønstre og cellulære reaktioner.

Til tilberedning af perler fastsatte vi den optimale mængde Rhodamine rød-X succinimidyl ester til den transgene stamme, der udtrykker GFP-myosin II og mCherry-Histon (figur 1A-D). Vi brugte mCherry Tagged Histon som en markør for celle cyklus progression. Fordi både rhodamine rødt-x og mcherry vil blive belyst af en 561 nm laser, den optimale intensitet af rhodamine rødt-x signal er sammenlignelig med Histon at tillade samtidige billeddannelse af celle og perle. For e...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Vævs kompleksiteter af flercellede systemer har bevaret identifikationen af årsagssammenhæng mellem ekstracellulære signaler og individuelle cellulære adfærd. Her præsenterer vi en metode til at studere den direkte forbindelse mellem kontaktafhængige signaler og divisions akser ved hjælp af C. elegans embryo blastomeres og klæbende polystyren perler.

In vitro rekonstitution af Rumcelle kontakt mønstre med isolerede Caenorhabditis elegans embryo blastomeres og klæbende polystyren perler

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Multicellulære væv kompleks, denne protokol rekonstituerer cellulære adfærd på en forenklet måde. En ting er denne teknik til at studere de direkte relationer mellem cellulære dirigent protoner og cellulære svar. Denne protokol bruger kemisk funktionelle polystyrenperler til at rekonstituere den cellulære dirigentprotoner.Perlerne kan skæres med eventuelle protoner af interesse, for at teste deres virkninger på cellulære svar. Vi har brugt denne metode i C-Elegance på museembryoner. Derfor kan denne protokol være oprejst til undersøgelser af brede organismer.Da embryoner er skrøbelige efter høj fuld chloritbehandling, er der behov for betydelig praksis, før man med succes kan isolere blastomere. Visuel demonstration vil give en større forståelse af, hvordan man skal håndtere kapillær under blastomere-isolation metoder. Til at begynde, vejer 10 milli-gram carboxylate modificerede polystyren perler i en 1,5 milli-liters mikro centrifuge rør.Tilføj en milli-liter MES buffer i røret til at vaske. Vortex røret til at blande perlerne. Drej røret i 60 sekunder ved 2000XG via bænk-top centrifuge.Dicard supernatanten ved forsigtigt at pipettere bufferen ud. Vask perlerne igen med en milli-liters MES buffer. Efter vask, tilsæt en milli-liter MES buffer, der indeholder 10 milli-gram EDAC i røret, for at aktivere overfladen carboxyl grupper.Vortex røret til at blande perlerne. Rørglasset roteres og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur. Drej perlerne ned i 60 sekunder ved 2000XG.Kassér supernatanten ved forsigtigt at pippe ud af bufferen, og vask med en milli-liter PBS. Vortex røret til at blande perlerne og gentag PBS vask en gang mere. Forbered en milli-liter af en, 10, 100, og tusindfold fortynding serie af Rhodamine Red-X fra 0,65 milli-liters Rhodamine Red-X lager løsning.Pippette 20 mikro-liter perler i hver seriel fortynding rør. Rørerne roteres og inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur. Vask perlerne to gange med en milli-liter PBS.Efter vask, tilsæt en milli-liter PBS i rørene og gemme dem på fire grader Celsius i op til seks uger. Kontroller fluorescensintensiteten af perlerne under et mikroskop, der anvendes til levende billeddannelse. Hold hver ende af en mikro-kapillær med en kapacitet på 10 mikro-liter med højre og venstre hånd.Træk mikro-kapillær mod begge ender til at anvende spænding og bringe midten af kapillær over en brænder til at gøre to hånd-trak kapillærer. Under dissekerende mikroskop, trimme spidsen af hånd-trukket kapillærer med snævring. Gør de to spids åbning størrelser cirka to gange, og en gange den korte adgang længde C-Elegance Embryoner for embryo overførsel og æggeskal fjernelse henholdsvis.Fastgør den trak kapillær i et mundpippeapparat. Pippette 45 mikro-liter æg-salte løsning på en brønd af en multi-welled dias. Placer fem til 10 voksne C-Elegance på brønden.For at opnå tidlige C-Elegance Embryoner skåret voksne i stykker ved at placere to nåle til højre og venstre for C-Elegance krop, og skubbe nålene forbi hinanden. Pippette 45 mikro-liter hypochlorit opløsning på en brønd ved siden af godt indeholdende æg-salt opløsning og pippette 45 mikro-liter shelton's Vækst Medium på de efterfølgende tre brønde. Overfør en celle fase og tidlige to celle fase embryoner i hypochlorit opløsning ved munden pippette med større størrelse åbning og vente i 40 til 55 sekunder.Vask embryonerne ved at overføre dem til de næste tre brønde med Sheltons vækstmedium. Med et til to sekunder i hver af de to første brønde. Brug den håndtegnede kapillær med den mindre åbning gentages forsigtigt pippetting fosteret til æggeskalfjernelse.Derefter kontinuerligt pippette med den håndtegnede kapillær til at adskille de to-cellet fase embryonale blastomeres. Efter æggeskal fjernelse, minimere kraften i pippetting embryonerne op og ned for at forhindre burst. Forbered et billedkammer ved at placere en dæksling på en dækslingholder og tape kanterne af dækslæbet til at stabalize det.Vend dækslædholderen, og tegn en cirkel på dækslæbet med en hydrofob pen. Tilføj Shelton's Vækst Medium i cirklen trukket af hydrofobe markør, og overføre den isolerede blastomere til billeddannelse kammer i cirklen. Nu dispensere en lille mængde af de kemisk funktionaliserede perler på dækslet ved hjælp af den håndtegnede kapillær med den større åbning.Styr placeringen af perlerne ved at blæse ind i den håndtegnede kapillær, indtil perlerne fastgøres til den isolerede blastomere. Monter dækslæbet for at undgå fordampning af medium og udfør levende billeddannelse ved hjælp af et omvendt mikroskop. I denne undersøgelse, fluorescerende signal fra perlen behandlet med 0,005 mikro-gram pr milli-liters Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester for den transgene stamme udtrykke GFP miosin-2 og M-cherihistone var for svag.På den anden side var fluorescerende signalet fra perlerne behandlet med fem mikro-gram pr. milli-liters Rhodamin Red-X Succinimidyl Ester for stærk. Koncentrationen af Rhodamin Red-X Succinimidyl Ester på 0,5 mikro-gram pr. milli-liter var optimal for denne særlige transgene stamme. Under den levende billeddannelse et fly blev identificeret, hvor to centrosomes var lodret justeret.Flyet med plus eller minus 90 graders vinkel på dette plan er spindelplan. Vinkeln på spindelorientering i forhold til celle/perlekontaktgrænsefladen efter cytokinese viser, at begge datterceller var fastgjort til perle i en linje, der passerer begge kontaktsetile neferencer, blev brugt som kontaktorientering. Man skal lære, hvordan embryoner og æggeskal reagere på visse eksterne kræfter, der anvendes af munden pippette.Teoretisk set kan enhver cellulær respons studeres, for eksempel, sulfat specifikation kan studeres ved dyrkning celler og kontakt med klæbende perler over længere sigt. Denne teknik er blevet brugt til at forstå kontaktafhængig celledeling orientering mekanisme. PTF-filter blev anvendt til at forhindre indånding af røg fra hypochloritopløsning via mund pippette.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattende vurdering af Kimcellelinje kemiske toksicitet Brug nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Anvendelse af impermeable barrierer Kombineret med Candidate Factor Soaked Perler til at studere Induktive Signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumlig og tidsmæssig analyse af Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; Kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrkning for Live-celle Imaging af Zygote polarisering og Embryo mønstre i Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM og Microrheology i cellen zebrafisk Embryo æggeblomme

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering af Caenorhabditis elegans at analysere intracellulær Transport i neuroner

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Vurdering af lysosomale basisk i tarmen af Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Sondering celle mekanik med perle-fri Optisk pincet i Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...