Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

We bedanken James Priess en Bruce Bowerman voor advies en het verstrekken van c. elegans stammen, Don Moerman, Kota Mizumoto, en Life Sciences Institute Imaging Core faciliteit voor het delen van apparatuur en reagentia, aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, min JEE Kim voor het onderhoud van c. elegans en kritische lezing van ons manuscript. Ons werk wordt ondersteund door de Raad voor Natuurwetenschappen en ingenieurs onderzoek van Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

1. bereiding van zelfklevende polystyreen kraal
Opmerking: dit protocol vereist geen aseptische techniek.
<ol><li>Weeg 10 mg carboxylaat gemodificeerde polystyreen kralen af in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.</li>
	<li>Om de kralen te wassen, voeg 1 mL 2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur (MES) buffer toe aan de buis. Aangezien MES buffer geen fosfaat en acetaat bevat, wat de reactiviteit van Carbodiimide kan verminderen, is het geschikt om te gebruiken bij eiwit koppelingsreactie. Vort...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+pharynx:+a+model+for+organogenesis.">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li><li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+intestine.">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Manipulation+of+Embryonic+Cells.">Culture and Manipulation of Embryonic Cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li><li>Stein, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+eggshell.">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li><li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines,+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests.">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li><li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tyrosine+aminotransferase+by+affinity+chromatography.">Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).</li><li>Sugioka, K., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+contact+cues+specify+cell+division+orientation+by+directing+cortical+myosin+flows.">Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows.</a> Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).</li><li>Park, F. D., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

Reconstitutie van vereenvoudigde celcontactpatronen laat onderzoekers de rollen van specifieke celcontactpatronen in verschillende aspecten van de morfogenese testen. We hebben deze techniek gebruikt om te laten zien dat de celdelings as wordt bestuurd door het fysieke contact met lijm parels10. Aangezien de specificatie van de delings assen cruciaal is voor multicellulaire ontwikkeling door bij te dragen aan morphogenesis14, stamcel divisie15,<...

Tijdens multicellulaire ontwikkeling worden het cellulaire gedrag (bv. delings as) van individuele cellen gespecificeerd door verschillende chemische en fysieke aanwijzingen. Om te begrijpen hoe individuele cellen deze informatie interpreteert, en hoe ze de multicellulaire assemblage reguleren als een emergente eigenschap is een van de ultieme doelen van morfogenese studies. Het modelorganisme C. elegans heeft aanzienlijk bijgedragen tot het begrijpen van de cellulaire regulering van de morfogenese zoals cel polariteit1, Cell Division patronen1, cel Fate decision2, en weefsel schaal verordeningen zoals neuronale bedrading3 en organogenese4,5. Hoewel er verschillende genetische hulpmiddelen beschikbaar zijn, zijn weefsel engineering methoden beperkt.
De meest succesvolle weefseltechnische methode in C. elegans Study is de klassieke blastomere Isolation6; Als C. elegans embryo is omgeven door een eierschaal en een permeabiliteit barrière7, hun verwijdering is een van de belangrijkste procedures van deze methode. Hoewel deze blastomere-isolatiemethode het oplossen van celcelcontact op een vereenvoudigde manier mogelijk maakt, staat het niet toe dat ongewenste signalen worden weggenomen; celcontact vormt nog steeds zowel mechanisch (bijv. adhesie) als chemische aanwijzingen, waardoor ons vermogen om het oorzakelijke verband tussen de Cue en het cellulaire gedrag volledig te analyseren, wordt beperkt.
De in dit artikel gepresenteerde methode maakt gebruik van carboxylaat gemodificeerde polystyreen parels die covaltig kunnen binden aan elke amine-reactieve moleculen, waaronder eiwitten als liganden. Met name gebruikten we een amine-reactieve vorm van Rhodamine Red-X als een ligand om kralen zowel visueel traceerbaar en lijm aan de cel te maken. De carboxylgroepen van kraal oppervlak en primaire amine groepen van ligand molecuul worden gekoppeld door in water oplosbare Carbodiimide 1-ethyl-3-(Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDAC)8,9. Verkregen zelfklevende kralen zorgen voor de effecten van de mechanische Cue op cellulaire Dynamics10. We hebben deze techniek gebruikt om mechanische aanwijzingen te identificeren die nodig zijn voor de oriëntatie van de celdeling10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

In multicellulaire systemen worden individuele cellen omringd door de verschillende fysische en chemische signalen die afkomstig zijn van naburige cellen en het milieu. Deze weefsel complexiteit constideert de identificatie van causaal verband tussen extrinsieke signalen en cellulaire dynamiek. Een synthetisch gereconstitueerd multicellulair systeem overkomt dit probleem door onderzoekers in staat te stellen voor een specifieke Cue te testen terwijl ze anderen elimineren. Hier presenteren we een methode om celcontactpatronen te reconstitueren met geïsoleerde Caenorhabditis elegans blastomere en zelfklevende polystyreen kralen. De procedures betreffen het verwijderen van eierschalen, het isoleren van blastomere door het verstoren van de celcelhechting, de bereiding van zelfklevende polystyreen kralen en de reconstitutie van celcel-of celkraal contact. Tot slot presenteren we de toepassing van deze methode om de oriëntatie van cellulaire delings assen te onderzoeken die bijdraagt aan de regulering van ruimtelijke cellulaire patronen en specificatie van het lot van cellen bij de ontwikkeling van embryo's. Deze robuuste, reproduceerbare en veelzijdige in vitro-methode maakt de studie mogelijk van directe relaties tussen ruimtelijke celcontactpatronen en cellulaire reacties.

Voor de bereiding van kralen, bepaalden we de optimale hoeveelheid Rhodamine Red-X succinimidyl Ester voor de transgene stam die GFP-myosin II en mCherry-histone uitdrukken (Figuur 1A-D). We gebruikten mcherry Tagged Histon als een marker van de celcyclus progressie. Omdat zowel Rhodamine Red-x en mcherry zal worden verlicht door een 561 nm laser, de optimale intensiteit van Rhodamine Red-x signaal is vergelijkbaar met die van Histon om gelijktijdige beeldvorming van cel en ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Weefsel complexiteiten van multicellulaire systemen Verwar de identificatie van causaal verband tussen extracellulaire cues en individuele cellulaire gedragingen. Hier presenteren we een methode om de directe link tussen contact afhankelijke signalen en delings assen te bestuderen met behulp van C. elegans embryo blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen.

In vitro reconstitutie van ruimtelijke Celcontactpatronen met geïsoleerde Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Meercellige weefsels complex, dit protocol reconstrueert cellulair gedrag op een vereenvoudigde manier. Een ding is deze techniek om de directe relaties tussen cellulaire dirigent protonen en cellulaire respons te bestuderen. Dit protocol maakt gebruik van chemisch functionele polystyreen kralen om de cellulaire geleider protonen te reconstrueren.De kralen kunnen worden gesneden met eventuele protonen van belang, om hun effecten op cellulaire respons te testen. We hebben deze methode gebruikt in C-Elegance op muisembryo's. Daarom kan dit protocol rechtop staan bij de studies van brede organismen.Aangezien embryo's kwetsbaar zijn na een hoge volledige chlorietbehandeling, is een belangrijke praktijk vereist voordat men blastomere met succes kan isoleren. Visuele demonstratie zal een beter begrip geven van hoe men capillair moet behandelen tijdens blastomere-isolatiemethoden. Om te beginnen weegt u 10 milli gram carboxylaat gemodificeerd polystyreenkralen in een 1,5 milli-liter microcentrifugebuis.Voeg een milli-liter MES buffer in de buis te wassen. Vortex de buis om de kralen te mengen. Draai de buis 60 seconden op 2000XG via bench-top centrifuge.Dicard de supernatant door zorgvuldig pipetting uit de buffer. Was de kralen opnieuw met een milli-liter MES buffer. Voeg na de was een milli-liter MES-buffer met 10 milli gram EDAC in de buis toe om de oppervlaktecarboxylgroepen te activeren.Vortex de buis om de kralen te mengen. Draai en broed de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Spin de kralen voor 60 seconden op 2000XG.Gooi de supernatant door voorzichtig pippetting uit de buffer, en wassen met een milli-liter PBS. Vortex de buis om de kralen te mengen en herhaal de PBS wassen nog een keer. Bereid een milli-liter van een, 10, 100, en duizendvoudige verdunning serie van Rhodamine Red-X van de 0,65 milli-liter Rhodamine Red-X voorraad oplossing.Pippette 20 micro-liter kralen in elke seriële verdunningsbuis. Draai en ontcubeer de buizen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Was de kralen twee keer met een milli-liter PBS.Voeg na het wassen een milli-liter PBS toe aan de buizen en bewaar ze maximaal zes weken op vier graden Celsius. Controleer de fluorescentie intensiteit van de kralen onder een microscoop gebruikt voor live beeldvorming. Houd elk uiteinde van een micro-capillaire op een capaciteit van 10 micro-liter met de rechterhand en linkerhand.Trek de micro-capillaire naar beide uiteinden om spanning toe te passen en breng het midden van de haarvaten over een brander om twee handgetrokken haarvaten te maken. Trim onder de ontleedmicroscoop de uiteinden van de handgetrokken haarvaten met tangen. Maak de twee tip opening maten ongeveer twee keer, en een keer de korte toegangslengte van C-Elegance Embryo's voor de embryo transfer en eierschaal verwijdering respectievelijk.Bevestig de getrokken capillaire in een mond-pippetting apparaat. Pippette 45 micro-liter ei-zouten oplossing op een put van een multi-welled glijbaan. Plaats vijf tot 10 volwassen C-Elegance op de put.Om vroege C-Elegance Embryo's te verkrijgen snijd volwassenen in stukken door het plaatsen van twee naalden aan de rechterkant en links van het lichaam van C-Elegance, en glijden de naalden langs elkaar. Pippette 45 micro-liters hypochloriet oplossing op een put naast de put met ei-zout oplossing en pippette 45 micro-liters van Shelton's Growth Medium op de daaropvolgende drie putten. Breng een celstadium en vroege twee celstadium embryo's in de hypochloriet oplossing door de mond pippette met de grotere grootte opening en wacht 40 tot 55 seconden.Was de embryo's door ze over te brengen naar de volgende drie putten met Shelton's Growth Medium. Met één tot twee seconden in elk van de eerste twee putten. Met behulp van de met de hand getekende capillaire met de kleinere opening zorgvuldig herhalen pippetting het embryo voor eierschaal verwijderen.Daarna continu pippette met de handgetekende capillaire om de twee-cel stadium embryonale blastomeren te scheiden. Na het verwijderen van eierschaal, minimaliseer de kracht in pippetting de embryo's op en neer om barsten te voorkomen. Bereid een beeldkamer voor door een afdeklip op een coversliphouder te plaatsen en de randen van de coverslip vast te leggen om deze te stabaliseren.Draai de coversliphouder om en teken een cirkel op de coverslip met een hydrofobe pen. Voeg Shelton's Growth Medium toe binnen de cirkel getekend door de hydrofobe marker en breng de geïsoleerde blastomere over naar de beeldkamer binnen de cirkel. Nu, doe een klein volume van de chemisch gefunctionaliseerde kralen op de coverslip met behulp van de hand getekende capillaire met de grotere opening.Controleer de positie van de kralen door te blazen in de met de hand getekende capillaire totdat de kralen hechten aan de geïsoleerde blastomere. Monteer de coverslip om verdamping van medium te voorkomen en voer live beeldvorming uit met behulp van een omgekeerde microscoop. In deze studie, het fluorescerende signaal van de kraal behandeld met 0,005 micro-gram per milli-liter Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester voor de transgene stam uitdrukken GFP miosin-2 en M-cherihistone was te zwak.Aan de andere kant was het fluorescerende signaal van de kralen behandeld met vijf microgram per milli-liter Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester te sterk. De concentratie Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester van 0,5 microgram per milliliter was optimaal voor deze specifieke transgene stam. Tijdens de live beeldvorming werd een vliegtuig geïdentificeerd waar twee centrosomes verticaal waren uitgelijnd.Het vlak met een plus of min 90 graden hoek van dit vlak is spindel vlak. De hoek van de asoriëntatie ten opzichte van de contactinterface van de cel/kraal nadat cytokinese aantoont dat beide dochtercellen aan de kraal in een lijn zijn bevestigd die beide contactoriënteerte passeert, werd gebruikt als contactoriëntatie. Men moet leren hoe embryo's en eierschaal reageren op bepaalde externe krachten toegepast door de mond pippette.Theoretisch kan elke cellulaire respons worden bestudeerd, bijvoorbeeld, sulfaat specificatie kan worden bestudeerd door het kweken van cellen en contact met lijmkralen over langere termijnen. Deze techniek is gebruikt om contactafhankelijke celdelingsoriëntatiemechanisme te begrijpen. PTF-filter werd gebruikt om inademing van dampen van hypochlorietoplossing via mondpispitette te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em&gt; C. elegans</em&gt; Kiembaan

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM en Microrheology in de cel van de dooier Zebrafish de Embryo

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...