Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
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Nous remercions James Priess et Bruce Bowerman pour leurs conseils et leur fourniture de souches c. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto et Life Sciences Institute Imaging Core Facility pour le partage d'équipement et de réactifs, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim pour l'entretien de C. elegans et la lecture critique de notre manuscrit. Notre travail est appuyé par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (RGPIN-2019-04442).

1. Préparation de perles de polystyrène adhésif
REMARQUE : Ce protocole ne nécessite pas de technique aseptique.
<ol><li>Peser 10 mg de perles de polystyrène modifiés de carboxylate dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml.</li>
	<li>Pour laver les perles, ajouter 1 ml de tampon d'acide ethanesulfonic (MES) de 2 ml (N-(N-morpholino) dans le tube. Étant donné que le tampon MES ne contient pas de phosphate et d'acétate, ce qui peut réduire la réactivité du carbodiimide, il convient d...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

La reconstitution des modèles simplifiés de contact cellulaire permettra aux chercheurs de tester les rôles de modèles de contact cellulaire spécifiques dans différents aspects de la morphogénèse. Nous avons utilisé cette technique pour montrer que l'axe de division cellulaire est contrôlé par le contact physique avec des perles adhésives10. Comme la spécification de l'axe de division est cruciale pour le développement multicellulaire en contribuant à la morphogénèse<sup class="xr...

Pendant le développement multicellulaire, les comportements cellulaires (par exemple, l'axe de division) des cellules individuelles sont spécifiés par divers indices chimiques et physiques. Comprendre comment chaque cellule interprète cette information, et comment ils régulent l'assemblage multicellulaire comme une propriété émergente est l'un des objectifs ultimes des études de morphogénèse. L'organisme modèle C. elegans a contribué de manière significative à la compréhension de la régulation au niveau cellulaire de la morphogénèse comme la polarité cellulaire1, la division cellulaire modelant1, la décision du destin cellulaire2, et les règlements à l'échelle des tissus tels que le câblage neuronal3 et l'organogenèse4,5. Bien qu'il existe divers outils génétiques disponibles, les méthodes d'ingénierie tissulaire sont limitées.
La méthode d'ingénierie tissulaire la plus réussie dans l'étude de C. elegans est l'isolement classique de blastomere6; comme l'embryon de C. elegans est entouré d'une coquille d'œuf et d'une barrière de perméabilité7, leur élimination est l'une des principales procédures de cette méthode. Bien que cette méthode d'isolement blastomere permet la reconstitution du contact cellule-cellule d'une manière simplifiée, elle ne permet pas l'élimination des indices indésirables; le contact cellulaire pose toujours à la fois des indices mécaniques (p. ex. adhérence) et chimiques, limitant ainsi notre capacité d'analyser pleinement la relation causale entre le signal et le comportement cellulaire.
La méthode présentée dans cet article utilise des perles de polystyrène modifiés au carboxylate qui peuvent se lier de façon covalente à toutes les molécules réactives à l'amine, y compris les protéines comme ligands. En particulier, nous avons utilisé une forme amine-réactive de Rhodamine Red-X comme un ligand pour faire des perles à la fois visuellement trackable et adhésif à la cellule. Les groupes de carboxyl de surface de perle et les groupes primaires d'amine de molécule de ligand sont couplés par le carbodiimide soluble dans l'eau 1-éthylique-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Les perles adhésives obtenues permettent les effets de la queue mécanique sur la dynamique cellulaire10. Nous avons utilisé cette technique pour identifier les indices mécaniques nécessaires à l'orientation de la division cellulaire10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

Dans les systèmes multicellulaires, les cellules individuelles sont entourées par les différents indices physiques et chimiques provenant des cellules voisines et de l'environnement. Cette complexité tissulaire confond l'identification du lien de causalité entre les indices extrinsèques et la dynamique cellulaire. Un système multicellulaire reconstitué synthétiquement surmonte ce problème en permettant aux chercheurs de tester un signal spécifique tout en éliminant les autres. Ici, nous présentons une méthode pour reconstituer des modèles de contact de cellules avec le blastomere isolé de Caenorhabditis elegans et les perles adhésives de polystyrène. Les procédures impliquent l'enlèvement de coquille d'œuf, l'isolement blastomere en perturbant l'adhérence de cellule-cellule, la préparation des perles adhésives de polystyrène, et la reconstitution du contact de cellule-cellule ou de cellule-perle. Enfin, nous présentons l'application de cette méthode pour étudier l'orientation des axes de division cellulaire qui contribue à la régulation du modelage cellulaire spatial et de la spécification du destin cellulaire dans le développement des embryons. Cette méthode in vitro robuste, reproductible et polyvalente permet d'étudier les relations directes entre les modèles de contact cellulaire spatial et les réponses cellulaires.

Pour la préparation des perles, nous avons déterminé la quantité optimale de Rhodamine Red-X succinimidyl ester pour la souche transgénique exprimant GFP-myosin II et mCherry-histone (Figure 1A-D). Nous avons utilisé mCherry marqué histone comme un marqueur de la progression du cycle cellulaire. Parce que Rhodamine Red-X et mCherry seront illuminés par un laser de 561 nm, l'intensité optimale du signal Rhodamine Red-X est comparable à celle de l'histone pour permet...

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In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Les complexités tissulaires des systèmes multicellulaires confondent l'identification de la relation causale entre les indices extracellulaires et les comportements cellulaires individuels. Ici, nous présentons une méthode pour étudier le lien direct entre les indices contact-dépendants et les axes de division utilisant des blastomeres d'embryon de C. elegans et des perles adhésives de polystyrène.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Complexe de tissus multicellulaires, ce protocole reconstitue la conduite cellulaire d’une manière simplifiée. Une chose est cette technique pour étudier les relations directes entre les protons de conducteur cellulaire et la réponse cellulaire. Ce protocole utilise des perles de polystyrène chimiquement fonctionnelles pour reconstituer les protons du conducteur cellulaire.Les perles peuvent être coupées avec n’importe quel proton d’intérêt, pour tester leurs effets sur la réponse cellulaire. Nous avons utilisé cette méthode dans C-Elegance sur les embryons de souris. Par conséquent, ce protocole peut être droit aux études des organismes larges.Comme les embryons sont fragiles après un traitement à haute teneur en chlorite, une pratique importante est nécessaire avant de pouvoir isoler avec succès le blastoméome. La démonstration visuelle fournira une meilleure compréhension de la façon dont on devrait gérer capillaire pendant les méthodes d’isolation blastomere. Pour commencer, pesez 10 milligrammes de perles de polystyrène modifiées carboxylate dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millimètre.Ajouter un milli litre de tampon MES dans le tube pour le laver. Vortex le tube pour mélanger les perles. Faites tourner le tube pendant 60 secondes à 2000XG via une centrifugeuse à banc.Dicard le supernatant en pipetting soigneusement le tampon. Lavez les perles à nouveau avec un milli litre de tampon MES. Après le lavage, ajouter un millimètre de tampon MES contenant 10 milligrammes d’EDAC dans le tube, pour activer les groupes de carboxyl de surface.Vortex le tube pour mélanger les perles. Faire pivoter et incuber le tube pendant 15 minutes à température ambiante. Faites tourner les perles pendant 60 secondes à 2000XG.Jetez le supernatant en pippetting soigneusement le tampon, et laver avec un milli-litre de PBS. Vortex le tube pour mélanger les perles et répéter le lavage PBS une fois de plus. Préparez un millimètre d’une, 10, 100, et mille fois série de dilution de Rhodamine Red-X de la solution de stock Rhodamine Red-X de 0,65 millimètre Rhodamine Red-X.Pippette 20 micro-litres de perles dans chaque tube de dilution en série. Faire pivoter et incuber les tubes pendant cinq minutes à température ambiante. Laver les perles deux fois avec un milli litre de PBS.Après le lavage, ajouter un milli litre de PBS dans les tubes et les conserver à quatre degrés Celsius jusqu’à six semaines. Vérifiez l’intensité de fluorescence des perles au microscope utilisé pour l’imagerie en direct. Tenez chaque extrémité d’un micro-capillaire à une capacité de 10 micro-litres avec main droite et gauche.Tirez le micro-capillaire vers les deux extrémités pour appliquer la tension et amener le centre du capillaire sur un brûleur pour faire deux capillaires tirés à la main. Sous le microscope disséquant, couper les extrémités des capillaires tirés à la main avec des forceps. Faites les deux tailles d’ouverture de pointe approximativement deux fois, et une fois la courte longueur d’accès des embryons de C-Elegance pour le transfert d’embryon et l’enlèvement de coquille d’oeuf respectivement.Attachez le capillaire tiré dans un appareil de pippetting de bouche. Pippette 45 micro-litres de sels d’oeufs solution sur un puits d’une diapositive multi-puits. Placez cinq à 10 adultes C-Elegance sur le puits.Pour obtenir les premiers embryons C-Elegance couper les adultes en morceaux en plaçant deux aiguilles à droite et à gauche du corps de C-Elegance, et glisser les aiguilles les uns après les autres. Pippette 45 micro-litres de solution hypochlorite sur un puits à côté du puits contenant la solution oeuf-sel et pippette 45 micro-litres de Shelton’s Growth Medium sur les trois puits suivants. Transférer un stade cellulaire et les embryons précoces à deux stades cellulaires dans la solution hypochlorite par la pippette buccae avec l’ouverture de plus grande taille et attendre 40 à 55 secondes.Lavez les embryons en les transférant dans les trois puits suivants avec le milieu de croissance de Shelton. Avec une à deux secondes dans chacun des deux premiers puits. À l’aide du capillaire dessiné à la main avec l’ouverture de plus petite taille, répéter soigneusement le pippetting de l’embryon pour l’enlèvement de coquille d’œuf.Après cela, pippette continuellement avec le capillaire dessiné à la main pour séparer les blastomères embryonnaires de stade à deux cellules. Après l’ablation de la coquille d’œuf, réduisez au minimum la force de pippetting les embryons de haut en bas pour empêcher l’éclatement. Préparez une chambre d’imagerie en plaçant un coverslip sur un support de coverslip et collez les bords du coverslip pour le stabalize.Retournez le support de coverslip, et dessinez un cercle sur le coverslip avec un stylo hydrophobe. Ajoutez le milieu de croissance de Shelton dans le cercle dessiné par le marqueur hydrophobe, et transférez le blastomere isolé à la chambre d’imagerie dans le cercle. Maintenant, distribuez un petit volume des perles chimiquement fonctionnalisées sur le coverslip utilisant le capillaire dessiné à la main avec la plus grande ouverture.Contrôlez la position des perles en soufflant dans le capillaire dessiné à la main jusqu’à ce que les perles s’attachent au blastomere isolé. Montez le coverslip pour éviter l’évaporation du milieu et effectuez l’imagerie en direct à l’aide d’un microscope inversé. Dans cette étude, le signal fluorescent de la perle traitée avec 0.005 microgrammes par milli-litre Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester pour la souche transgénique exprimant GFP miosin-2 et M-cherihistone était trop faible.D’autre part, le signal fluorescent des perles traitées avec cinq microgrammes par millimètre Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester était trop fort. La concentration de Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester à 0,5 microgramme par millimètre était optimale pour cette souche transgénique particulière. Au cours de l’imagerie en direct, un avion a été identifié où deux centrosomes étaient alignés verticalement.L’avion avec un angle de plus ou moins 90 degrés de ce plan est un avion à fuseaux. L’angle d’orientation du fuseau par rapport à l’interface de contact cellule/perle après la cytokinesis montre que les deux cellules de fille ont été attachées à la perle dans une ligne qui passe les deux vues de contact a été employée comme orientation de contact. Il faut apprendre comment les embryons et la coquille d’œuf réagissent à certaines forces externes appliquées par la pippette buccae.Théoriquement, n’importe quelle réponse cellulaire peut être étudiée, par exemple, la spécification de sulfate peut être étudiée par des cellules de culture et le contact avec des perles adhésives sur de plus longues durées. Cette technique a été utilisée pour comprendre le mécanisme d’orientation de la division cellulaire dépendante du contact. Le filtre de PTF a été employé pour empêcher l’inhalation des vapeurs de solution d’hypochlorite par la pippette de bouche.

Research

JoVE Journal

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