Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

Wir danken James Priess und Bruce Bowerman für die Beratung und Bereitstellung von C. elegans Stämmen, Don Moerman, Kota Mizumoto und Life Sciences Institute Imaging Core Facility für den Austausch von Geräten und Reagenzien, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim für die Wartung von C. elegans und die kritische Lektüre unseres Manuskripts. Unsere Arbeit wird vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442) unterstützt.

1. Herstellung von Klebstoff-Polystyrol-Perle
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert keine aseptische Technik.
<ol><li>Wiegen Sie 10 mg Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.</li>
	<li>Um die Perlen zu waschen, fügen Sie 1 ml 2-(N-Morpholino)Ethanulfonsäure (MES) Puffer in die Röhre. Da der MES-Puffer kein Phosphat und Acetat enthält, was die Reaktivität von Carbodiimid reduzieren kann, ist er für die Proteinkopplungsreaktion geeignet. Wirbel nisch ...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+pharynx:+a+model+for+organogenesis.">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li><li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+intestine.">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Manipulation+of+Embryonic+Cells.">Culture and Manipulation of Embryonic Cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li><li>Stein, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+eggshell.">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li><li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines,+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests.">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li><li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tyrosine+aminotransferase+by+affinity+chromatography.">Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).</li><li>Sugioka, K., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+contact+cues+specify+cell+division+orientation+by+directing+cortical+myosin+flows.">Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows.</a> Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).</li><li>Park, F. D., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

Die Rekonstitution vereinfachter Zellkontaktmuster ermöglicht es Forschern, die Rollen bestimmter Zellkontaktmuster in verschiedenen Aspekten der Morphogenese zu testen. Wir haben diese Technik verwendet, um zu zeigen, dass die Zellteilungsachse durch den physischen Kontakt mit Klebeperlen10gesteuert wird. Da die Divisionsachsenspezifikation für die multizelluläre Entwicklung entscheidend ist, indem sie zur Morphogenese14,Stammzellteilung15,<...

Während der multizellulären Entwicklung werden die zellulären Verhaltensweisen (z.B. Divisionsachse) einzelner Zellen durch verschiedene chemische und physikalische Hinweise spezifiziert. Zu verstehen, wie einzelne Zellen diese Informationen interpretieren und wie sie die mehrzellige Baugruppe als auftauchende Eigenschaft regulieren, ist eines der ultimativen Ziele von Morphogenesestudien. Der Modellorganismus C. elegans hat wesentlich zum Verständnis der zellulären Regulation der Morphogenese wie Zellpolarität1,Zellteilungsmuster1, Zellschicksalsentscheidung2und Gewebe-Skala-Vorschriften wie neuronale Verdrahtung3 und Organogenese4,5beigetragen. Obwohl es verschiedene genetische Werkzeuge zur Verfügung, Gewebe-Engineering-Methoden sind begrenzt.
Die erfolgreichste Tissue-Engineering-Methode in der C. elegans-Studie ist die klassische Blastomer-Isolation6; Da C. elegans Embryo von einer Eierschale und einer Durchlässigkeitsbarriere7umgeben ist, ist ihre Entfernung eines der hauptverfahren dieser Methode. Während diese blastomere Isolationsmethode eine vereinfachte Rekonstitution des Zell-Zell-Kontakts ermöglicht, erlaubt sie nicht die Eliminierung unerwünschter Hinweise; Der Zellkontakt stellt nach wie vor sowohl mechanische (z. B. Haftung) als auch chemische Hinweise dar, wodurch unsere Fähigkeit, den kausalen Zusammenhang zwischen dem Cue und dem zellulären Verhalten vollständig zu analysieren, eingeschränkt wird.
Die in diesem Papier vorgestellte Methode verwendet Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen, die kovalent an alle amin-reaktiven Moleküle binden können, einschließlich Proteine wie Liganden. Insbesondere haben wir eine amin-reaktive Form von Rhodamine Red-X als Liganden verwendet, um Perlen sowohl visuell nachvollziehbar als auch klebend an der Zelle zu machen. Die Carboxylgruppen der Perlenoberfläche und der primären Amingruppen von Ligandenmolekülen werden durch wasserlösliches Carbodiimid 1-ethyl-3-(Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDAC)8,9gekoppelt. Erhaltene Klebeperlen ermöglichen die Auswirkungen des mechanischen Hinweises auf die Zelldynamik10. Wir haben diese Technik verwendet, um mechanische Hinweise zu identifizieren, die für die Zellteilungsausrichtung10erforderlich sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

In mehrzelligen Systemen sind einzelne Zellen von den verschiedenen physikalischen und chemischen Hinweisen umgeben, die aus benachbarten Zellen und der Umgebung stammen. Diese Gewebekomplexität verwirrt die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrinsischen Cues und zellulärer Dynamik. Ein synthetisch rekonstituiertes mehrzelliges System überwindet dieses Problem, indem es Forschern ermöglicht, auf einen bestimmten Hinweis zu testen und andere zu eliminieren. Hier stellen wir eine Methode zur Rekonstituierung von Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans blastomer und klebenden Polystyrolperlen vor. Die Verfahren umfassen die Entfernung von Eierschalen, blastomere Isolierung durch Unterbrechung der Zell-Zell-Adhäsion, Die Herstellung von klebenden Polystyrolperlen und die Rekonstitution von Zellzell- oder Zellperlenkontakt. Schließlich stellen wir die Anwendung dieser Methode vor, um die Ausrichtung zellulärer Teilungsachsen zu untersuchen, die zur Regulierung der räumlichen zellulären Musterung und Zellschicksalsspezifikation bei der Entwicklung von Embryonen beiträgt. Diese robuste, reproduzierbare und vielseitige In-vitro-Methode ermöglicht die Untersuchung direkter Zusammenhänge zwischen räumlichen Zellkontaktmustern und zellulären Reaktionen.

Für die Perlenpräparation haben wir die optimale Menge an Rhodamin-Rot-X-Succinimidylester für den transgenen Stamm bestimmt, der GFP-Myosin II und mCherry-Histon exzessiiert (Abbildung 1A-D). Wir verwendeten mCherry mit Histon als Marker für die Zellzyklusprogression. Da sowohl Rhodamine Red-X als auch mCherry mit einem 561 nm Laser beleuchtet werden, ist die optimale Intensität des Rhodamine Red-X Signals mit der von Histone vergleichbar, um eine gleichzeitige Bildgeb...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Gewebekomplexitäten multizellulärer Systeme verwirren die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrazellulären Hinweisen und individuellen zellulären Verhaltensweisen. Hier stellen wir eine Methode vor, um den direkten Zusammenhang zwischen kontaktabhängigen Cues und Divisionsachsen mit C. elegans embryo blastomeres und klebenden Polystyrolperlen zu untersuchen.

In Vitro Rekonstitution von räumlichen Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeren und Klebstoff Polystyrol Perlen

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Multizelluläre Gewebe komplex, stellt dieses Protokoll zelluläre Verhalten in einer vereinfachten Weise. Eine Sache ist diese Technik, um die direkten Beziehungen zwischen zellulären Leiter protonen und zelluläre Reaktion zu studieren. Dieses Protokoll verwendet chemisch funktionelle Polystyrolperlen, um die Zellleiterprotonen zu rekonstruieren.Die Perlen können mit allen Protonen von Interesse geschnitten werden, um ihre Auswirkungen auf die zelluläre Reaktion zu testen. Wir haben diese Methode in C-Elegance auf Mausembryonen verwendet. Daher kann dieses Protokoll aufrecht zu den Studien von weit verbreiteten Organismen sein.Da Embryonen nach einer hohen vollflächigen Chloritbehandlung zerbrechlich sind, ist eine signifikante Praxis erforderlich, bevor man Blastomer erfolgreich isolieren kann. Visuelle Demonstration wird ein besseres Verständnis dafür bieten, wie man Kapillaren während Blastomer-Isolationsmethoden handhaben sollte. Zunächst wiegen Sie 10 Milligramm Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen in einem 1,5-Milli-Liter-Mikrozentrifugenrohr.Fügen Sie einen Milliliter MES-Puffer in das Rohr zum Waschen. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen. Drehen Sie das Rohr für 60 Sekunden bei 2000XG über Diebzentrifuge.Dicard den Überstand durch sorgfältiges Pipettieren des Puffers. Waschen Sie die Perlen erneut mit einem Milliliter MES-Puffer. Nach dem Waschen einen Milliliter MES-Puffer mit 10 Milli-Gramm EDAC in das Rohr geben, um die Oberflächen-Carboxylgruppen zu aktivieren.Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen. Drehen und inkubieren Sie das Rohr für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Perlen für 60 Sekunden bei 2000XG.Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer vorsichtig ausrohren, und waschen Sie ihn mit einem Milliliter PBS. Wirbeln Sie das Rohr, um die Perlen zu mischen und wiederholen Sie die PBS waschen ein anderes Mal. Bereiten Sie einen Milliliter einer, 10, 100 und tausendfachen Verdünnungsserie von Rhodamine Red-X aus der 0,65-Milli-Liter-Rhodamine Red-X-Lagerlösung vor.Pippette 20 Mikroliter Perlen in jede serielle Verdünnungsröhre. Drehen und inkubieren Sie die Rohre für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Perlen zweimal mit einem Milli-Liter PBS.Nach dem Waschen einen Milliliter PBS in die Schläuche geben und bis zu sechs Wochen bei vier Grad Celsius lagern. Überprüfen Sie die Fluoreszenzintensität der Perlen unter einem Mikroskop, das für die Live-Bildgebung verwendet wird. Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare bei einem Fassungsvermögen von 10 Mikrolitern mit rechter und linker Hand.Ziehen Sie die Mikrokapillare an beiden Enden, um Spannung aufzutragen, und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren herzustellen. Schneiden Sie unter dem Seziermikroskop die Spitzen der handgezogenen Kapillaren mit Zangen. Machen Sie die beiden Spitzenöffnungsgrößen etwa zweimal und ein Mal die kurze Zugangslänge von C-Elegance Embryos für den Embryotransfer bzw. die Eischalenentfernung.Befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mund-Pippetting-Gerät. Pippette 45 Mikroliter Eisalzlösung auf einen Brunnen einer mehrwelligen Rutsche. Platz fünf bis zehn Erwachsene C-Elegance auf den Brunnen.Um frühe C-Elegance-Embryonen zu erhalten, schneiden Erwachsene in Stücke, indem sie zwei Nadeln rechts und links des Körpers von C-Elegance positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben. Pippette 45 Mikroliter Hypochloritlösung auf einen Brunnen neben der gut haltigen Ei-Salz-Lösung und Pippette 45 Mikroliter von Sheltons Wachstumsmedium auf die folgenden drei Brunnen. Übertragen Sie eine Zellstufe und frühe zwei Zellstadium Embryonen in die Hypochlorit-Lösung durch den Mund Pippette mit der größeren Größe Öffnung und warten Sie für 40 bis 55 Sekunden.Waschen Sie die Embryonen, indem Sie sie mit Sheltons Wachstumsmedium in die nächsten drei Brunnen übertragen. Mit jeweils ein bis zwei Sekunden in jedem der ersten beiden Brunnen. Mit der handgezeichneten Kapillare mit der kleineren Öffnung sorgfältig wiederholen Rohrleitung den Embryo für die Eischalenentfernung.Danach pippette kontinuierlich mit der handgezeichneten Kapillare, um die zweizelligen embryonalen Blastomere zu trennen. Nach der Entnahme der Eierschale minimieren Sie die Kraft beim Pippetting der Embryonen nach oben und unten, um ein Platzen zu verhindern. Bereiten Sie eine Bildkammer vor, indem Sie einen Deckelslip auf einen Deckelhalter legen und die Kanten des Abdeckungsslips verkleben, um ihn zu stabalisieren.Drehen Sie den Deckelhalter, und zeichnen Sie einen Kreis auf dem Coverslip mit einem hydrophoben Stift. Fügen Sie Sheltons Wachstumsmedium innerhalb des vom hydrophoben Marker gezeichneten Kreises hinzu und übertragen Sie das isolierte Blastomere in die Bildkammer innerhalb des Kreises. Geben Sie nun mit der handgezeichneten Kapillare mit der größeren Öffnung ein kleines Volumen der chemisch funktionalisierten Perlen auf den Deckel.Steuern Sie die Position der Perlen, indem Sie in die handgezeichnete Kapillare blasen, bis sich die Perlen an dem isolierten Blastomer befestigen. Montieren Sie den Deckelschlupf, um die Verdunstung von Medien zu vermeiden, und führen Sie Live-Bildgebung mit einem invertierten Mikroskop durch. In dieser Studie war das fluoreszierende Signal der mit 0,005 Mikrogramm pro Milliliter Rhodamine Red-X Succinimidylester behandelten Perle für den transgenen Stamm, der GFP Miosin-2 und M-Cherihiston exsetiert, zu schwach.Auf der anderen Seite war das fluoreszierende Signal der perlen, die mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Rhodamine Red-X Succinimidylester behandelt wurden, zu stark. Die Konzentration von Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester bei 0,5 Mikrogramm pro Milliliter war für diesen speziellen transgenen Stamm optimal. Während der Live-Bildgebung wurde eine Ebene identifiziert, wo zwei Zentrosomen vertikal ausgerichtet waren.Die Ebene mit plus oder minus 90 Grad Winkel dieser Ebene ist Spindelebene. Der Winkel der Spindelausrichtung relativ zur Zell-/Perlenkontaktschnittstelle nach zytokinese zeigt, dass beide Tochterzellen in einer Linie, die beide Kontaktsichten passiert, an der Perle befestigt waren, als Kontaktausrichtung verwendet wurde. Man muss lernen, wie Embryonen und Eierschalen auf bestimmte äußere Kräfte reagieren, die von der Mundpippette angewendet werden.Theoretisch kann jede zelluläre Reaktion untersucht werden, zum Beispiel kann die Sulfatspezifikation durch Kultivieren von Zellen und Kontakt mit Klebeperlen über längere Laufzeiten untersucht werden. Diese Technik wurde verwendet, um den kontaktabhängigen Ausrichtungsmechanismus für die Zellteilung zu verstehen. PTF-Filter wurde verwendet, um das Einatmen von Dämpfen der Hypochloritlösung über Mundpippette zu verhindern.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Die Anwendung der undurchlässige Barrieren In Kombination mit Candidate Factor Soaked Beads zu studieren Induktive Signale im Küken

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...