Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

אנו מודים לג פרינס ולברוס בוקרמן לקבלת ייעוץ ולמתן זנים של C. אלגיה , דון מירמן, קוטה מיזומוטו, ומכון למדעי החיים במכון לעיבוד ציוד וריאגנטים, אחאי הירוסו, ליסה פרננדו, מין ג'י קים למען תחזוקת הג והקריאה הקריטית של כתב היד שלנו. העבודה שלנו נתמכת על ידי מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

1. הכנת פוליסטירן מוקצף לחרוז
הערה: פרוטוקול זה אינו דורש טכניקה אספזיהומית.
<ol><li>שוקל 10 מ ג של carboxylate אוחר שונה פוליסטירן חרוזים בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.</li>
	<li>כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף 1 מ ל 2-(N-מורגואולנו) מאגר חומצה ethanesulfonic (MES) לתוך השפופרת. מאז מאגר MES אינו מכיל פוספט ?...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+pharynx:+a+model+for+organogenesis.">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li><li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+intestine.">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Manipulation+of+Embryonic+Cells.">Culture and Manipulation of Embryonic Cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li><li>Stein, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+eggshell.">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li><li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines,+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests.">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li><li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tyrosine+aminotransferase+by+affinity+chromatography.">Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).</li><li>Sugioka, K., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+contact+cues+specify+cell+division+orientation+by+directing+cortical+myosin+flows.">Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows.</a> Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).</li><li>Park, F. D., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

החוקה החוזרת של דפוסי קשר של תא מפושט יאפשר לחוקרים לבדוק את התפקידים של דפוסי קשר תאים ספציפיים בהיבטים שונים של הורפוגנזה. השתמשנו בטכניקה זו כדי להראות כי ציר החלוקה של התאים נשלט על ידי מגע פיזי עם חרוזים הדבק10. כמו מפרט ציר החלוקה הוא חיוני עבור פיתוח רב-תאיים על ידי תורם ?...

במהלך פיתוח רב-תאיים, התנהגויות הסלולר (למשל, ציר החלוקה) של תאים בודדים מצוינים באמצעות רמזים כימיים ופיזיים שונים. כדי להבין כיצד תא בודד מפרש מידע זה, וכיצד הם מסדירים הרכבה רב-תאיים כמאפיין מתהווה מהווה אחת המטרות הסופיות של לימודי הורפוגנזה. האורגניזם מודל C. אלגיה תרם באופן משמעותי להבנת הרגולציה ברמה התאית של מורפוגנזה כגון קוטביות תא1, תא הניתוח1, החלטה של תא הגורל2, ותקנות בקנה מידה של רקמות כגון החיווט העצבי3 ו אורגנוגנזה4,5. למרות שיש כלים גנטיים שונים זמינים, שיטות הנדסת רקמות מוגבלות.
שיטת הנדסת הרקמה המוצלחת ביותר בחקר ה -C. אלגיה היא הבידוד הקלאסי של6; כמו העובר C. אלגיה מוקפת קליפת ביצה וחדירות מחסום7, הוצאתם היא אחת הפרוצדורות העיקריות של שיטה זו. בעוד שיטת הבידוד הבלסטורה מאפשרת ליצור מחדש את הקשר של תא התא באופן פשוט, הוא אינו מאפשר חיסול של רמזים לא רצויים; קשר התא עדיין מהווה הן מכני (למשל, הדבקה) ורמזים כימיים, ובכך להגביל את היכולת שלנו לנתח באופן מלא את הקשר הסיבתי בין האות והתנהגות תאית.
השיטה המוצגת במאמר זה משתמשת carboxylate אוחר שונה פוליסטירן מחרוזות שיכול לאגד באופן מיטבי לכל מולקולות של האמין-תגובתי כולל חלבונים כמו ליגנדס. במיוחד, השתמשנו בצורה של מין מגיב-מאמין של rhodamine אדום-X כמו ליגנד כדי לעשות חרוזים הן העקיבה החזותית ודבק לתא. קבוצות קרבוקסילי של משטח חרוז וקבוצות אמין הראשי של ליגנד מולקולה הם ביחד על ידי מסיס מים קרבודיאימיד 1-אתיל-3-(dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד (edac)8,9. חרוזים מקבל דבק לאפשר את ההשפעות של הרמז המכני על דינמיקה סלולרית10. השתמשנו בטכניקה זו כדי לזהות רמזים מכניים הנדרשים לכיוון חלוקת תאים10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

במערכות רב-תאיים, תאים בודדים מוקפים ברמזים פיזיים וכימיים שונים המגיעים מתאים שכנים ומהסביבה. מורכבות רקמות זה מבלבלת את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים חיצוניים ודינמיקה סלולרית. מערכת מלאכותית מחדש מתגבר על בעיה זו בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לבדוק אות מסוים תוך חיסול אחרים. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש דפוסי קשר של התאים עם האלגיה הבודד Caenorditis בלייסטורה ומחרוזות פוליסטירן מוקצף. ההליכים כוללים הסרת קליפת ביצה, בידוד בלסטורה על ידי שיבוש תא תא הדבקה, הכנת חרוזים פוליסטירן מוקצף, והחוקה של תא תא או קשר עם חרוז תא. בסופו של דבר, אנו מציגים את היישום של שיטה זו כדי לחקור את הכיוון של צירי החטיבה התאית התורמת לוויסות הריבוב הסלולר המרחבי ואת מפרט הגורל התא בפיתוח עוברים. שיטת החשיבה האיתנה והמגוונת מאפשרת ללמוד יחסים ישירים בין דפוסי קשר של תאים מרחביים ותגובות סלולריות.

עבור הכנת חרוזים, קבענו את הכמות האופטימלית של הרדאמלין אדום-X מסוג הרמדמידימאדיל עבור הזן הטרנסגניים המבטא GFP-רירן II ו-mCherry-histone (איור 1א-ד). השתמשנו mcherry מתויג היסטון כסמן של התקדמות מחזור התא. מכיוון הן rhodamine אדום-x ו-mcherry יהיה מואר על ידי 561 ננומטר לייזר, האינטנסיביות...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

רקמות המורכבות של מערכות רב-תאיים לבלבל את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים החילוץ והתנהגויות הסלולר הפרט. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון את הקשר הישיר בין הרמזים תלויי הקשר וצירי החלוקה באמצעות שימוש בשיטת C. אלגיה העובר בלסטומרים וחרוזי פוליסטירן מוקצף.

בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

קומפלקס רקמות רב-תאיות, פרוטוקול זה מחדש את ההתנהגות התאית בצורה פשוטה יותר. דבר אחד הוא טכניקה זו כדי ללמוד את היחסים הישירים בין פרוטונים מוליכים הסלולר תגובה הסלולר. פרוטוקול זה משתמש ב-polystyrene פונקציונלי מבחינה כימית כדי ליצור מחדש את הפרוטונים של מוליכים תאיים.ניתן לחתוך את חרוזים עם כל פרוטונים של עניין, כדי לבדוק את ההשפעות שלהם על התגובה התאית. השתמשנו בשיטה זו באלגנטיות C על עוברי עכבר. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות זקוף למחקרים של אורגניזמים רחבים.כמו עוברים שבירים לאחר טיפול כלוריט מלא גבוה, תרגול משמעותי נדרש לפני אחד יכול לבודד בהצלחה blastomere. הדגמה חזותית תספק הבנה טובה יותר של האופן שבו יש לטפל נימי במהלך שיטות בידוד blastomere. כדי להתחיל, לשקול 10 מיליגרם של בחנורי פוליסטירן שונה קרבוקסילאט בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.הוסף מיליליטר אחד של חיץ MES לתוך הצינור כדי לשטוף. מערבולת הצינור לערבב את חרוזים. לסובב את הצינור במשך 60 שניות ב 2000XG באמצעות צנטריפוגה ספסל העליון.תכסה את העל-טבעי על-ידי צבת בזהירות את המאגר. לשטוף את חרוזים שוב עם מיליליטר אחד של חיץ MES. לאחר הכביסה, להוסיף מיליליטר אחד של חיץ MES המכיל 10 מילי גרם של EDAC לתוך הצינור, כדי להפעיל את קבוצות קרבוקסיל פני השטח.מערבולת הצינור לערבב את חרוזים. לסובב ולהדרור את הצינור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לסובב את חרוזים במשך 60 שניות ב 2000XG.השלך את העל-טבעי על-ידי פיתוק זהיר של המאגר, ושטף במיליליטר אחד של PBS. Vortex הצינור לערבב את חרוזים ולחזור לשטוף PBS עוד פעם אחת. הכן מיליליטר אחד של אחד, 10, 100, וסדרת דילול של אלף של רודמין אדום-X מתסכול המניות 0.65 מיליליטר רודמין אדום-X.פיפטה 20 מיקרו ליטרים של חרוזים לתוך כל צינור דילול סדרתי. לסובב ולהדרור את הצינורות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את חרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS.לאחר הכביסה, מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לתוך הצינורות ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס עד שישה שבועות. בדוק את עוצמת הפלואורסצנטיות של חרוזים תחת מיקרוסקופ המשמש להדמיה חיה. החזק כל קצה של מיקרו נימי בקיבולת של 10 מיקרו ליטר עם יד ימין ושמאל.משוך את המיקרו נימי לכיוון שני הקצוות כדי להחיל מתח ולהביא את מרכז נימי מעל צורב לעשות שני נימים שנמשכו ביד. מתחת למיקרוסקופ החותך, חותכים את קצות נימי היד עם מלקחיים. הפוך את שני גדלי פתיחת קצה בערך פעמיים, וגם פעם אחת את אורך הגישה הקצרה של עוברי C-אלגנטיות להעברת העובר והסרת קליפת הביצה בהתאמה.חבר את נימי משך לתוך מנגנון פיפסטינג הפה. פיפטה 45 מיקרו ליטרים של תותב מלחי ביצים על באר של מגלשה מרובת היטב. מניחים 5 עד 10 בוגרים C-אלגנטיות על הטוב.כדי להשיג C-אלגנטיות מוקדמת עוברים לחתוך מבוגרים לחתיכות על ידי מיקום שני מחטים מימין ומשמאל של הגוף של C-Elegance, ו מחליק את המחטים על פני אחד את השני. פיפטה 45 מיקרו ליטרים של פתרון hypochlorite על באר ליד פתרון מלח ביצה המכיל היטב פיפטה 45 מיקרו ליטר של מדיום הצמיחה של שלטון על שלוש הבארות הבאות. להעביר שלב תא אחד ועוברים בשלב שני תאים מוקדם לתוך פתרון hypochlorite על ידי פיפטה הפה עם פתח בגודל גדול יותר ולחכות 40 עד 55 שניות.לשטוף את העוברים על ידי העברתם לתוך שלוש הבאר עם מדיום הצמיחה של שלטון. עם 1-2 שניות בכל אחת משתי בארות הראשונות. באמצעות נימי מצויר ביד עם פתח בגודל קטן יותר בזהירות לחזור pippetting העובר להסרת קליפת ביצים.לאחר מכן, פיפטה רציפה עם נימי מצויר ביד כדי להפריד את בלאסטרים עובריים שלב שני תאים. לאחר הסרת קליפת הביצה, למזער את הכוח pippetting העוברים למעלה ולמטה כדי למנוע פרץ. הכינו תא הדמיה על ידי הנחת כיסוי על מחזיק כיסוי וקלטו את קצות הכיסוי כדי לייצב אותו.הפוך את מחזיק המכסה, וצייר עיגול על המכסה בעט הידרופובי. הוסף את מדיום הצמיחה של שלטון בתוך המעגל שצויר על ידי הסמן ההידרופובי, והעבר את הבליסומר המבודד לתא ההדמיה בתוך המעגל. עכשיו, לוותר על נפח קטן של חרוזים פונקציונליים כימית על לוח המכסה באמצעות נימי מצויר ביד עם הפתח הגדול יותר.לשלוט על המיקום של חרוזים על ידי נושבת לתוך נימי מצויר ביד עד חרוזים לצרף blastomere מבודד. הר את הכיסוי כדי למנוע אידוי של מדיום ולבצע הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ הפוך. במחקר זה, אות פלואורסצנט מן החרוז שטופלו 0.005 מיקרו גרם למילי ליטר רודאמין אדום X Succinimidyl אסתר עבור הזן מהונדס המבטא GFP miosin-2 ו M-cherihistone היה חלש מדי.מצד שני, אות הפלואורסצנט מהחרוזים שטופלו בחמישה מיקרו-גרם למיליליטר רודאמין רד-אקס סוצימיליל אסתר היה חזק מדי. הריכוז של רודאמין אדום X Succinimidyl אסתר ב 0.5 מיקרו גרם למילי ליטר היה אופטימלי עבור זן מהונדס מסוים זה. במהלך ההדמיה החיה זוהה מישור שבו שני centrosomes היו מיושרים אנכית.המטוס עם זווית פלוס או מינוס 90 מעלות של המטוס הזה הוא מישור ציר. הזווית של כיוון ציר יחסית לממשק מגע תא / חרוז לאחר cytokinesis מראה כי שני תאי הבת היו מחוברים חרוז בשורה העוברת שני המראות מגע שימש ככיוון מגע. צריך ללמוד כיצד עוברים וקליפת ביצים מגיבים לכוחות חיצוניים מסוימים המיושמים על ידי פיפט הפה.תיאורטית, כל תגובה תאית ניתן ללמוד, למשל, מפרט גופרית ניתן ללמוד על ידי culturing תאים ומגע עם חרוזים דבק על פני מונחים ארוכים יותר. טכניקה זו שימשה להבנת מנגנון כיוון חלוקת תאים תלויי מגע. מסנן PTF שימש כדי למנוע שאיפה של אדים של פתרון hypochlorite באמצעות פיפטה הפה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ&#39;יק

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...