Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

우리는 조언과 C. elegans 균주, 돈 모어만, 코타 미즈모토, 생명 과학 연구소 이미징 코어 시설 공유 장비 및 시약, 아오이 히로야수, 리사 페르난도, 김민지 의 유지 보수에 대한 우리의 원고의 유지 보수에 대한 조언과 제공 에 대한 제임스 프리스와 브루스 Bowerman 감사합니다. 우리의 작업은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에 의해 지원됩니다 (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

1. 접착제 폴리스티렌 비드의 준비
참고:이 프로토콜은 무균 기술이 필요하지 않습니다.
<ol><li>1.5 mL 미세 원심 분리튜브에 카르복실레이트 변형 폴리스티렌 구슬 10 mg의 무게.</li>
	<li>구슬을 세척하려면 튜브에 2-(N-morpholino) 에탄설포닉산(MES) 완충제 1mL를 추가합니다. MES 완충제는 인산염 및 아세테이트를 포함하지 않기 때문에, 이는 탄수화물의 반응성을 감소시킬 수 있고, ?...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+pharynx:+a+model+for+organogenesis.">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li><li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+intestine.">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Edgar, L. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+eggshell.">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li><li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines,+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests.">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li><li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

단순화된 세포 접촉 패턴의 재구성은 연구원이 형태 형성의 다른 양상에 있는 특정 세포 접촉 패턴의 역할을 시험하는 것을 시킬 것입니다. 우리는 세포 분열 축이 접착제 비드(10)와의물리적 접촉에 의해 제어된다는 것을 보여주기 위해이 기술을 사용했다. 분할축 명세서는형태형성14, 줄기세포분열15,16,조직항상성15...

다세포 발달 도중, 개별 적인 세포의 세포 행동 (예를 들면, 분할 축)는 각종 화학적 및 물리적 단서에 의해 지정됩니다. 개별 세포가 이 정보를 해석하는 방법, 그리고 다세포 어셈블리를 응급 재산으로 조절하는 방법을 이해하는 것은 형태 형성 연구의 궁극적인 목표 중 하나입니다. 모델 유기체 C. elegans는 세포 극성1,세포 분열 패턴1,세포 운명 결정2,신경 배선3 및 유기발생과같은 조직 규모 규정과 같은 형태 형성의 세포 수준 조절에 크게 기여하고 있다4,5. 다양한 유전 적 도구가 있지만 조직 공학 방법은 제한적입니다.
C. elegans 연구에서 가장 성공적인 조직 공학 방법은 고전적인 blastomere 격리6; C. 예쁜꼬마조충태아는 달걀 껍질과 투과성 장벽7에둘러싸여 있기 때문에 제거는이 방법의 주요 절차 중 하나입니다. 이 blastomere 절연 방법은 단순화 된 방식으로 세포 세포 접촉의 재구성을 가능하게하지만, 원치 않는 큐의 제거를 허용하지 않습니다; 세포 접촉은 여전히 기계적(예: 접착) 및 화학 적 단서를 모두 발생시켜 큐와 세포 행동 사이의 인과 관계를 완전히 분석하는 능력을 제한합니다.
이 백서에 제시된 방법은 리간드로 단백질을 포함하여 어떤 아민 반응성 분자든지에 공유하게 묶을 수 있는 carboxylate 수정된 폴리스티렌 구슬을 이용합니다. 특히, 우리는 구슬을 시각적으로 추적 할 수 있고 세포에 접착제로 만들기 위해 리간드로 로다민 레드-X의 아민 반응성 형태를 사용했습니다. 리간드 분자의 비드 표면 및 1차 아민 기의 카르복실 기는 수용성 카르보디미드 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카르보디미드(EDAC)8,9에의해 결합된다. 얻어진 접착제 비드는 세포역학(10)에기계적 큐의 효과를 허용한다. 우리는 세포 분열 방향10에필요한 기계적 단서를 식별하기 위해이 기술을 사용했다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

다세포 시스템에서, 개별 세포는 인접한 세포 및 환경에서 오는 각종 물리적 및 화학적인 단서에 의해 포위됩니다. 이 조직 복잡성은 외인성 단서와 세포 역학 사이 인과 링크의 확인을 혼동합니다. 종합적으로 재구성된 다세포 시스템은 연구원이 다른 사람을 제거하는 동안 특정 단서를 테스트할 수 있게 함으로써 이 문제를 극복합니다. 여기서, 우리는 분리 된 예쁜 꼬마염 블래스토미어 및 접착 성 폴리스티렌 구슬로 세포 접촉 패턴을 재구성하는 방법을 제시합니다. 절차는 계란 껍질 제거, 세포 세포 접착을 방해하여 blastomere 격리, 접착성 폴리스티렌 구슬의 준비, 세포 세포 또는 세포 비드 접촉의 재구성을 포함합니다. 마지막으로, 우리는 배아 개발에서 공간 세포 패터닝 및 세포 운명 사양의 조절에 기여하는 세포 분열 축의 방향을 조사하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 제시한다. 이 견고하고 재현 가능하며 다재다능한 체외 식 방법을 통해 공간 세포 접촉 패턴과 세포 반응 사이의 직접적인 관계를 연구할 수 있습니다.

구슬 제제를 위해, GFP-미오신 II 및 mCherry-histone을 발현하는 형질전환 균주에 대한 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 최적 양을 결정하였다(도1A-D). 우리는 세포 주기 진행의 마커로 mCherry 태그 히스톤을 사용. 로다민 레드-X와 mCherry 모두 561 nm 레이저로 조명되기 때문에 로다민 레드-X 신호의 최적 강도는 세포와 비드의 동시 이미징을 허용하는 히스톤의 강도?...

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In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

다세포 시스템의 조직 복잡성은 세포 외 단서와 개별 적인 세포 행동 사이 인과 관계의 확인을 혼동. 여기에서, 우리는 C. elegans 배아 블라스토미어와 접착성 폴리스티렌 구슬을 사용하여 접촉 의존적 큐와 분할 축 사이의 직접적인 링크를 연구하는 방법을 제시한다.

분리 된 예쁜 꼬마 염 철충 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

다세포 조직은 복잡하며,이 프로토콜은 단순화 된 방식으로 세포 전이를 재구성합니다. 한 가지는 세포 도체 양성자와 세포 반응 사이의 직접적인 관계를 연구하는이 기술입니다. 이 프로토콜은 화학적으로 기능적인 폴리스티렌 구슬을 사용하여 세포 도체 양성자를 재구성합니다.구슬은 관심있는 양성자와 함께 절단 할 수 있습니다, 세포 반응에 미치는 영향을 테스트하기 위해. 우리는 마우스 배아에 C-엘레강스에서이 방법을 사용했다. 따라서,이 프로토콜은 넓은 유기체의 연구에 똑바로 할 수있다.배아는 높은 전체 염소 처리 후에 깨지기 때문에, 1개의 성공적으로 blastomere를 격리할 수 있기 전에 중요한 사례가 필요합니다. 시각적 데모는 blastomere 격리 방법 중에 모세관을 처리하는 방법에 대한 더 큰 이해를 제공합니다. 시작하려면 1.5 밀리 리터 마이크로 원심 분리기 튜브에서 10 밀리 그램의 카복실레이트 변형 폴리스티렌 구슬의 무게를 측정합니다.MES 버퍼 1밀리리터를 튜브에 추가하여 세척합니다. 튜브를 소용돌이로 사용하여 구슬을 섞습니다. 벤치 탑 원심분리기를 통해 2000XG에서 60초 동안 튜브를 회전시합니다.버퍼를 조심스럽게 피펫으로 전환하여 상신을 디카드합니다. MES 버퍼 1밀리리터로 구슬을 다시 씻으십시오. 세척 후, 튜브에 EDAC 10 밀리그램을 포함하는 MES 버퍼 1밀리리터를 추가하여 표면 카복실 그룹을 활성화합니다.튜브를 소용돌이로 사용하여 구슬을 섞습니다. 실온에서 15분 동안 튜브를 회전하고 배양합니다. 2000XG에서 60초 동안 구슬을 회전시합니다.버퍼를 조심스럽게 꺼내서 상체를 버리고 PBS 1밀리리터로 세척합니다. 튜브를 소용돌이하여 구슬을 혼합하고 PBS 세척을 한 번 더 반복합니다. 0.65 밀리 리터 로다민 레드-X 스톡 솔루션에서 1밀리리터 10, 100, 100, 1,000배의 로다민 레드-X 희석 시리즈를 준비합니다.Pippette 20 마이크로 리터의 구슬은 각 시리얼 희석 튜브에 넣습니다. 실온에서 5분 동안 튜브를 회전하고 배양합니다. PBS 1밀리리터로 구슬을 두 번 씻으시면 됩니다.세척 후, 튜브에 PBS의 1 밀리 리터를 추가하고 최대 6 주 동안 섭씨 4도에 저장합니다. 라이브 이미징에 사용되는 현미경으로 구슬의 형광 강도를 확인하십시오. 오른손과 왼손으로 10 마이크로 리터의 용량으로 마이크로 모세관의 각 끝을 잡으라.미세 모세관을 양쪽 끝으로 당겨 긴장을 가하고 모세관 의 중심을 버너 위로 가져와 손으로 당겨진 두 개의 모세 혈관을 만듭니다. 해부 현미경에서, 집게와 손으로 뽑아 모세 혈관의 끝을 손질. 두 팁 개구부 크기를 약 2배, 배아 전이 및 달걀 껍질 제거를 위한 C-Elegance 배아의 짧은 접근 길이의 1배를 확인합니다.끌어온 모세관을 입에 넣는 장치에 부착합니다. 핍펫 45 마이크로 리터의 달걀 소금 용액이 다중 웰 슬라이드의 우물에 들어있습니다. 5~10명의 성인 C-엘레강스를 우물에 놓습니다.초기 C-엘레강스 배아를 얻으려면 C-Elegance의 몸의 오른쪽과 왼쪽에 두 개의 바늘을 배치하고 바늘을 서로 미끄러지게하여 성인을 조각으로 잘라냅니다. Pippette 45 마이크로 리터의 저혈당 용액은 계란 소금 용액을 함유하고 있으며, 쉘튼의 성장 매체의 45 마이크로 리터를 다음 세 개의 우물에 잘 함유하고 있습니다. 1개의 세포 단계 및 초기 2개의 세포 단계 배아를 더 큰 크기의 개구로 입 핍펫에 의하여 hypochlorite 용액으로 옮기고 40 55 초 동안 기다립니다.셸튼의 성장 매체와 함께 다음 세 개의 우물로 배아를 전송하여 배아를 씻어. 처음 두 개의 우물 각각에 1 ~ 2 초. 손으로 그린 모세관을 사용하여 작은 크기의 개구부를 사용하여 달걀 껍질 제거를 위해 배아를 조심스럽게 반복합니다.그 후, 2세포 단계 배아 발파소를 분리하기 위해 손으로 그린 모세관을 지속적으로 배피한다. 달걀 껍질 제거 후, 파열을 방지하기 위해 배아를 위아래로 핍펫에 힘을 최소화. 커버슬립 홀더에 커버슬립을 배치하여 이미징 챔버를 준비하고 커버슬립의 가장자리를 테이프로 사용하여 염색합니다.커버슬립 홀더를 뒤집어 소수성 펜으로 커버슬립에 원을 그립니다. 소수성 마커에 의해 그려진 원 내에서 쉘튼의 성장 매체를 추가하고, 원 내의 이미징 챔버에 격리 된 blastomere를 전송합니다. 이제, 더 큰 개구부와 손으로 그린 모세관을 사용하여 커버 슬립에 화학적으로 기능화 된 구슬의 작은 볼륨을 분배.구슬이 분리된 blastomere에 부착될 때까지 손으로 그린 모세관으로 불어서 구슬의 위치를 제어합니다. 중간 의 증발을 피하기 위해 커버 슬립을 마운트하고 반전 된 현미경을 사용하여 라이브 이미징을 수행합니다. 이 연구에서는, GFP miosin-2및 M-cherihistone을 표현하는 형질 균주에 대한 밀리 리터 로다민 레드-X Succinimidyl 에스테르 당 0.005 마이크로 그램으로 처리 된 비드에서 형광 신호는 너무 약했다.다른 한편으로는, 밀리 리터 로다민 레드-X Succinimidyl 에스테르 당 5 마이크로 그램으로 처리 된 구슬에서 형광 신호는 너무 강했다. 로다민 레드-X 수치니미딜 에스테르의 농도는 밀리 리터당 0.5 마이크로 그램으로 이 특정 형질 변형에 최적이었습니다. 라이브 이미징 중에 두 개의 중등골이 수직으로 정렬된 비행기가 확인되었습니다.이 비행기의 플러스 또는 마이너스 90도 각도를 가진 비행기는 스핀들 평면입니다. 사이토카네시스 후 세포/비드 접촉 인터페이스에 대한 스핀들 방향의 각도는 두 딸 세포가 두 접촉 시야를 통과하는 선에서 비드에 부착되어 접촉 방향으로 사용되었다는 것을 보여준다. 하나는 배아와 계란 껍질이 입 핍펫에 의해 적용 된 특정 외부 힘에 반응하는 방법을 배울 필요가있다.이론적으로, 모든 세포 반응은 연구될 수 있고, 예를 들어, 황산염 사양은 세포를 배양하고 더 긴 조건에 걸쳐 접착제 구슬과의 접촉에 의해 연구될 수 있다. 이 기술은 접촉 종속 세포 분열 방향 메커니즘을 이해하는 데 사용되었습니다. PTF 필터는 입 핍펫을 통해 하이포염소염 용액의 흡입을 방지하기 위해 사용되었다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

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선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

연구

발생학

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

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활성 ERK의 공간 및 시간 분석<em&gt; C. 엘레</em&gt; 생식선

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

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생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

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신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

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라이브 창 꼬마 선 충 에 Lysosomal Alkalinization 평가

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

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초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...