Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

Vi takker James Priess og Bruce Bowerman for råd og gi C. elegans stammer, Don Moerman, Kota Mizumoto, og Life Sciences Institute Imaging Core Facility for deling av utstyr og reagenser, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, min JEE Kim for vedlikehold av C. elegans og kritisk lesning av manuskriptet vårt. Vårt arbeid er støttet av naturvitenskap og engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

1. utarbeidelse av selvklebende polystyren perle
Merk: denne protokollen krever ikke aseptisk teknikk.
<ol><li>Veie 10 mg carboxylat modifiserte polystyren perler i en 1,5 mL mikrosentrifugen tube.</li>
	<li>For å vaske perlene, tilsett 1 mL 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer inn i røret. Siden MES buffer ikke inneholder fosfat og acetate, som kan redusere reaktivitet av carbodiimide, er det egnet til bruk i protein kopling reaksjon. Vortex røret for å blande perlene.</li>...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+pharynx:+a+model+for+organogenesis.">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li><li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+intestine.">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Manipulation+of+Embryonic+Cells.">Culture and Manipulation of Embryonic Cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li><li>Stein, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+eggshell.">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li><li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines,+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests.">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li><li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tyrosine+aminotransferase+by+affinity+chromatography.">Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).</li><li>Sugioka, K., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+contact+cues+specify+cell+division+orientation+by+directing+cortical+myosin+flows.">Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows.</a> Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).</li><li>Park, F. D., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

Rekonstituering av forenklet celle kontakt mønstre vil la forskere til å teste rollene til spesifikke celle kontakt mønstre i ulike aspekter av morphogenesis. Vi har brukt denne teknikken til å vise at celledeling aksen styres av den fysiske kontakten med selvklebende perler10. Som Division Axis spesifikasjonen er avgjørende for flercellede utvikling ved å bidra tilmorphogenesis 14, stilk cellendivisjon 15,16,...

Under flercellede utvikling, mobilnettet atferd (f. eks divisjon akse) av individuelle celler er spesifisert av ulike kjemiske og fysiske signaler. For å forstå hvordan enkelte celle tolker denne informasjonen, og hvordan de regulerer flercellede forsamlingen som en emergent eiendom er et av de ultimate målene for morphogenesis studier. Modellen organisme C. elegans har bidratt betydelig til forståelsen av celle-nivåregulering av morphogenesis som celle polaritet1, celle divisjon mønster1, celle skjebne beslutning2, og vevs-skala forskrifter som neuronal kabling3 og organogenesen4,5. Selv om det finnes ulike genetiske verktøy tilgjengelig, vev engineering metoder er begrenset.
Den mest vellykkede vev engineering metode i C. elegans studien er den klassiske blastomere isolasjon6; som C. elegans embryo er omgitt av en eggeskall og en permeabilitet barriere7, er deres fjerning en av de viktigste prosedyrene for denne metoden. Selv om denne blastomere isolasjons metoden muliggjør rekonstituering av celle celle kontakt på en forenklet måte, tillater den ikke eliminering av uønskede stikkord. celle kontakt fortsatt utgjør både mekanisk (for eksempel vedheft) og kjemiske signaler, og dermed begrense vår evne til å fullt ut analysere årsakssammenheng forholdet mellom stikkordet og cellulære atferd.
Metoden som presenteres i denne utredningen bruker carboxylat modifiserte polystyren perler som kan covalently binde til noen Amin-reaktive molekyler inkludert proteiner som ligander. Spesielt brukte vi en Amin-reaktiv form av Rhodamine Red-X som en ligand å lage perler både visuelt sporbar og lim til cellen. Den kar bok syl grupper av perle overflaten og primære Amin grupper av ligand molekyl er ledsaget av vannløselige carbodiimide 1-etanol-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Innhentet selvklebende perler tillate virkningene av den mekaniske stikkordet på mobilnettet dynamikk10. Vi har brukt denne teknikken for å identifisere mekaniske signaler som kreves for celledeling orientering10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

I flercellede systemer, individuelle celler er omgitt av ulike fysiske og kjemiske signaler som kommer fra naboceller og miljø. Dette vevet kompleksitet forundrer identifisering av årsakssammenheng mellom ytre signaler og cellulær dynamikk. En syntetisk rekonstituert flercellede system overvinner dette problemet ved å la forskere til å teste for en bestemt stikkordet mens eliminere andre. Her presenterer vi en metode for å Rekonstituer celle kontakt mønstre med isolerte Caenorhabditis elegans blastomere og selvklebende polystyren perler. Prosedyrene innebærer eggeskall fjerning, blastomere isolasjon ved å forstyrre celle-celle vedheft, utarbeidelse av selvklebende polystyren perler, og rekonstituering av celle-celle eller celle-perle kontakt. Til slutt presenterer vi anvendelsen av denne metoden for å undersøke orienteringen av mobilnettet divisjon akser som bidrar til regulering av romlige cellulære mønstre og celle skjebne spesifikasjon i å utvikle embryo. Denne robuste, reproduserbar og allsidig in vitro-metoden gjør det mulig å studere direkte relasjoner mellom kontakt mønstre for romlige celler og cellulære svar.

For fremstilling av perler, bestemte vi den optimale mengden av Rhodamine Red-X succinimidyl Ester for transgene-belastningen som uttrykker GFP-myosin II og mCherry-histone (figur 1A-D). Vi brukte mCherry tagget histone som en markør for celle syklus progresjon. Fordi både Rhodamine Red-X og mCherry vil bli opplyst av en 561 NM laser, den optimale intensiteten av Rhodamine Red-X signal er sammenlignbare med histone å tillate samtidig Imaging av celle og perle. For eksempe...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue kompleksiteten i flercellede systemer forvirre identifisering av årsakssammenheng mellom ekstracellulære signaler og individuell mobilnettet atferd. Her presenterer vi en metode for å studere direkte kobling mellom kontakt-avhengige signaler og divisjon akser ved hjelp av C. elegans embryo blastomeres og selvklebende polystyren perler.

In vitro-rekonstituering av romlig celle kontakt mønstre med isolert Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres og selvklebende polystyren perler

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Multicellulær vev kompleks, denne protokollen rekonstituerer cellulær oppførsel på en forenklet måte. En ting er denne teknikken for å studere de direkte relasjonene mellom cellulære dirigentprotoner og cellulær respons. Denne protokollen bruker kjemisk funksjonelle polystyrenperler for å rekonstituere cellulære lederprotoner.Perlene kan kuttes med noen protoner av interesse, for å teste deres effekter på cellulær respons. Vi har brukt denne metoden i C-Elegance på museembryoer. Derfor kan denne protokollen være oppreist til studier av brede organismer.Som embryoer er skjøre etter høy full klorittbehandling, er det nødvendig med betydelig praksis før man kan isolere blastomere. Visuell demonstrasjon vil gi en større forståelse av hvordan man skal håndtere kapillær under blastomere-isolasjonsmetoder. Til å begynne, veie 10 milli-gram karboksylat modifisertpolystyren perler i en 1,5 milli-liters mikro sentrifuge rør.Tilsett en milli-liter MES-buffer i røret for å vaske. Vortex røret for å blande perlene. Spinn røret i 60 sekunder ved 2000XG via benkeplate sentrifuge.Dicard supernatant ved å forsiktig pipettering ut bufferen. Vask perlene igjen med en milli-liter MES buffer. Etter vasken, tilsett en milli-liter MES buffer som inneholder 10 milli-gram EDAC i røret, for å aktivere overflaten karboksylgrupper.Vortex røret for å blande perlene. Roter og inkuber røret i 15 minutter ved romtemperatur. Spinn ned perlene i 60 sekunder ved 2000XG.Kast det overnaturlige ved å forsiktig røre ut bufferen, og vask med en milli liter PBS. Vortex røret for å blande perlene og gjenta PBS vask en gang til. Forbered en milli-liters av en, 10, 100 og tusenfolds fortynningsserie av Rhodamine Red-X fra 0,65 milli-liters Rhodamine Red-X lagerløsning.Pippette 20 mikro-liter perler i hvert seriell fortynningsrør. Roter og inkuber rørene i fem minutter ved romtemperatur. Vask perlene to ganger med en milli-liter PBS.Etter vask, legg til en milli-liter PBS i rørene og lagre dem på fire grader Celsius i opptil seks uker. Kontroller fluorescensintensiteten til perlene under et mikroskop som brukes til levende bildebehandling. Hold hver ende av en mikrokapillær med en kapasitet på 10 mikro-liter med høyre og venstre hånd.Trekk mikrokapileringen mot begge ender for å påføre spenning og bringe midten av kapillæren over en brenner for å lage to håndtrekkede kapillærer. Under disseksjonsmikroskopet trimmer du tuppene på de håndtrekkede kapillærene med tang. Gjør de to tipsåpningsstørrelsene omtrent to ganger, og en ganger den korte tilgangslengden til C-Elegance Embryos for henholdsvis embryooverføring og eggeskallfjerning.Fest den trukket kapillæren i et munnrørt apparat. Pippette 45 mikro-liter egg-salter løsning på en brønn av en multi-welled lysbilde. Plasser fem til 10 voksne C-Elegance på brønnen.For å oppnå tidlige C-Elegance Embryos kutte voksne i stykker ved å plassere to nåler til høyre og venstre for C-Elegance kropp, og skyve nålene forbi hverandre. Pippette 45 mikro-liters hypoklorittløsning på en brønn ved siden av brønnen som inneholder egg-saltløsning og pippette 45 mikro-liters Sheltons vekstmedium på de påfølgende tre brønnene. Overfør ett cellestadium og tidlige to celletrinnembryoer til hypoklorittløsningen ved munn pippette med større størrelse åpning og vent i 40 til 55 sekunder.Vask embryoene ved å overføre dem til de neste tre brønnene med Sheltons vekstmedium. Med ett til to sekunder i hver av de to første brønnene. Bruk håndtegnet kapillær med den mindre åpningen gjentar forsiktig pippetting embryoet for eggeskallfjerning.Deretter, kontinuerlig pippette med håndtegnet kapillær for å skille to-celle stadium embryonale blastomers. Etter fjerning av eggeskall, minimer kraften i pippetting embryoene opp og ned for å forhindre utbrudd. Forbered et bildekammer ved å plassere en dekkslipp på en dekkslipsholder og tape kantene på dekkslippen for å stabalisere den.Snu dekkslipholderen, og tegn en sirkel på dekkslippen med en hydrofob penn. Legg til Sheltons vekstmedium i sirkelen tegnet av den hydrofobe markøren, og overfør den isolerte blastomen til bildekammeret i sirkelen. Nå dispenserer du et lite volum av de kjemisk funksjonaliserte perlene på dekkslippen ved hjelp av håndtegnet kapillær med den større åpningen.Kontroller posisjonen til perlene ved å blåse inn i den håndtegnede kapillæren til perlene festes til den isolerte blastomen. Monter dekkglasset for å unngå fordampning av medium og utfør levende bildebehandling ved hjelp av et invertert mikroskop. I denne studien var det fluorescerende signalet fra perlen behandlet med 0,005 mikrogram per milli-liters Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester for den transgene belastningen som uttrykker GFP miosin-2 og M-cherihistone for svak.På den annen side var det fluorescerende signalet fra perlene behandlet med fem mikro-gram per milli-liters Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester for sterk. Konsentrasjonen av Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester på 0,5 mikro-gram per milli-liter var optimal for denne spesielle transgene belastningen. Under den levende bildebehandling et fly ble identifisert hvor to centrosomes var vertikalt justert.Flyet med pluss eller minus 90 graders vinkel på dette flyet er spindelplan. Vinkelen på spindelorientering i forhold til celle / perle kontakt grensesnitt etter cytokinesis viser at begge datterceller var festet til perlen i en linje som passerer begge kontaktsikter ble brukt som en kontaktorientering. Man trenger å lære hvordan embryoer og eggeskall reagerer på visse ytre krefter påført av munnen pippette.Teoretisk sett kan enhver cellulær respons studeres, for eksempel kan sulfatspesifikasjon studeres ved å kultere celler og kontakt med selvklebende perler over lengre sikt. Denne teknikken har blitt brukt til å forstå kontaktavhengig celledelingsorienteringsmekanisme. PTF filter ble brukt til å forhindre innånding av røyk av hypoklorittoppløsning via munn pippette.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Helhetlig vurdering av kimbane Chemical Toxicity Bruke Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Bruk av Ugjennomtrengelige Barrierer Kombinert med Kandidat Factor Soaked perler å studere Induksjon Signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Romlig og tidsmessig analyse av Active ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; kimcellelinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrking for Live-celle Imaging av zygoten polarisering og Embryo mønstre Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM og Microrheology i sebrafisk Embryo eggeplomme cellen

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans å analysere intracellulær Transport i nerveceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Vurdere lysosomale Alkalinization i tarmen Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Prøvende celle mekanikk med perle-fri optisk pinsett i Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...