Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

Мы благодарим Джеймса Присса и Брюса Бауэрмана за советы и предоставление штаммов C. elegans, Дона Мормана, Кота Мизумото и Института биологических наук Imaging Core Facility для совместного использования оборудования и реагентов, Аои Хироясу, Лизы Фернандо, Мина Джи Кима за содержание C. elegans и критическое чтение нашей рукописи. Наша работа поддерживается Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

1. Приготовление клейкой полистирора
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не требует асептической техники.
<ol><li>Взвесьте 10 мг карбоксилата модифицированных полистирола в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки.</li>
	<li>Для мытья бисера добавьте 1 мл 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) ...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+pharynx:+a+model+for+organogenesis.">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li><li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+intestine.">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Manipulation+of+Embryonic+Cells.">Culture and Manipulation of Embryonic Cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li><li>Stein, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+eggshell.">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li><li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines,+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests.">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li><li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tyrosine+aminotransferase+by+affinity+chromatography.">Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).</li><li>Sugioka, K., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+contact+cues+specify+cell+division+orientation+by+directing+cortical+myosin+flows.">Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows.</a> Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).</li><li>Park, F. D., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

Восстановление упрощенных моделей контакта клеток позволит исследователям проверить роли конкретных моделей контакта клеток в различных аспектах морфогенеза. Мы использовали этот метод, чтобы показать, что ось деления клеток контролируется физическим контактом с клеевыми шариками<...

Во время многоклеточного развития клеточное поведение (например, ось деления) отдельных клеток определяется различными химическими и физическими сигналами. Чтобы понять, как отдельные клетки интерпретирует эту информацию, и как они регулируют многоклеточной сборки как возникающие свойства является одной из конечных целей морфогенеза исследований. Модель организма C. elegans внесла значительный вклад в понимание клеточного уровня регулирования морфогенеза, таких как клеточная полярность1, клеточное деление узор1, решение судьбы клеток2, и ткани масштаба правил, таких как нейрональная проводка3 и органогенез4,5. Хотя существуют различные генетические инструменты, методы тканевой инженерии ограничены.
Наиболее успешным методом тканевой инженерии в исследовании C. elegans является классическая лапомерная изоляция6; так как эмбрион C. elegans окружен яичной скорлупой и барьером проницаемости7,их удаление является одной из основных процедур этого метода. Хотя этот метод изоляции бластомеров позволяет восстановить контакт клеток в упрощенном порядке, он не позволяет устранить нежелательные сигналы; контакт клеток по-прежнему представляет собой как механические (например, сливки), так и химические сигналы, тем самым ограничивая нашу способность полностью анализировать причинно-следственную связь между кием и клеточным поведением.
Метод, представленный в этой работе, использует карбоксилат модифицированные полистиролные бусы, которые могут ковалентно связываться с любыми амино-реактивными молекулами, включая белки в виде лигандов. В частности, мы использовали амин-реактивную форму родамин Red-X в качестве лигана, чтобы сделать бисер как визуально отслеживаемый и клей к клетке. Карбоксильные группы поверхности бисера и первичные группы амина молекулы лиганд соединены водорастворимым карбодиамидом 1-этил-3-(диметиламинопропил) карбодиамидом (EDAC)8,9. Полученные клеевые бусы позволяют эффекты механического сигнала на клеточной динамике10. Мы использовали этот метод для определения механических сигналов, необходимых для ориентации деления клеток10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

В многоклеточных системах отдельные клетки окружены различными физическими и химическими сигналами, поступающими из соседних клеток и окружающей среды. Эта сложность тканей смужает выявление причинно-следственной связи между наличностью и клеточной динамикой. Синтетически восстановленная многоклеточная система преодолевает эту проблему, позволяя исследователям тестировать на определенный сигнал, устраняя при этом других. Здесь мы представляем метод восстановления клеточных контактных моделей с изолированными Caenorhabditis elegans blastomere и клеевыми бусинами из полистирола. Процедуры включают удаление яичной скорлупы, изоляцию бластомеров, нарушая сцепление клеток, приготовление клейких бусинов, и восстановление контакта клеток или клеточного бисера. Наконец, мы представляем применение этого метода для исследования ориентации клеточного деления осей, что способствует регуляции пространственного клеточного шаблона и спецификации судьбы клеток в развивающихся эмбрионах. Этот надежный, воспроизводимый и универсальный метод in vitro позволяет изучать прямые связи между структурами контакта пространственных клеток и клеточными реакциями.

Для приготовления бисера мы определили оптимальное количество родеамина Red-X succinimidyl ester для трансгенного штамма, выражающего GFP-миозин II и mCherry-histone(рисунок 1A-D). Мы использовали mCherry помечены гистон в качестве маркера прогрессии клеточного цикла. Поскольку и Рода?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Тканевые сложности многоклеточных систем смужает выявление причинно-следственной связи между внеклеточными сигналами и индивидуальным клеточным поведением. Здесь мы представляем метод изучения прямой связи между контактно-зависимыми сигналами и осями деления с помощью c. elegans эмбриона бластомеры и клея полистирола.

В Vitro Восстановление пространственных клеток Контактные шаблоны с изолированными Caenorhabditis elegans Эмбрион Blastomeres и клейкиполисполисполистирол бисер

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Многоклеточный комплекс тканей, этот протокол восстанавливает клеточное поведение в упрощенном порядке. Одна вещь этот метод для изучения прямой связи между клеточным проводником протонов и клеточной реакции. Этот протокол использует химически функциональные полистироловые бусы для восстановления протонов клеточного проводника.Шарики можно вырезать с помощью любых протонов, представляющих интерес, чтобы проверить их влияние на клеточный ответ. Мы использовали этот метод в C-Elegance на эмбрионах мыши. Таким образом, этот протокол может быть вертикально к исследованиям широких организмов.Поскольку эмбрионы являются хрупкими после высокого полного лечения хлорита, требуется значительная практика, прежде чем можно успешно изолировать бластер. Визуальная демонстрация обеспечит более глубокое понимание того, как следует обрабатывать капилляры во время бластер-изоляции методов. Для начала взвесьте 10 миллиграммов карбоксилата модифицированных полистирола в 1,5-литровой микроцентрифуге трубки.Добавьте один миллилитров буфера МЕС в трубку для мытья. Vortex трубки, чтобы смешать бисер. Спин трубки в течение 60 секунд на 2000XG через скамейку верхней центрифуги.Дикард супернатант, тщательно трубопроводов из буфера. Снова вымойте бисер одним миллилитровым буфером МЕ. После мытья добавьте в трубку один миллилитров буфера МЕС, содержащий 10 миллиграммов ЭДАК, чтобы активировать поверхностные карбоксил-группы.Vortex трубки, чтобы смешать бисер. Поверните и инкубировать трубку в течение 15 минут при комнатной температуре. Спин вниз бисера в течение 60 секунд на 2000XG.Отбросьте супернатант, тщательно pippetting из буфера, и мыть с одним милли-литровым PBS. Vortex трубки смешать бисер и повторить PBS мыть еще раз. Приготовьте один миллилитров одного, 10, 100 и одну тысячную серию разбавления родамина Red-X из 0,65 миллилитрового раствора Rhodamine Red-X.Pippette 20 микро-литров бисера в каждой серийной трубки разбавления. Поверните и инкубировать трубки в течение пяти минут при комнатной температуре. Вымойте бисер дважды с одним милли-литровым PBS.После мытья, добавить один милли-литр PBS в трубки и хранить их при четырех градусах по Цельсию на срок до шести недель. Проверьте интенсивность флуоресценции бисера под микроскопом, используемым для живой визуализации. Держите каждый конец микро-капилляра емкостью 10 микролитров правой и левой рукой.Потяните микро-капилляр к обоим концам, чтобы применить напряжение и принести центр капилляра над горелкой, чтобы сделать два ручных капилляров. Под рассечением микроскопа обрезайте кончики ручных капилляров типсами. Сделайте два кончика открытия размеров примерно в два раза, и один раз короткий доступ длины C-Elegance эмбрионов для переноса эмбриона и удаления яичной скорлупы соответственно.Прикрепите вытащил капилляр в рот-pippetting аппарата. Pippette 45 микро-литров раствора яичных солей на колодец из нескольких хорошо слайд. Поместите от 5 до 10 взрослых C-Elegance на колодец.Чтобы получить ранние C-Elegance Embryos разрезать взрослых на куски, позиционирование двух игл справа и слева от тела C-Elegance, и скольжения иглы мимо друг друга. Pippette 45 микро-литров гипохлоритового раствора на колодец рядом с колодцом, содержащим яично-солевой раствор и pippette 45 микро-литров Шелтон в рост среднего на последующие три скважины. Передача одной клеточной стадии и ранних двух клеточных эмбрионов стадии в гипохлоритный раствор рот пиппет с большим размером открытия и ждать от 40 до 55 секунд.Вымойте эмбрионы, переведя их в следующие три скважины со средним ростом Шелтона. С одной-двух секунд в каждой из первых двух скважин. Используя нарисованный вручную капилляр с меньшим размером открытия тщательно повторить pippetting эмбриона для удаления яичной скорлупы.После этого, непрерывно pippette с нарисованным вручную капилляром, чтобы отделить двухклеточную стадию эмбриональных бластомер. После удаления яичной скорлупы, свести к минимуму силу в pippetting эмбрионов вверх и вниз, чтобы предотвратить взрыв. Подготовьте камеру визуализации, поместив крышку на держатель крышки и ленты края крышки, чтобы стабилизировать его.Переверните держатель крышки и нарисуйте круг на крышке гидрофобной ручкой. Добавьте средний рост Шелтона в круг, нарисованный гидрофобным маркером, и перенесите изолированный бластер в камеру визуализации внутри круга. Теперь, обойтись небольшой объем химически функционализированных бусин на крышку с помощью ручной капилляр с большим отверстием.Контроли положение бисера, дуя в нарисованный вручную капилляр, пока бисер не прикрепится к изолированному бластеру. Намонтировать крышку, чтобы избежать испарения среды и выполнять живые изображения с помощью перевернутого микроскопа. В этом исследовании флуоресцентный сигнал от шарика, обработанного 0,005 микрограммами на миллилитровый родамин Red-X Succinimidyl Ester для трансгенного штамма, выражаюго GFP miosin-2 и M-cherihistone, был слишком слабым.С другой стороны, флуоресцентный сигнал от бисера, обработанного пятью микрограммами на миллилитровый родамин Red-X Succinimidyl Ester, был слишком сильным. Концентрация родамина Red-X Succinimidyl Ester на уровне 0,5 микрограмма на милли-литр была оптимальной для этого конкретного трансгенного штамма. Во время живого изображения была идентифицирована плоскость, где две центросомы были вертикально выровнены.Самолет с плюс-минус 90 градусов угол этого самолета шпиндель плоскости. Угол ориентации шпинделя относительно контактного интерфейса клетки/бисера после цитокинесиса показывает, что обе клетки дочери были прикреплены к бисеру в линии, которая проходит оба контактных прицела, была использована в качестве контактной ориентации. Нужно узнать, как эмбрионы и яичная скорлупа реагируют на определенные внешние силы, применяемые рот пиппет.Теоретически любой клеточный ответ можно изучать, например, спецификацию сульфата можно изучать путем культивирования клеток и контакта с клейкими бусинами в более длительные сроки. Этот метод был использован для понимания механизма ориентации деления клеток, зависящих от контакта. Фильтр PTF был использован для предотвращения вдыхания паров гипохлоритового раствора через рот пиппет.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Комплексная оценка зародышевой линии химической токсичности Использование нематоды<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Визуализация субклеточных структур в эмбрионе данио Living

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Применение непроницаемых барьеров в сочетании с Factor кандидат замачивают шариков для изучения индуктивные сигналы в Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Пространственный и временной анализ активного ERK в<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Половые

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

В пробирке Выращивания яйцеклетку для Live клеточной Imaging зигота поляризации и кучность эмбриона в проростках Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM и микрореологию в ячейке желток Zebrafish эмбриона

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Иммобилизация Caenorhabditis elegans для анализа внутриклеточного транспорта в нейроны

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Оценка лизосомальных подщелачивание в кишечнике Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Проверка ячейки механики с шарик бесплатно Оптический пинцет в зародыша дрозофилы

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...