Name: in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads
Uploaded: 2019-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

Vi tackar James Priess och Bruce Bowerman för råd och ger c. elegans stammar, Don Moerman, Kota Mizumoto, och Life Sciences Institute Imaging Core anläggning för att dela utrustning och reagenser, AOI Hiroyasu, Lisa Fernando, min JEE Kim för underhåll av c. elegans och kritisk läsning av vårt manuskript. Vårt arbete stöds av naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

1. beredning av lim polystyren pärla
Anmärkning: detta protokoll kräver inte aseptisk teknik.
<ol><li>Väg 10 mg karboxylate modifierade polystyren pärlor i en 1,5 mL microcentrifug röret.</li>
	<li>För att tvätta pärlorna, tillsätt 1 mL 2-(N-morpholino) etansulfonsyra (MES) buffert i röret. Eftersom MES buffert inte innehåller fosfat och acetat, vilket kan minska reaktiviteten av carbodiimide, det är lämpligt att använda i protein koppling reaktion. Vortex röret för att blan...

<ol>
	<li>Herman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hermaphrodite+cell-fate+specification.">Hermaphrodite cell-fate specification.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Rose, L., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+establishment,+asymmetric+division+and+segregation+of+fate+determinants+in+early+C.+elegans+embryos.">Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos.</a> WormBook. , (2014).</li><li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).</li><li>Mango, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+pharynx:+a+model+for+organogenesis.">The C. elegans pharynx: a model for organogenesis.</a> WormBook. , (2007).</li><li>McGhee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+intestine.">The C. elegans intestine.</a> WormBook. , (2007).</li><li>Edgar, L. G., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Manipulation+of+Embryonic+Cells.">Culture and Manipulation of Embryonic Cells.</a> Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).</li><li>Stein, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+eggshell.">The C. elegans eggshell.</a> WormBook. , (2018).</li><li>Quash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+of+latex+particles+with+covalently+bound+polyamines,+IgG+and+measles+agglutinins+and+their+use+in+visual+agglutination+tests.">The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests.</a> Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).</li><li>Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+tyrosine+aminotransferase+by+affinity+chromatography.">Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).</li><li>Sugioka, K., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+contact+cues+specify+cell+division+orientation+by+directing+cortical+myosin+flows.">Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows.</a> Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).</li><li>Park, F. D., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+POP-1+asymmetry+in+early+C.+elegans+embryos.">Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos.</a> Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Gillies, T. E., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Division+Orientation+in+Animals.">Cell Division Orientation in Animals.</a> Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).</li><li>Poulson, N. D., Lechler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+divisions+in+the+epidermis.">Asymmetric cell divisions in the epidermis.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).</li><li>Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cell+division:+recent+developments+and+their+implications+for+tumour+biology.">Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li><li>Dupont, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+YAP/TAZ+in+mechanotransduction.">Role of YAP/TAZ in mechanotransduction.</a> Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).</li><li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo.">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).</li><li>Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+neighbor+determination+in+the+metazoan+embryo+system.">Cell neighbor determination in the metazoan embryo system.</a> Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).</li><li>Shaya, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+area+affects+notch+signaling+and+notch-dependent+patterning.">Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning.</a> Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+single+cell+transcriptional+profiling+of+a+multicellular+organism.">Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism.</a> Science. 357 (6352), 661-667 (2017).</li><li>Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+can+function+as+positional+cues+in+establishing+cell+polarity.">Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity.</a> Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).</li><li>Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+the+C.+elegans+embryo.">Notch signaling in the C. elegans embryo.</a> WormBook. , (2005).</li><li>M&#252;ller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+cell+division+in+the+C.+elegans+embryo+is+coordinated+by+G-protein+signaling+dependent+on+the+adhesion+GPCR+LAT-1.">Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1.</a> PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).</li><li>Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+during+Caenorhabditis+elegans+embryonic+development.">Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development.</a> Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).</li><li>Habib, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+localized+Wnt+signal+orients+asymmetric+stem+cell+division+in+vitro.">A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro.</a> Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).</li></ol>

Beredning av förenklade cell kontakt mönster kommer att låta forskarna att testa rollerna för specifika cell kontakt mönster i olika aspekter av morfogenes. Vi har använt denna teknik för att visa att cell Division Axis styrs av den fysiska kontakten med självhäftande pärlor10. Som Division Axis specifikation är avgörande för multicellulära utveckling genom att bidra till morfogenes14, Stem cell Division15,1...

Under den flercelliga utvecklingen specificeras de cellulära beteendena (t. ex. divisions axeln) för enskilda celler av olika kemiska och fysiska signaler. För att förstå hur enskilda celler tolkar denna information, och hur de reglerar flercelliga sammansättningen som en framväxande egenskap är ett av de ultimata målen för morfogenes studier. Modellorganismen C. elegans har bidragit avsevärt till förståelsen av cellulära nivåreglering av morfogenes såsom cell polaritet1, celldelning mönstringen1, cell öde beslut2, och vävnad skala förordningar såsom neuronala ledningar3 och organogenes4,5. Även om det finns olika genetiska verktyg tillgängliga, vävnadstekniska metoder är begränsade.
Den mest framgångsrika vävnadstekniska metoden i C. elegans studien är den klassiska biopsi isolering6; som C. elegans embryo är omgiven av en äggskal och en permeabilitet barriär7, är deras avlägsnande en av de viktigaste förfarandena för denna metod. Denna metod för biopsi-isolering möjliggör beredning av cell cells kontakt på ett förenklat sätt, men den tillåter inte eliminering av oönskade ledtrådar. cell kontakt fortfarande utgör både mekanisk (t. ex. vidhäftning) och kemiska signaler, vilket begränsar vår förmåga att helt analysera orsakssambandet mellan Cue och cellulära beteende.
Den metod som presenteras i detta dokument använder karboxylate modifierade polystyren pärlor som kovalent binda till någon Amine-reaktiva molekyler inklusive proteiner som ligander. Speciellt använde vi en Amin-reaktiv form av Rhodamine Red-X som en ligand att göra pärlor både visuellt spårbar och lim till cellen. Karboxylgrupperna av pärlyta och primära amingrupper av ligand-molekylen är sammankopplade med vattenlösliga karbodiimidgrupp 1-etyl-3-(dimetylaminopropyl) karbodiimidgrupp (edac)8,9. Erhållna självhäftande pärlor möjliggöra effekterna av den mekaniska Cue på cellulära dynamik10. Vi har använt denna teknik för att identifiera mekaniska signaler som krävs för celldelning orientering10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1080703</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator Tube Assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>N2</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37</td>
			<td>in house</td>
			<td>KSG5</td>
			<td>Strain used in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Mircopipets, 10 &#181;L</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>21-180-13</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads (30 &#181;m diameter)</td>
			<td>KISKER Biotech</td>
			<td>PPS-30.0COOHP</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD Lipid Concentrate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11905031</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N. A.</td>
			<td>For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>In house</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160701</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge</td>
			<td>BD</td>
			<td>14-826AA</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inulin</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAA1842509</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Vitamin Solution (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11120052</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES (Fine White Crystals)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP300-100</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitest Slide 10 Well</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN6041805</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140148</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP431-100</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>POC888</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>R6160</td>
			<td>For the bead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider's Drosophila Sterile Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720024</td>
			<td>For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution, 10 N</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td>For the blastomere isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0.</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovation</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>For live-imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile</td>
			<td>Basix</td>
			<td>13100115</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-862</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics</td>
			<td>89403-854</td>
			<td>For the blastomere isolation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of spatial cell contact patterns with isolated caenorhabditis elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads

I flercelliga system, är enskilda celler omgivna av olika fysiska och kemiska signaler som kommer från angränsande celler och miljön. Denna vävnad komplexitet blandar ihop identifieringen av orsakssambandet mellan extrinsic signaler och cellulära dynamik. Ett syntetiskt rekonstituerat multicellulära system övervinner detta problem genom att göra det möjligt för forskare att testa för en specifik Cue samtidigt eliminera andra. Här presenterar vi en metod för att rekonstruera cell kontakt mönster med isolerade Caenorhabditis elegans biopsi och lim polystyren pärlor. Procedurerna innebär äggskal avlägsnande, biopsi isolering genom att störa cell-cell adhesion, beredning av lim polystyren pärlor, och beredning av cell-cell eller cell-pärla kontakt. Slutligen presenterar vi tillämpningen av denna metod för att undersöka inriktningen av cellulära Division axlar som bidrar till regleringen av rumsliga cellulära mönster och cell öde specifikation i utvecklingen av embryon. Denna robusta, reproducerbara och mångsidiga in vitro-metod möjliggör studiet av direkta relationer mellan rumslig cell kontakt mönster och cellulära svar.

För pärlor beredning, vi bestämde den optimala mängden av Rhodamine Red-X succinimidyl Ester för den transgena stammen uttrycker GFP-myosin II och mCherry-histone (figur 1A-D). Vi använde mcherry taggade Histon som en markör för cell Cycle progression. Eftersom både rhodamine Red-x och mcherry kommer att belysas av en 561 nm-Laser, är den optimala intensiteten av rhodamine Red-x-signalen jämförbar med den för Histon för att möjliggöra samtidig avbildning av c...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Vävnad komplexitet flercelliga system blanda ihop identifieringen av orsakssambandet mellan extracellulära signaler och enskilda cellulära beteenden. Här presenterar vi en metod för att studera den direkta kopplingen mellan kontakt beroende ledtrådar och divisions axlar med hjälp av C. elegans embryo blastomerer och lim polystyren pärlor.

In vitro-beredning av rumslig cell kontakt mönster med isolerad Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres och lim polystyren pärlor

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Flercelliga vävnader komplexa, detta protokoll rekonstruerar cellulära beteende på ett förenklat sätt. En sak är denna teknik för att studera de direkta relationerna mellan cellulära ledare protoner och cellulära svar. Detta protokoll använder kemiskt funktionella polystyren pärlor att rekonstruera cellulära dirigent protoner.Pärlorna kan skäras med alla protoner av intresse, för att testa deras effekter på cellulära svar. Vi har använt denna metod i C-Elegance på mus embryon. Därför kan detta protokoll vara upprätt till studierna av breda organismer.Eftersom embryon är ömtåliga efter hög full kloritbehandling krävs betydande praxis innan man framgångsrikt kan isolera blastomer. Visuell demonstration kommer att ge en större förståelse för hur man ska hantera kapillär under blastomer-isolering metoder. Till att börja, väga 10 milli-gram karboxylat modifierade polystyrenpärlor i en 1,5 milli-liters mikro centrifugrör.Lägg till en milli-liters MES-buffert i röret för att tvätta. Vortexa röret för att blanda pärlorna. Snurra röret i 60 sekunder vid 2000XG via bänk-top centrifug.Dicard supernatanten genom att försiktigt pipettera ut bufferten. Tvätta pärlorna igen med en milli-liters MES-buffert. Efter tvätten, tillsätt en milli-liters MES buffert som innehåller 10 milli-gram EDAC i röret, för att aktivera ytan carboxyl grupper.Vortexa röret för att blanda pärlorna. Rotera och inkubera röret i 15 minuter i rumstemperatur. Snurra ner pärlorna i 60 sekunder vid 2000XG.Kassera supernatanten genom att försiktigt pippetting ut bufferten, och tvätta med en milli-liters PBS. Vortexa röret för att blanda pärlorna och upprepa PBS tvätta en gång till. Förbered en milli-liters av en, 10, 100, och en tusenfaldig utspädning serie Rhodamine Red-X från 0,65 milli-liters Rhodamine Red-X stamlösning.Pippette 20 mikro-liters pärlor i varje seriell utspädningsrör. Rotera och inkubera rören i fem minuter i rumstemperatur. Tvätta pärlorna två gånger med en milli-liters PBS.Efter tvätt, tillsätt en milli-liters PBS i rören och förvara dem i fyra grader Celsius i upp till sex veckor. Kontrollera fluorescensintensiteten hos pärlorna under ett mikroskop som används för live-avbildning. Håll varje ände av en mikro-kapillär vid en kapacitet på 10 mikro-liter med höger och vänster hand.Dra mikro-kapillär mot båda ändar att tillämpa spänning och föra mitten av kapillären över en brännare för att göra två hand-drog kapillärer. Under dissekering mikroskop, trimma spetsarna på handdragna kapillärer med tlyckop. Gör de två spetsöppningsstorlekarna ungefär två gånger, och en gånger den korta åtkomstlängden för C-Elegance Embryon för embryoöverföringen respektive äggskalsborttagningen.Fäst den dragna kapillären i en mun-pippetting apparat. Pippette 45 mikro-liter av ägg-salter lösning på en brunn av en multi-welled bild. Placera fem till tio vuxna C-Elegance på brunnen.För att få tidigt C-Elegance Embryon skära vuxna i bitar genom att placera två nålar till höger och vänster om C-Elegance kropp, och skjuter nålarna förbi varandra. Pippette 45 mikro-liter hypoklorit lösning på en brunn bredvid brunnen som innehåller ägg-saltlösning och pippette 45 mikro-liter shelton's Growth Medium på de efterföljande tre brunnarna. Överför en cell stadium och tidiga två cell stadium embryon i hypoklorit lösning genom munnen pippette med större storlek öppning och vänta i 40 till 55 sekunder.Tvätta embryona genom att överföra dem till de kommande tre brunnarna med Shelton's Growth Medium. Med en till två sekunder i var och en av de två första brunnarna. Använda handritade kapillär med mindre storlek öppning noggrant upprepa pippetting embryot för äggskal borttagning.Därefter, kontinuerligt pippette med handritade kapillär att separera två-cell stadium embryonala blastomeres. Efter äggskal avlägsnande, minimera kraften i pippetting embryona upp och ner för att förhindra burst. Förbered en bildkammare genom att placera en täckplatta på en täckskyddshållare och tejpa kanterna på täcket för att stabalisera den.Vänd på täckskyddshållaren och rita en cirkel på täcket med en hydrofoba penna. Lägg till Shelton's Growth Medium inom den cirkel som ritas av den hydrofoba markören, och överför den isolerade blastomeren till bildkammaren inom cirkeln. Nu, dispensera en liten volym av de kemiskt funktionaliserade pärlorna på täcket med hjälp av den handritade kapillären med den större öppningen.Styr pärlornas läge genom att blåsa in i den handdragna kapillären tills pärlorna fäster vid den isolerade blastomeren. Montera täckskopet för att undvika avdunstning av medium och utför live avbildning med hjälp av ett inverterat mikroskop. I denna studie, den fluorescerande signalen från pärla behandlas med 0.005 mikro-gram per milli-liter Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester för den transgena stammen uttrycker GFP miosin-2 och M-cherihistone var för svag.Å andra sidan var den fluorescerande signalen från pärlorna som behandlades med fem mikrogram per milli-liters Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester för stark. Koncentrationen av Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester vid 0,5 mikro-gram per milli-liter var optimal för just denna transgena stam. Under live imaging ett plan identifierades där två centrosomes var vertikalt i linje.Planet med plus eller minus 90 graders vinkel på detta plan är spindelplan. Vinkeln på spindel orientering i förhållande till cellen/bead kontakt gränssnitt efter cytokines visar att båda dottercellerna var knutna till pärlan i en linje som passerar båda kontakt sevärdheter användes som en kontakt orientering. Man måste lära sig hur embryon och äggskal reagerar på vissa yttre krafter som tillämpas av munpipettet.Teoretiskt kan något cellulärt svar studeras, till exempel, sulfat specifikation kan studeras av odlingsceller och kontakt med självhäftande pärlor över längre termer. Denna teknik har använts för att förstå kontakt beroende celldelning orientering mekanism. PTF filter användes för att förhindra inandning av rök av hypoklorit lösning via munnen pippette.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattande Bedömning av nedärvda Kemisk toxicitet Använda Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Tillämpning av Ogenomträngliga hinder Kombinerat med kandidat faktor Fuktiga pärlor att studera Induktiva signaler i Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumsliga och tidsmässiga analys av aktiva ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; arvslinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Fröämnet odling för Live-cell Imaging av zygot polarisering och Embryo mallning i Arabidopsis thaliana.

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM och Microrheology i cellen zebrafiskar Embryo äggula

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Immobilisering av Caenorhabditis elegans att analysera intracellulära Transport i nervceller

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Bedömningen av lysosomala alkalisering i tarmen av Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Sondera Cell mekanik med pärla-fri optisk pincett i Drosophila embryot

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...