Name: automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

ويدعم هذا العمل برنامج دعم الهياكل الاساسيه التشغيلية لحكومة فيكتوريا ، وقسيمة التكنولوجيا الحكومية الفيكتورية التي تقدمها أداره التنمية الاقتصادية والوظائف والنقل والموارد. RL هو المتلقي لزمالة التطوير الوظيفي لمجلس الصحة والبحوث الطبية الوطنية. ال هو المتلقي لجائزه الدراسات العليا الاستراليه.

1. اعداد الكواشف والخلايا لتبادل العازلة
<ol><li>اعداد المخازن المؤقتة (انظر جدول المواد) في فئة 2 غطاء التدفق الصفحي. باستخدام حقنه والجمعية ابره ، أزاله 50 مل من محلول ملحي من كيس ملحي 500 mL. استبدال هذا مع 50 mL من الزلال المصل البشري 20 ٪ (HSA) لجعل 2 ٪ HSA في المحلول الملحي ، والتي ستكون بمثاب...

<ol>
	<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+1.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li><li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factories+of+the+future:+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here?.">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?.</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li><li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing.">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li><li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+cell-based+therapies:+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges.">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li><li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products.">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+2.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System.">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li><li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation:+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like?.">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li><li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stromal+Cells:+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities.">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li><li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+(CAR+T-Cells)+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry?.">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?.</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+automation+in+process+development,+manufacture+of+cell,+gene-based+therapies.">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture.">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li><li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+(CFCL/CCE).">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li><li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+(Elutra&#8482;)+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells.">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra&#8482;) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li><li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+(DC)+therapy:+Clinical+study.">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li><li>Whitford, W. G., Subramanian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).</li><li>. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH &amp; CONCENTRATION Available from: <a target="_blank" href="https://www.scinogy.com/projects">https://www.scinogy.com/projects</a> (2019)</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule.">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li><li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways.">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).</li><li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment.">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products.">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li><li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch.">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li><li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies.">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).</li><li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts.">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li><li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts:+a+preclinical+evaluation.">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li><li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+(Cx601)+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn's+disease:+a+phase+3+randomised,+double-blind+controlled+trial.">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia:+A+Safety+Study.">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li></ol>

بروتوكول تبادل المخزن المؤقت التلقائي الموصوف بسيط وسهل الاستخدام. ومع ذلك ، هناك بضع خطوات رئيسيه في هذا البروتوكول ذات اهميه حاسمه وتتطلب اهتماما خاصا. في تجربتنا ، عند معالجه الخلايا الكبيرة مثل MSCs (متوسط قطر 10-15 μm) يجب ان تشمل كل تشغيل ما لا يقل عن 1 × 107 خلايا لتحقيق الشفاء الأمثل ?...

وقد تحولت المناظر الطبيعية للطب الحديث بسرعة من خلال التطورات الاخيره في الجينات والعلاجات القائمة علي الخلايا (GCT). باعتبارها واحده من أسرع المجالات نموا في البحوث الانتقالية ، وقطاع GCT يواجه أيضا تحديات فريدة من نوعها وغير مسبوقة. الاضافه إلى النتائج السريرية القوية ، فان عمليات التصنيع الكفؤه والفعالة من حيث التكلفة ضرورية للنجاح التجاري لهذه العملية ، وهو أمر يصعب تحقيقه بشكل خاص في الصناعات التحويلية الصغيرة الحجم1. يتم تضخيم تكلفه الوقت والعمل وضمانات الجودة عندما تنتج كل دفعه من الخلايا فقط جرعات قليله لمريض واحد بدلا من مئات أو آلاف. علي عكس العلاجات الخلوية الخيفيه التي تكون فيها عمليات التصنيع أقرب إلى إنتاج الأجسام المضادة والبروتينات المؤتلفة ، يتم عاده إنتاج العلاجات الذاتية للخلايا كعمليات صغيره الحجم1. كظاهره جديده نسبيا في تصنيع ادويه2، خيارات لمعالجه الخلايا الصغيرة الحجم حاليا محدوده جدا.
تبادل المخزن المؤقت ضروري لتصنيع الخلايا. وهي واحده من العمليات المصب حيث يتم أزاله الخلايا من وسائل الاعلام الثقافية وتتركز للحجز بالتبريد أو التسريب. وفي الوقت الراهن ، غالبا ما يطبق تصنيع الخلايا الصغيرة عمليات مماثله لتلك الموجودة في اعداد البحوث الاكاديميه ويعتمد علي غرف نظيفه متخصصة للمحافظة علي العقم3. العمليات اليدوية المصب غالبا ما تستخدم أجهزه الطرد المركزي العلوية لبيليه وأعاده تعليق الخلايا للحد من حجم وتبادل العازلة. هذه العمليات المفتوحة مكلفه (اي العمل وصيانة الغرف النظيفة) ولها قدره تصنيع محدوده ، والتي ليست مثاليه للإنتاج التجاري2،3.
وقد اقترح تنفيذ الاتمته كحل لتحسين كفاءه التصنيع وتحقيق الإنتاج علي نطاق تجاري2. لا يمكن تحقيق العقم في المنتجات القائمة علي الخلايا من خلال الأساليب التقليدية المستخدمة في البيولوجية ، مثل إشعاع جاما أو الترشيح نهاية المحطة الطرفية. وبدلا من ذلك ، يتم نشر نظام أوتوماتيكي مغلق للحد من مخاطر التلوث والمشغلين الذين يعتمدون علي غرف نظيفه للحفاظ علي العقم4. كما تعالج أتمته العمليات مساله قابليه التحجيم اما بوجود أنظمه متعددة تعمل بالتوازي (التحجيم) أو بزيادة قدره المعالجة لجهاز فردي (توسيع النطاق) ، مما يقلل بدوره من التباين بين المشغلين. وعلاوة علي ذلك ، فان تحليل نمذجة التكلفة للعلاجات الذاتية يوحي بان الاتمته قد تقلل من تكلفه التصنيع5،6. ومع ذلك ، لم يتم العثور علي فائده التكلفة في التجربة السريرية للخلايا الجذعية الذاتية حيث تم استخدام منصة التصنيع الألى7، مما يوحي بان فائده التكلفة من الاتمته قد تعتمد علي عمليه التصنيع الفردية.
هناك استراتيجيات مختلفه في الاتمته التي يمكن إدخالها في عمليه التصنيع القائمة. ويمكن تحقيق ذلك اما عن طريق تنفيذ منصة متكاملة تماما أو سلسله تجهيز تستند إلى وحدات. هناك عده منصات متكاملة بالبالكامل متاحه تجاريا لتصنيع الخلايا الذاتية ، مثل كليمياكس المعجزة (Miltenyi بيوتيك) ، شرنقة (اوكتان التكنولوجيا الحيوية) ، والكم (Terumo BCT). هذه المنصات المتكاملة ، والتي غالبا ما توصف بأنها "GMP في مربع" ، لديها طلبات منخفضه علي البنية التحتية وسهله التشغيل. ومع ذلك ، فان القدرة التصنيعية لاعداد متكامل تماما قد تكون مقيده من قبل الحاضنة الملحقة بالنظام. علي سبيل المثال ، ويقتصر القدرة علي الخياطة معجزه لها 400 مل غرفه8 وخرطوشه الكم لديها مساحة الحد السطحية تعيين إلى 2.1 m2 (ما يعادل 120 T175 قوارير)7، والتي قد لا تكون كافيه للمرضي الذين يحتاجون إلى جرعات اعلي الخلية9،10. بالاضافه إلى ذلك ، معجزه والكم لديها سمه مشتركه التي تحد من استخدامها: الوحدة التشغيلية مشغولة بدفعه واحده من الخلايا طوال فتره توسيع الخلية ، التالي الحد من عدد الدفعات التي يمكن تصنيعها من قبل كل وحده11. نهج وحدات لاتمته هو إنشاء سلسله التصنيع مع وحدات متعددة وحدات التي تحاكي عمليه التصنيع التجاري12,13. هذا النهج ، الذي يفصل جهاز الثقافة من جهاز غسل الخلية ، التالي يمكن تعظيم كفاءه التصنيع. سيكون جهاز تجهيز مثاليه واحده التي هي قابله للتكيف وقابله للتطوير لاحتياجات التصنيع12.
وكان لتكنولوجيا طرد المضادة للتدفق (CFC) ، التي تعود إلى السبعينات ، تاريخ طويل في معالجه الخلايا14. فانه يحقق تركيز الخلية والانفصال عن طريق موازنة قوه الطرد المركزي مع قوه مضاده للتدفق. عاده ، يدخل تعليق الخلية من النهاية الضيقة للغرفة الخلية تحت معدل تدفق ثابت اثناء الخضوع لقوه الطرد المركزي (الشكل 1ا). ويمارس تدفق السائل في الاتجاه المعاكس لقوه الطرد المركزي. ويشار إلى ذلك بالقوة المضادة للتدفق ، التي تشكل تدرجا داخل الغرفة الخلوية. ثم تنخفض قوه التدفق المضاد حيث تتوسع الغرفة الخلوية بعيدا عن طرف غرفه الخلية المخروطية الشكل. الخلايا ذات الكثافة العالية والقطر الأكبر لديها معدل ترسيب اعلي ، التالي فانها تصل إلى قوه التوازن نحو غيض من المخروط علي شكل غرفه الخلية. الجزيئات الصغيرة قد تصل إلى التوازن نحو قاعده الغرفة أو تكون صغيره جدا للاحتفاظ بها في الغرفة سيتم غسلها بعيدا. ومن المعروف في الغالب تكنولوجيا CFC لتطبيقه في معالجه المنتجات الفصاده الدم ، مثل عزل الخلايا الاحاديه لعلاجات الخلايا الجذعية15،16. وفيما يتعلق بالتبادل الاحتياطي ، فان تكنولوجيا مركبات الكربون الكلوريه فلورية لم تطبق الا في الصناعات التحويلية الكبيرة الحجم17 ولم تستخدم بعد في تصنيع العلاجات الخلوية الذاتية علي نطاق أصغر.
ولمعالجه الحاجة إلى جهاز مناسب لتصنيع الخلايا الصغيرة الحجم ، تم مؤخرا تطوير جهاز مركبات الكربون الكلوريه فلورية الألى (انظر جدول المواد) ،18. يستخدم الجهاز الألى لمعالجه الخلايا تقنيه طرد التدفق المضاد لأزاله الحطام الخلوي وتسهيل تبادل المخزن المؤقت. يقوم الجهاز باجراء تبادل المخزن المؤقت مع مجموعه الاستخدام المفرد التي يمكن ان تكون معقمه-متصلة بحقيبة نقل الخلايا ، والتي تسمح بمعالجه الخلايا داخل نظام معقم ومغلق. هنا ، نقوم بالتحقيق في استخدام جهاز طرد مركزي مضاد للتدفق لاجراء تبادل المخزن المؤقت في ثقافات خلايا الثدييات في البروتوكولات المؤتمتة. في هذه الدراسة ، اختبرنا بروتوكول تبادل العازلة باستخدام خلايا Jurkat والخلايا الجذعية اللحمية (MSCs) لنموذج أنواع الخلايا غير الملتصقة والملتصقة ، علي التوالي. خلايا jurkat هي خلايا الخلد التي غالبا ما تستخدم لدراسة ابيضاض الدم الحاد الخلايا التائية19,20. MSCs هي الخلايا الجذعية الكبار التي تم دراستها في التجارب السريرية البشرية لمجموعه واسعه من الامراض9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 ml Luer lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>AUST R 46283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156477-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml IV saline bag</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>K690521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (Countess)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stimulation cocktail (500x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4970-93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfer bags</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>T1BBT060CBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Al221C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer (female) fittings</td>
			<td>CPC</td>
			<td>LF41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC laptop or PC tablet device</td>
			<td>ASUS</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (SpectraMax i3)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea single-use processing kit</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>420SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing

ويتطلب التسويق الناجح للعلاجات الجينية والقائمة علي الخلايا عمليات تصنيع فعاله من حيث التكلفة وقابله للتطوير. تبادل المخزن المؤقت وتركيز المنتج هي مكونات أساسيه لمعظم عمليات التصنيع. ومع ذلك ، في المراحل المبكرة من تطوير المنتج ، غالبا ما يتم تنفيذ هذه الخطوات يدويا. الطرد اليدوية الميتة لتبادل العازلة كثيفه العمالة ومكلفه وغير قابله للتطوير. ويمكن للنظام المؤتمت المغلق ان يزيل هذه الخطوة المضنية بشكل فعال ، ولكن التنفيذ يمكن ان يكون صعبا. هنا ، ونحن وصف جهاز معالجه الخلايا المطورة حديثا التي هي مناسبه لتجهيز الخلايا الصغيرة والمتوسطة الحجم ، ويهدف إلى سد الفجوة بين المعالجة اليدوية والاتمته علي نطاق واسع. يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسهوله علي أنواع الخلايا المختلفة والعمليات عن طريق تعديل معدل التدفق وسرعه الطرد. وقد اظهر بروتوكولنا انتعاش الخلايا العالية مع فترات معالجه أقصر بالمقارنة مع العملية اليدوية. كما حافظت الخلايا المستعادة من العملية المؤتمتة علي معدلات انتشارها. يمكن تطبيق الجهاز كمكون وحدات في عمليه تصنيع مغلقه لاستيعاب الخطوات مثل تبادل المخزن المؤقت ، وصياغة الخلية ، والحفظ بالتبريد.

في هذا البروتوكول ، استخدمنا خلايا Jurkat و MSCs كامثله تمثيليه لإظهار عمليه تبادل المخزن المؤقت المؤتمت. اثناء العملية ، الخلايا Jurkat و MSCs مشتركه نفس الخطوات المعالجة مع الاختلافات في قوه الطرد المركزي وسرعه المضخة التي تتحكم في معدل التدفق (الجدول 1). ويبين الشكل 2 الص?...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

الاتمته هي المفتاح للارتقاء وأداره التكاليف في تصنيع الخلايا. تصف هذه المخطوطة استخدام جهاز معالجه الخلايا الطرد المركزي المضاد للتدفق لاتمته خطوات التبادل المؤقت وتركيز الخلية للمعالجة الحيوية الصغيرة النطاق.

نظام الطرد المركزي التلقائي للتدفق المضاد لمعالجه الخلايا الصغيرة الحجم

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

يوفر هذا البروتوكول حلاً لتبادل المخزن المؤقت التلقائي المغلق والتركيز لتصنيع الخلايا الصغيرة الحجم. الأهم من ذلك ، تبادل العازلة قادرة على أن يؤديها مع انتعاش عالية وتسليم حجم صغير جدا من المنتجات المركزة. قد يواجه المستخدمون الجدد صعوبة في اتباع جميع خطوات التشغيل التلقائي.إن ممارسة برمجة هذه الخطوات وإجراء عمليات الاختبار مع المتوسط هي طرق جيدة للتعرف على الجهاز. قبل البدء في تبادل العازلة، في فئة اثنين من رأس تدفق لارينار، واستخدام حقنة وإبرة التجميع لإزالة 50 ملليلتر من محلول ملحي من كيس ملحي 500 ملليلتر. استبدال هذا الحجم مع 50 ملليلتر من 20٪ من الألبومين المصل البشري، وحصاد الخلايا ذات الاهتمام من أوعية الثقافة الخاصة بهم.بعد العد، استخدم الحقنة لتحميل الخلايا في كيس نقل، واستخدام قفل Luer لتوصيل حقيبة نقل إلى مجموعة معالجة ذات استخدام واحد. ثم قم بتوصيل حقيبة الغسيل الاحتياطية المعدة مسبقًا بمجموعة المعالجة ذات الاستخدام الواحد. لإعداد تبادل المخزن مؤقت تلقائي، افتح واجهة مستخدم الرسومات للجهاز وانقر فوق زر البدء.انقر فوق جديد لإنشاء بروتوكول جديد، وانقر فوق التحكم لتحديد الصمامات التي سيتم فتحها وإغلاقها، وسرعة الطرد المركزي والضخ، واتجاه المضخة، ومشغلات العمل. عند تعيين كافة المعلمات، انقر فوق حفظ. قم بتعليق الأكياس المناسبة المتصلة على الجهاز، ثم ضع مجموعة المعالجة ذات الاستخدام الواحد على الجهاز.ثم انقر فوق زر الاتصال وتحميل البرنامج المحفوظة. عندما يضيء زر التشغيل، يكون البروتوكول جاهزًا للبدء. لإجراء تبادل المخزن المؤقت التلقائي، افتح المشابك اليدوية للأنابيب حقيبة نقل، وانقر فوق بدء لبدء برنامج تبادل المخزن المؤقت.في نهاية الخطوة السادسة الأتمتة، فإن العملية وقفة بسبب اثار من استشعار فقاعة من قبل الهواء في كيس فارغة الآن. إذا كانت الحقيبة فارغة بالفعل، اضغط بجوار نقل العملية إلى الخطوة التالية. عند الانتهاء من العملية الآلية، أغلق جميع مشابك الأنابيب وافتح باب الجهاز.ثم قم بإزالة مجموعة الاستخدامات ذات الاستخدام الواحد من الجهاز وافصل الحقنة للسماح بتجميع الخلايا للتحليل اللاحق. عادة، سوف تظهر سرير الخلية الممسيلة كما هو الحال في هذه الصورة مع الخلايا المتراكمة في الوسط ونحو الجزء الأمامي من المخروط، ومساحة صغيرة في طرف الغرفة التي الخلايا لا تتراكم، وفتحة مرئية داخل مدخل تحميل الخلية. قد يتم ضغط سرير الخلية الممسيلة عند إدخال مخزن مؤقت جديد يكون في لزوجة أو كثافة مختلفة.ويمكن تطبيق معدل تدفق مرتفع لتحديد الخلايا الحية حيث أن الخلايا الميتة أصغر وأخف وزنا ويمكن إجبارها على الخروج من الغرفة عن طريق زيادة معدل التدفق. العملية التلقائية للوقت معالجة تبادل المخزن المؤقت أقصر من عملية تبادل المخزن المؤقت اليدوي. وفي هذا التحليل، كانت معدلات الاسترداد بين الدليل والعمليات الآلية متشابهة بالنسبة لكلا النوعين من الخلايا التي تم اختبارها، ولم تتأثر قابلية الخلية للاستمرار بأي من العمليتين.وأظهرت الخلايا المستعادة معدلات انتشار مماثلة، وقدرات على إنتاج السيتوكينات، وأنشطة إيديو، بغض النظر عن نوع المعالجة. من المهم أن نتذكر أن هذا البروتوكول يخدم فقط كمبدأ توجيهي ، وبالتالي يحتاج المستخدمون إلى برمجة معدل التدفق وسرعة الطرد المركزي وفقًا لنوع الخلية والمخزن المؤقت. تبادل المخزن المؤقت هو خطوة وسيطة في تصنيع الخلايا التي قد تتبع توسيع الخلية أو الحفظ بالتبريد و الصياغة.والهدف هو تطوير طرق لإحاطة العملية برمتها. الطرد المركزي للتدفق المضاد هو منصة متعددة الاستخدامات للغاية. وسوف تستكشف الدراسات المستقبلية التطبيقات في اختيار الخلايا، مثل إزالة الخلايا الميتة وعزل الخلايا أحادية النواة عن منتج chorisis.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

المعالجة بعد الإنتاج من الألياف Electrospun للهندسة الأنسجة

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

رقاقة سلالة التدرج لتحفيز السلوكيات الخلوي في الخلية لادن المائية

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

تماما الجهاز الآلي الطرد المركزي ميكروفلويديك للكشف عن البروتين فائق الحساسية من الدم الكامل

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

الآلي الجمعية معالجة السائل الروبوتية أجهزة وحدات الحمض النووي

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

تصميم وتنفيذ لإلقاء الضوء الآلي، التثقيف، ونظام أخذ العينات للتطبيقات الميكروبية علم البصريات الوراثي

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

مسح الشرائح الآلي وتجزئة في الأنسجة المسمى فلوريسسينتلي باستخدام نظام تحليل ويديفيلد عالية-المحتوى

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

نظام ميكروبيوريكتور لإنتاج IgG1 النموذجي في الخلايا شو الآلي استخدام الفائق

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

يعيش "خلية التحليل من إجهاد القص" على الزائفة الزّنجاريّة باستخدام نظام موائع جزيئية العالي الإنتاجية الآلي

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

تنقية وتحليل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من خلايا المبيض الهامستر الصينية باستخدام نظام مفاعل ميكروبيوم الآلي

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...