Name: automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Dette arbejde er støttet af den victorianske regerings operationelle infrastruktur støtte program, og den victorianske regering teknologi voucher leveres af Department of økonomisk udvikling, job, transport og ressourcer. RL er modtager af en national sundhed og medicinsk forskning Rådet karriereudvikling fællesskab. AL er modtager af en australsk postgraduate Award.

1. klargøring af reagenser og celler til buffer udveksling
<ol><li>Forbered buffere (Se tabel over materialer) i en klasse 2 laminar flow hætte. Ved hjælp af en sprøjte og nål samling, fjerne 50 mL saltopløsning fra en 500 mL saltvands pose. Udskift dette med 50 mL 20% humant serumalbumin (HSA) for at lave 2% HSA i saltvand, som vil fungere som vaskebuffer.</li>
	<li>Fjern cellerne fra kultur skibene og Udfør et celletal for at bestemme start cellens mængde og levedygtighed ved trypan og et Blu...

<ol>
	<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+1.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li><li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factories+of+the+future:+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here?.">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?.</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li><li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing.">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li><li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+cell-based+therapies:+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges.">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li><li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products.">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+2.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System.">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li><li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation:+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like?.">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li><li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stromal+Cells:+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities.">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li><li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+(CAR+T-Cells)+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry?.">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?.</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+automation+in+process+development,+manufacture+of+cell,+gene-based+therapies.">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture.">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li><li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+(CFCL/CCE).">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li><li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+(Elutra&#8482;)+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells.">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra&#8482;) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li><li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+(DC)+therapy:+Clinical+study.">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li><li>Whitford, W. G., Subramanian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).</li><li>. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH &amp; CONCENTRATION Available from: <a target="_blank" href="https://www.scinogy.com/projects">https://www.scinogy.com/projects</a> (2019)</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule.">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li><li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways.">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).</li><li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment.">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products.">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li><li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch.">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li><li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies.">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).</li><li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts.">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li><li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts:+a+preclinical+evaluation.">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li><li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+(Cx601)+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn's+disease:+a+phase+3+randomised,+double-blind+controlled+trial.">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia:+A+Safety+Study.">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li></ol>

Den beskrevne automatiserede buffer udvekslings protokol er enkel og brugervenlig. Ikke desto mindre er der et par vigtige skridt i denne protokol, der er kritiske og kræver særlig opmærksomhed. I vores erfaring, ved behandling af større celler såsom MSCs (gennemsnitlige diameter 10 – 15 μm) hver kørsel bør omfatte mindst 1 x 107 celler for at opnå optimal celle opsving (figur 4B). Behandling af mindre celler, såsom Jurkat celler (Gennemsnitlig ~ 10 μ...

Landskabet med moderne medicin har ændret sig hurtigt gennem den seneste udvikling i gen-og cellebaserede terapier (GCT). Som et af de hurtigst voksende områder inden for Translationel forskning står GCT-sektoren også over for unikke og hidtil usete udfordringer. Ud over solide kliniske resultater er effektive og omkostningseffektive fremstillingsprocesser afgørende for GCT 's kommercielle succes, hvilket er særligt vanskeligt at opnå i små fremstillingsvirksomheder1. Udgifterne til tid, arbejdskraft, og kvalitet forsikringer er forstørret, når hver batch af celler kun producerer et par doser for en patient i stedet for hundreder eller tusinder. I modsætning til allogene celle terapier, hvor fremstillingsprocesser er mere beslægtet med produktion af antistoffer og rekombinante proteiner, fremstilles autologe celle terapier typisk som små operationer1. Som et relativt nyt fænomen inden for biofarmaceutiske produktion2er mulighederne for småcellet forarbejdning i øjeblikket ret begrænsede.
Buffer udveksling er afgørende for celle produktion. Det er en af downstream-processerne, hvor cellerne fjernes fra dyrkningsmedier og koncentreres om Kryopreservation eller infusion. I øjeblikket anvender småcellet celle fremstilling ofte processer svarende til dem i den akademiske forsknings indstilling og er afhængige af specialiserede rene rum for at opretholde sterilitet3. Manuelle downstream-processer bruger ofte stationære centrifuger til pellet og resuspension af celler til reduktion af volumen og buffer udveksling. Disse åbne processer er dyre (dvs. arbejdskraft og Clean Room vedligeholdelse) og har begrænset produktionskapacitet, som ikke er ideelle til kommerciel produktion2,3.
Implementering automatisering er blevet foreslået som en løsning til at forbedre produktionen effektivitet og opnå kommerciel skala produktioner2. Sterilitet kan ikke opnås i celle-baserede produkter gennem traditionelle metoder, der anvendes til biologiske, såsom gammabestråling eller Terminal ende filtrering. I stedet implementeres et automatiseret lukket system for at reducere risikoen for kontaminering og operatører, der er afhængige af rene rum for at opretholde sterilitet4. Procesautomatisering løser også problemet med skalerbarhed ved enten at have flere systemer kørende parallelt (skalering) eller øge behandlingskapaciteten for en enkelt enhed (Scale-up), hvilket igen minimerer variabiliteten mellem operatørerne. Desuden tyder cost modellering analyse af autologt terapier, at automatisering kan reducere omkostningerne ved fremstilling af5,6. Der blev imidlertid ikke fundet nogen cost-benefit i et klinisk forsøg med autologe stamceller, hvor der blev anvendt en automatiseret fremstillings platform7, hvilket tyder på, at omkostningsfordelen ved automatisering kan afhænge af den enkelte fremstillingsproces.
Der er forskellige strategier, hvor automatisering kan introduceres i en eksisterende fremstillingsproces. Dette kan opnås enten ved at implementere en fuldt integreret platform eller en modulbaseret forarbejdningskæde. Der er flere fuldt integrerede platforme kommercielt tilgængelige for autologt celle produktion, såsom CliniMACS Prodigy (Miltenyi bioTec), Cocoon (Octane Biotech), og Quantum (TERUMO BCT). Disse integrerede platforme, der ofte betegnes som "GMP-in-a-box", har lave krav til infrastrukturen og er nemme at betjene. Produktionskapaciteten for en fuldt integreret opsætning kan dog være begrænset af den inkubator, der er tilsluttet systemet. F. eks. er fremstillings kapaciteten for Prodigy begrænset til 400 ml kammer8 , og kvante patronen har et begrænsende overfladeareal indstillet til 2,1 m2 (svarende til 120 T175 kolber)7, hvilket måske ikke er tilstrækkeligt til patienter, der kræver højere celle doser9,10. Desuden har Prodigy og Quantum en fælles attribut, der begrænser deres anvendelse: den operationelle enhed er besat af en enkelt batch af celler i hele cellen ekspansions perioden, og dermed begrænse antallet af partier, der kan fremstilles af hver enhed11. Den modulære tilgang til automatisering er at skabe en produktionskæde med flere modulære enheder, der simulerer den kommercielle fremstillingsproces12,13. Denne fremgangsmåde, som adskiller kultur enheden fra celle vaske anordningen, kan derved maksimere produktionseffektiviteten. En ideel behandlingsenhed ville være en, der er tilpasningsdygtig og skalerbar til produktionsbehov12.
Counterflow centrifugering (CFC) teknologi, der daterer sig tilbage til 1970 ' erne, har haft en lang historie i cellebehandling14. Det opnår celle koncentration og adskillelse ved at afbalancere centrifugalkraft med en modstrøms kraft. Typisk kommer en cellesuspension fra den smalle ende af et celle kammer under en konstant strømningshastighed, mens den udsættes for en centrifugalkraft (figur 1a). Strømmen af væsken udøves i den modsatte retning til centrifugal kraften. Dette kaldes modstrøms kraften, som danner en gradient i celle kammeret. Modstrøms kraften aftager derefter som celle kammeret udvider væk fra spidsen af den kegleformede celle kammer. Celler med højere densitet og større diameter har en højere sedimenterings hastighed, og dermed når de Kraftligevægt mod spidsen af det kegleformede celle kammer. Mindre partikler kan opnå ligevægt mod bunden af kammeret eller være for lille til at blive opbevaret i kammeret og vil blive vasket væk. CFC-teknologien er mest kendt for sin anvendelse i behandling af blodaferese produkter, såsom isolerende monocytter for dendritiske celle terapier15,16. Med hensyn til buffer udveksling, er CFC-teknologien kun blevet anvendt i storstilet produktion17 og har endnu ikke anvendes til den mindre skala fremstilling af autologt celle terapier.
For at imødegå behovet for en egnet anordning til småcellet fremstilling, en automatiseret CFC-enhed (Se tabel over materialer), blev for nylig udviklet18. Den automatiserede cellebehandling enhed bruger modstrøms Centrifugerings teknologi til at fjerne cellerester og lette buffer udveksling. Enheden udfører buffer udveksling med en engangs-kit, der kan være steril-forbundet til en celle overførsel taske, som gør det muligt for cellerne, der skal behandles i et sterilt, lukket system. Her undersøger vi brugen af en modstrøms centrifugal anordning til at udføre buffer udveksling i pattedyr cellekulturer i automatiserede protokoller. I denne undersøgelse testede vi buffer Exchange-protokollen ved hjælp af Jurkat-celler og mesenchymal stromale celler (MSCs) til at modellere ikke-vedhængende og vedhængende celletyper hhv. Jurkat celler er udødeliggjort t celler ofte anvendes til studiet af akut t celle leukæmi19,20. MSCs er voksne stamceller, der er blevet undersøgt i humane kliniske forsøg for en bred vifte af sygdomme9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 ml Luer lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>AUST R 46283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156477-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml IV saline bag</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>K690521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (Countess)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stimulation cocktail (500x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4970-93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfer bags</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>T1BBT060CBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Al221C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer (female) fittings</td>
			<td>CPC</td>
			<td>LF41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC laptop or PC tablet device</td>
			<td>ASUS</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (SpectraMax i3)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea single-use processing kit</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>420SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing

Vellykket kommercialisering af gener og cellebaserede terapier kræver fremstillingsprocesser, der er omkostningseffektive og skalerbare. Buffer udveksling og produkt koncentration er væsentlige komponenter i de fleste produktionsprocesser. Men i de tidlige stadier af produktudvikling udføres disse trin ofte manuelt. Manuelle dødende centrifugering til buffer udveksling er arbejdskraftintensiv, bekostelig og ikke skalerbar. Et lukket automatiseret system kan effektivt eliminere dette omstændelig skridt, men gennemførelsen kan være udfordrende. Her beskriver vi en nyudviklet celle behandlingsenhed, der er velegnet til små-til mellemstore celle bearbejdning og har til formål at bygge bro mellem manuel behandling og storstilet automatisering. Denne protokol kan let anvendes til forskellige celletyper og processer ved at ændre strømningshastigheden og centrifugeringshastigheden. Vores protokol viste høj celle opsving med kortere behandlingstider i forhold til den manuelle proces. Celler genvundet fra den automatiserede proces også fastholdt deres spredning satser. Enheden kan anvendes som en modulær komponent i en lukket fremstillingsproces for at imødekomme trin som buffer udveksling, celle formulering og cryopreservation.

I denne protokol brugte vi Jurkat cells og MSCs som repræsentative eksempler til at demonstrere den automatiserede buffer udvekslingsproces. Under processen delte Jurkat-celler og MSCs de samme forarbejdningstrin med forskelle i centrifugalkraft og pumpehastighed, der styrer strømningshastigheden (tabel 1). Figur 2 viser repræsentative billeder taget af kameraet for, hvordan den fluidiserede celle seng kan vises under buffer udvekslingsprocessen. Typisk vil den fluidisere...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Automatisering er nøglen til opskalering og omkostningsstyring i celle fremstilling. Dette manuskript beskriver brugen af en modstrøms centrifugal cellebehandling enhed til automatisering af buffer udveksling og celle koncentration trin for lille-skala bioprocessing.

Automatiseret Counterflow centrifugal system til småskala cellebehandling

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Denne protokol giver en løsning til lukket automatiseret bufferudveksling og koncentration til produktion af små celler. Det er vigtigt, at bufferudvekslingen kan udføres med en høj restitution og en levering af en meget lille mængde koncentreret produkt. Nye brugere kan have svært ved at følge alle automatiseringstrinnene.Øve programmering af disse trin og udføre testkørsler med medium er gode måder at blive fortrolig med enheden. Før bufferbyttet påbegyndes, skal der i et klasse to laminarflowhoved anvendes en sprøjte- og kanylesamling til at fjerne 50 milliliter saltvandsopløsning fra en 500 milliliter saltvandspose. Erstat dette volumen med 50 milliliter 20% human serum albumin, og høst celler af interesse fra deres kultur fartøjer.Når du har talt, skal du bruge sprøjten til at lægge cellerne i en overførselspose og bruge Luer-låsen til at forbinde overførselsposen til et engangsbearbejdningssæt. Tilslut derefter den tidligere forberedte pose vaskebuffer til engangsbearbejdningssættet. Hvis du vil konfigurere en automatiseret bufferudveksling, skal du åbne enhedens grafiske brugergrænseflade og klikke på startknappen.Klik nyt for at oprette en ny protokol, og klik på kontrol for at vælge de ventiler, der skal åbnes og lukkes, centrifugal- og pumpehastigheder, pumperetningen og handlingsudløseren. Når alle parametrene er angivet, skal du klikke på Gem. Hæng de tilsluttede poser på enheden, og anstæn skal engangsbearbejdningssættet på maskinen.Klik derefter på knappen Opret forbindelse, og hent det gemte program. Når afspilningsknappen lyser, er protokollen klar til at blive startet. Hvis du vil udføre den automatiske bufferudveksling, skal du åbne de manuelle klemmer til overførselsposeslangen og klikke på Start for at starte bufferudvekslingsprogrammet.I slutningen af automatisering trin seks, vil processen pause på grund af udløsning af boblen sensor ved luften i den nu tomme taske. Hvis posen rent faktisk er tom, skal du trykke på næste for at flytte processen til næste trin. Når den automatiserede proces er færdig, skal du lukke alle slangeklemmer og åbne enhedens dør.Fjern derefter engangssættet fra enheden, og afbryd sprøjten, så cellerne kan indsamles til efterfølgende analyse. Typisk vises den fluidiserede celleseng som repræsenteret i dette billede med cellerne akkumuleret i midten og mod forsiden af keglen, et lille mellemrum på spidsen af kammeret, hvor cellerne ikke akkumuleres, og en synlig åbning i cellen lastning indløb. Den fluidiserede celle seng kan komprimeres, når der indføres en ny buffer, der er på en anden viskositet eller tæthed.En høj strømningshastighed kan anvendes til at vælge for levende celler som døde celler er mindre og lettere og kan tvinges ud af kammeret ved at øge strømningshastigheden. Den automatiserede proces med behandlingstid for bufferudveksling er kortere end den manuelle bufferudvekslingsproces. I denne analyse var restitutionsraterne mellem de manuelle og de automatiserede processer ens for begge typer celler, der blev testet, og cellernes levedygtighed blev ikke påvirket af nogen af processen.De genvundne celler viste lignende spredningsrater, evner til at producere cytokiner og ideo-aktiviteter, uanset behandlingstypen. Det er vigtigt at huske, at denne protokol kun fungerer som en retningslinje, og derfor skal brugerne programmere strømningshastigheden og centrifugeringshastigheden i henhold til deres celletype og buffer. Bufferudveksling er et mellemliggende trin i celleproduktion, der kan følge cellekulturudvidelse eller kryopræservering og formulering.Målet er at udvikle måder at vedlægge hele processen. Counterflow centrifugering er en meget alsidig platform. Fremtidige undersøgelser vil undersøge applikationer i celle udvælgelse, såsom døde celle fjernelse og mononukleus celle isolation fra en chorisis produkt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Postproduktion Behandling af Electrospun Fibre til Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En alsidig Automatiseret platform for Micro-skala cellestimulering Eksperimenter

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient stamme Chip nemlig stimulere cellulære opførsel i celle-belæsset Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Fuldt automatiseret Centrifugal mikrofluidanordning for Ultrasensitive Protein Detection fra fuldblod

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatiseret robot flydende håndtering forsamling af modulære DNA enheder

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering af en automatiseret lysende, Dyrkning, og Sampling System for Mikrobiel optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatiseret dias Scanning og segmentering i Fluorescently mærket væv ved hjælp af en Widefield høj-indhold analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Brug af høj overførselshastighed automatiseret Microbioreactor System for produktion af Model IgG1 i CHO celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live celle analyse af Shear Stress på Pseudomonas aeruginosa ved hjælp af en automatiseret højere overførselshastighed mikrofluid System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensning og analyse af et monoklonalt antistof fra ovarieceller fra kinesiske hamster ved hjælp af et automatiseret Mikrobioreaktor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...