Name: automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00
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Diese Arbeit wird durch das Operational Infrastructure Support Program der viktorianischen Regierung und den Technologiegutschein der viktorianischen Regierung unterstützt, der vom Department of Economic Development, Jobs, Transport and Resources bereitgestellt wird. RL ist Träger eines National Health and Medical Research Council Career Development Fellowship. AL ist Träger des Australian Postgraduate Award.

1. Herstellung von Reagenzien und Zellen für den Pufferaustausch
<ol><li>Vorbereiten von Puffern (siehe Materialtabelle)in einer laminaren Strömungshaube der Klasse 2. Mit einer Spritze und Nadelbaugruppe 50 ml Salinelösung aus einem 500 ml-Salinebeutel entfernen. Ersetzen Sie dies durch 50 ml 20% humanes Serumalbumin (HSA), um 2% HSA in Saline zu bilden, was als Waschpuffer dient.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zellen aus den Kulturgefäßen, und führen Sie eine Zellanzahl aus, um die Anfangszellenme...

<ol>
	<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+1.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li><li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factories+of+the+future:+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here?.">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?.</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li><li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing.">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li><li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+cell-based+therapies:+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges.">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li><li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products.">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+2.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System.">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li><li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation:+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like?.">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li><li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stromal+Cells:+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities.">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li><li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+(CAR+T-Cells)+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry?.">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?.</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+automation+in+process+development,+manufacture+of+cell,+gene-based+therapies.">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture.">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li><li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+(CFCL/CCE).">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li><li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+(Elutra&#8482;)+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells.">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra&#8482;) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li><li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+(DC)+therapy:+Clinical+study.">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li><li>Whitford, W. G., Subramanian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).</li><li>. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH &amp; CONCENTRATION Available from: <a target="_blank" href="https://www.scinogy.com/projects">https://www.scinogy.com/projects</a> (2019)</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule.">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li><li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways.">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).</li><li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment.">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products.">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li><li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch.">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li><li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies.">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).</li><li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts.">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li><li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts:+a+preclinical+evaluation.">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li><li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+(Cx601)+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn's+disease:+a+phase+3+randomised,+double-blind+controlled+trial.">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia:+A+Safety+Study.">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li></ol>

Das beschriebene automatisierte Pufferaustauschprotokoll ist einfach und benutzerfreundlich. Dennoch gibt es einige wichtige Schritte in diesem Protokoll, die kritisch sind und besondere Aufmerksamkeit erfordern. Nach unserer Erfahrung sollte jeder Durchlauf bei der Verarbeitung größerer Zellen wie MSCs (durchschnittlicher Durchmesser 10–15 m) mindestens 1 x 107 Zellen umfassen, um eine optimale Zellwiederherstellung zu erreichen (Abbildung 4B). Die Verarbeitu...

Die Landschaft der modernen Medizin hat sich durch die jüngsten Entwicklungen in Gen- und Zelltherapien (GCT) rasant verändert. Als eines der am schnellsten wachsenden Bereiche der Translationsforschung steht auch der GCT-Sektor vor einzigartigen und beispiellosen Herausforderungen. Neben robusten klinischen Ergebnissen sind effiziente und kostengünstige Herstellungsverfahren entscheidend für den wirtschaftlichen Erfolg von GCT, der in der Kleinfertigung besonders schwer zu erreichen ist1. Die Kosten für Zeit, Arbeit und Qualitätssicherung werden erhöht, wenn jede Zellcharge nur wenige Dosen für einen Patienten anstatt für Hunderte oder Tausende produziert. Im Gegensatz zu allogenen Zelltherapien, bei denen die Herstellungsverfahren eher der Produktion von Antikörpern und rekombinanten Proteinen ähneln, werden autologe Zelltherapien typischerweise als kleinräumige Operationen produziert1. Als relativ neues Phänomen in der biopharmazeutischen Fertigung2sind die Möglichkeiten für die Zellverarbeitung in kleinem Maßstab derzeit recht begrenzt.
Der Pufferaustausch ist für die Zellfertigung unerlässlich. Es ist einer der nachgelagerten Prozesse, bei denen Zellen aus Kulturmedien entfernt und zur Kryokonservierung oder Infusion konzentriert werden. Derzeit wendet die Herstellung von Kleinzellen häufig Ähnliche Prozesse an wie im akademischen Forschungsumfeld und setzt auf spezialisierte Reinräume, um die Sterilität zu erhalten3. Manuelle nachgelagerte Prozesse verwenden häufig Tischzentrifugen, um Zellen zur Volumenreduzierung und Pufferaustausch zu besinnen und wieder auszusetzen. Diese offenen Prozesse sind kostspielig (d.h. Arbeits- und Reinraumpflege) und haben eine begrenzte Fertigungskapazität, die nicht ideal für die kommerzielle Produktion2,3sind.
Die Implementierung von Automatisierung wurde als Lösung zur Verbesserung der Fertigungseffizienz und zur Erreichung kommerzieller Produktionenvorgeschlagen 2. Sterilität kann in zellbasierten Produkten nicht durch traditionelle Methoden für Biologika wie Gammabestrahlung oder Endendfiltration erreicht werden. Stattdessen wird ein automatisiertes geschlossenes System eingesetzt, um das Risiko von Kontaminationen zu reduzieren, und Betreiber, die auf Reinräume angewiesen sind, um die Sterilität zu erhalten4. Die Prozessautomatisierung behebt auch das Problem der Skalierbarkeit, indem entweder mehrere Systeme parallel ausgeführt werden (Scale-out) oder die Verarbeitungskapazität eines einzelnen Geräts erhöht wird (Scale-up), wodurch die Variabilität zwischen den Operatoren minimiert wird. Darüber hinaus legt die Kostenmodellierungsanalyse autologer Therapiennahe, dass die Automatisierung die Herstellungskosten 5,6reduzieren kann. In einer autologen klinischen Stammzellstudie, in der eine automatisierte Fertigungsplattform verwendet wurde, wurde jedoch kein Kostenvorteil festgestellt7, was darauf hindeutet, dass der Kostenvorteil der Automatisierung vom einzelnen Herstellungsprozess abhängen kann.
Es gibt verschiedene Strategien, mit denen Automatisierung in einen bestehenden Fertigungsprozess eingeführt werden kann. Dies kann entweder durch die Implementierung einer vollständig integrierten Plattform oder einer modular enden basierten Verarbeitungskette erreicht werden. Es gibt mehrere voll integrierte Plattformen, die für die autologe Zellherstellung kommerziell erhältlich sind, wie CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) und Quantum (Terumo BCT). Diese integrierten Plattformen, die oft als "GMP-in-a-box" bezeichnet werden, haben geringe Anforderungen an die Infrastruktur und sind einfach zu bedienen. Die Fertigungskapazität eines vollständig integrierten Setups kann jedoch durch den an das System angeschlossenen Inkubator eingeschränkt werden. Beispielsweise ist die Kultivierungskapazität von Prodigy auf seine 400 ml Kammer8 begrenzt und die Quantum-Patrone hat eine begrenzunge Oberfläche von 2,1m2 (entspricht 120 T175-Kolben)7, was für Patienten, die höhere Zelldosenbenötigen, möglicherweisenicht ausreicht 9,10. Darüber hinaus haben Prodigy und Quantum ein gemeinsames Attribut, das ihre Verwendung einschränkt: Die Betriebseinheit wird während des gesamten Zellexpansionszeitraums von einer einzigen Charge nutzbesetzt, wodurch die Anzahl der Chargen begrenzt wird, die von jeder Einheit11hergestellt werden können. Der modulare Automatisierungsansatz besteht darin, eine Fertigungskette mit mehreren modularen Einheiten zu schaffen, die den kommerziellen Fertigungsprozess simuliert12,13. Dieser Ansatz, der das Kulturgerät vom Zellwaschgerät trennt, kann dadurch die Fertigungseffizienz maximieren. Ein ideales Verarbeitungsgerät wäre ein, das anpassungsfähig und skalierbar an Fertigungsanforderungen12ist.
Die CFC-Technologie (Counterflow Zentrifufugation), die bis in die 1970er Jahre zurückreicht, hat eine lange Geschichte in der Zellverarbeitung14. Es erreicht Zellkonzentration und Trennung durch Ausgleich der Zentrifugalkraft mit einer Gegenströmungskraft. Typischerweise tritt eine Zellsuspension vom schmalen Ende einer Zellkammer unter einer konstanten Durchflussrate ein, während sie einer Zentrifugalkraft ausgesetzt ist (Abbildung 1A). Der Fluss der Flüssigkeit wird in entgegengesetzter Richtung zur Fliehkraft ausgeübt. Dies wird als Gegenstromkraft bezeichnet, die einen Gradienten innerhalb der Zellkammer bildet. Die Gegenströmungskraft nimmt dann ab, wenn sich die Zellkammer von der Spitze der kegelförmigen Zellkammer wegweitet. Zellen mit höherer Dichte und größerem Durchmesser haben eine höhere Sedimentationsrate und erreichen so das Kraftgleichgewicht zur Spitze der kegelförmigen Zellkammer. Kleinere Partikel können das Gleichgewicht zur Basis der Kammer erreichen oder zu klein sein, um in der Kammer zurückgehalten zu werden und werden weggewaschen. Die FCKW-Technologie ist vor allem für ihre Anwendung in der Verarbeitung von Blutapherese-Produkten bekannt, wie die Isolierung von Monozyten für dendritische Zelltherapien15,16. Im Hinblick auf den Pufferaustausch wurde die FCKW-Technologie nur in der Großfertigung17 eingesetzt und muss noch für die kleinere Herstellung von autologen Zelltherapien eingesetzt werden.
Um dem Bedarf an einem geeigneten Gerät für die Herstellung kleiner Zellen gerecht zu werden, wurde kürzlich ein automatisiertes FCKW-Gerät (siehe Materialtabelle)entwickelt. Das automatisierte Zellverarbeitungsgerät nutzt die Gegenflusszentrifugationstechnologie, um Zellablagerungen zu entfernen und den Pufferaustausch zu erleichtern. Das Gerät führt einen Pufferaustausch mit einem Einweg-Kit durch, das steril mit einem Zelltransferbeutel verbunden werden kann, wodurch die Zellen in einem sterilen, geschlossenen System verarbeitet werden können. Hier untersuchen wir den Einsatz eines Gegenstromzentrifugalgeräts zur Durchführung eines Pufferaustauschs in Säugetierzellkulturen in automatisierten Protokollen. In dieser Studie testeten wir das Pufferaustauschprotokoll mit Jurkat-Zellen und mesenchymalen Stromalzellen (MSCs), um nicht haftende bzw. anhaftende Zelltypen zu modellieren. Jurkat-Zellen sind verewigte T-Zellen, die häufig für die Untersuchung der akuten T-Zell-Leukämie19,20verwendet werden. MSCs sind adulte Stammzellen, die in klinischen Studien am Menschen für eine Vielzahl von Krankheiten untersucht wurden9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 ml Luer lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>AUST R 46283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156477-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml IV saline bag</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>K690521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (Countess)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stimulation cocktail (500x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4970-93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfer bags</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>T1BBT060CBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Al221C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer (female) fittings</td>
			<td>CPC</td>
			<td>LF41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC laptop or PC tablet device</td>
			<td>ASUS</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (SpectraMax i3)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea single-use processing kit</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>420SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing

Eine erfolgreiche Kommerzialisierung von Gen- und zellbasierten Therapien erfordert kostengünstige und skalierbare Herstellungsprozesse. Pufferaustausch und Produktkonzentration sind wesentliche Komponenten für die meisten Fertigungsprozesse. In den frühen Stadien der Produktentwicklung werden diese Schritte jedoch häufig manuell ausgeführt. Die manuelle Sackgassenzentrifufugation für den Pufferaustausch ist arbeitsintensiv, kostspielig und nicht skalierbar. Ein geschlossenes automatisiertes System kann diesen mühsamen Schritt effektiv eliminieren, aber die Implementierung kann eine Herausforderung sein. Hier beschreiben wir ein neu entwickeltes Zellverarbeitungsgerät, das sich für die kleine bis mittlere Zellverarbeitung eignet und die Lücke zwischen manueller Verarbeitung und großflächiger Automatisierung überbrücken soll. Dieses Protokoll kann einfach auf verschiedene Zelltypen und Prozesse angewendet werden, indem die Durchflussrate und die Zentrifugationsgeschwindigkeit geändert werden. Unser Protokoll zeigte eine hohe Zellwiederherstellung mit kürzeren Verarbeitungszeiten im Vergleich zum manuellen Prozess. Zellen, die sich aus dem automatisierten Prozess erholten, hielten auch ihre Proliferationsraten aufrecht. Das Gerät kann als modulare Komponente in einem geschlossenen Fertigungsprozess eingesetzt werden, um Schritte wie Pufferaustausch, Zellformulierung und Kryokonservierung aufzunehmen.

In diesem Protokoll haben wir Jurkat-Zellen und MSCs als repräsentative Beispiele verwendet, um den automatisierten Pufferaustauschprozess zu demonstrieren. Während des Prozesses teilten Jurkat-Zellen und MSCs die gleichen Verarbeitungsschritte mit Unterschieden in der Zentrifugalkraft und Pumpengeschwindigkeit, die die Durchflussmenge steuern (Tabelle 1). Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder, die von der Kamera aufgenommen wurden, wie das wirbelgebundene Zellbett wäh...

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Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Automatisierung ist der Schlüssel zum Upscaling und Kostenmanagement in der Zellfertigung. Dieses Manuskript beschreibt den Einsatz eines Gegenstromzentrifugalzellverarbeitungsgeräts zur Automatisierung des Pufferaustauschs und der Zellkonzentrationsschritte für die kleinräumige Bioverarbeitung.

Automatisiertes Gegenstromzentrifugalsystem für die Kleinzellverarbeitung

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Dieses Protokoll bietet eine Lösung für den geschlossenen automatisierten Pufferaustausch und die Konzentration für die Herstellung kleiner Zellen. Wichtig ist, dass der Pufferaustausch mit einer hohen Rückgewinnung und einer Lieferung eines sehr kleinen Volumens konzentrierter Produkte durchgeführt werden kann. Neue Benutzer können Schwierigkeiten haben, alle Automatisierungsschritte zu befolgen.Das Programmieren dieser Schritte und das Durchführen von Testläufen mit Medium sind gute Möglichkeiten, sich mit dem Gerät vertraut zu machen. Bevor Sie mit dem Pufferaustausch beginnen, verwenden Sie in einem laminaren Strömungskopf der Klasse 2 eine Spritze und eine Nadeleinheit, um 50 Milliliter Saline-Lösung aus einem 500 Milliliter-Salinebeutel zu entfernen. Ersetzen Sie dieses Volumen durch 50 Milliliter 20% menschliches Serumalbumin, und ernten Sie die Zellen von Interesse aus ihren Kulturgefäßen.Verwenden Sie nach dem Zählen die Spritze, um die Zellen in einen Transferbeutel zu laden, und schließen Sie den Transferbeutel mit dem Luer-Schloss an ein Einweg-Verarbeitungskit an. Dann verbinden Sie den zuvor vorbereiteten Beutel mit Waschpuffer mit dem Einweg-Verarbeitungskit. Um einen automatisierten Pufferaustausch einzurichten, öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche des Geräts, und klicken Sie auf die Startschaltfläche.Klicken Sie auf neu, um ein neues Protokoll zu erstellen, und klicken Sie auf Diesteuerung, um die zu öffnenden und zu schließenden Ventile, die Zentrifugal- und Pumpengeschwindigkeiten, die Pumpenrichtung und die Aktionsauslöser auszuwählen. Wenn alle Parameter festgelegt wurden, klicken Sie auf Speichern. Hängen Sie die angeschlossenen entsprechenden Beutel auf das Gerät und legen Sie das Einweg-Verarbeitungskit auf die Maschine.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Verbinden und laden Sie das gespeicherte Programm herunter. Wenn die Wiedergabetaste leuchtet, kann das Protokoll gestartet werden. Um den automatisierten Pufferaustausch durchzuführen, öffnen Sie die manuellen Klemmen für den Transferbeutelschlauch, und klicken Sie auf Starten, um das Pufferaustauschprogramm zu initiieren.Am Ende des Automatisierungsschritts sechs wird der Prozess aufgrund der Auslösung des Blasensensors durch die Luft im nun leeren Beutel angehalten. Wenn die Tasche tatsächlich leer ist, drücken Sie neben, um den Vorgang zum nächsten Schritt zu verschieben. Wenn der automatisierte Prozess abgeschlossen ist, schließen Sie alle Rohrklemmen und öffnen Sie die Tür des Geräts.Entfernen Sie dann das Einweg-Kit aus dem Gerät und trennen Sie die Spritze, damit die Zellen für die nachfolgende Analyse gesammelt werden können. Typischerweise erscheint das wirbelierte Zellbett wie in diesem Bild dargestellt mit den Zellen, die sich in der Mitte und zur Vorderseite des Kegels ansammeln, einem kleinen Raum an der Spitze der Kammer, in dem sich die Zellen nicht ansammeln, und einer sichtbaren Öffnung innerhalb des Zelleinlasses. Das wirbelierte Zellbett kann komprimiert werden, wenn ein neuer Puffer eingeführt wird, der sich in einer anderen Viskosität oder Dichte befindet.Eine hohe Durchflussrate kann angewendet werden, um für lebende Zellen auszuwählen, da abgestorbene Zellen kleiner und leichter sind und durch Erhöhung der Durchflussrate aus der Kammer herausgedrängt werden können. Der automatisierte Prozess der Pufferaustauschverarbeitungszeit ist kürzer als der des manuellen Pufferaustauschprozesses. In dieser Analyse waren die Wiederherstellungsraten zwischen dem manuellen und dem automatisierten Prozess für beide getesteten Zelltypen ähnlich, und die Zelllebensfähigkeit wurde von keinem der beiden Prozesse beeinflusst.Die zurückgewonnenen Zellen zeigten ähnliche Proliferationsraten, Fähigkeiten zur Herstellung von Zytokinen und Ideo-Aktivitäten, unabhängig von der Art der Verarbeitung. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass dieses Protokoll nur als Richtlinie dient, und daher müssen Benutzer die Durchflussrate und Zentrifugationsgeschwindigkeit entsprechend ihrem Zelltyp und Puffer programmieren. Pufferaustausch ist ein Zwischenschritt in der Zellherstellung, der der Zellkulturexpansion oder Kryokonservierung und Formulierung folgen kann.Ziel ist es, Wege zu entwickeln, um den gesamten Prozess einzuschließen. Die Gegenflusszentrifufugation ist eine sehr vielseitige Plattform. Zukünftige Studien werden Anwendungen in der Zellauswahl untersuchen, wie z. B. die Entfernung von toten Zellen und die Mononukleuszellisolierung aus einem Chorisis-Produkt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Forschung

Biotechnik

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design und Implementierung eines automatisierten Illuminating, Anzucht und Probenahmesystem für Mikrobielle optogenetische Anwendungen

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatisierte Dia scannen und Segmentierung in Gewebekulturen beschriftet Gewebe mit einem Weitfeld High-Content Analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Pseudomonas Aeruginosa mit einem automatisierten höheren Durchsatz mikrofluidischen System Zelle Analyse der Schubspannung weiterleben

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...