Name: automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית התמיכה המבצעית של הממשלה הויקטוריאנית, ושובר הטכנולוגיה הממשלתית הויקטוריאנית שסיפק המחלקה לפיתוח כלכלי, משרות, תחבורה ומשאבים. RL היא המקבלת של מלגת פיתוח קריירה של מועצת הבריאות הלאומית והמחקר הרפואי. אל הוא המקבל של פרס לתארים מתקדמים באוסטרליה.

1. הכנת ריאגנטים ותאים להחלפת מאגר
<ol><li>הכן מאגרים (ראה טבלת חומרים) במכסה זרימה למינארי בדרגה 2. באמצעות מזרק מחט הרכבה, להסיר 50 mL של פתרון מלוחים משקית מלוחים 500 mL. להחליף את זה עם 50 mL של 20% סרום האדם (HSA) לעשות 2% HSA ב מלוחים, אשר ישמש את המאגר לשטוף.</li>
	<li>הסר את התאים מכלי התרבות ובצע ספ...

<ol>
	<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+1.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li><li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factories+of+the+future:+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here?.">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?.</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li><li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing.">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li><li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+cell-based+therapies:+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges.">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li><li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products.">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+2.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System.">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li><li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation:+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like?.">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li><li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stromal+Cells:+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities.">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li><li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+(CAR+T-Cells)+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry?.">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?.</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+automation+in+process+development,+manufacture+of+cell,+gene-based+therapies.">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture.">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li><li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+(CFCL/CCE).">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li><li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+(Elutra&#8482;)+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells.">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra&#8482;) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li><li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+(DC)+therapy:+Clinical+study.">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li><li>Whitford, W. G., Subramanian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).</li><li>. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH &amp; CONCENTRATION Available from: <a target="_blank" href="https://www.scinogy.com/projects">https://www.scinogy.com/projects</a> (2019)</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule.">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li><li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways.">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).</li><li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment.">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products.">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li><li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch.">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li><li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies.">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).</li><li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts.">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li><li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts:+a+preclinical+evaluation.">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li><li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+(Cx601)+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn's+disease:+a+phase+3+randomised,+double-blind+controlled+trial.">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia:+A+Safety+Study.">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li></ol>

פרוטוקול חילופי המאגרים האוטומטיים המתואר הוא פשוט וידידותי למשתמש. עם זאת, קיימים מספר צעדי מפתח בפרוטוקול זה הקריטיים ודורשים תשומת לב מיוחדת. בניסיון שלנו, בעת עיבוד תאים גדולים כגון MSCs (קוטר ממוצע 10 – 15 μm) כל הפעלה צריכה לכלול לפחות 1 x 107 תאים כדי להשיג שחזור תאים אופטימלי (<strong class...

הנוף של הרפואה המודרנית השתנה במהירות באמצעות ההתפתחויות האחרונות בגנים ובטיפולים מבוססי תא (GCT). כאחד התחומים הגדלים המהיר ביותר במחקר הטרנסלטיטי, המגזר GCT גם מתמודד עם אתגרים ייחודיים וחסרי תקדים. בנוסף התוצאות הקליניות חזקים, יעיל וחסכוני תהליכי הייצור חיוניים הצלחה מסחרית של GCT, אשר קשה במיוחד להשיג בקנה מידה קטן של ייצור1. עלות הזמן, העבודה, הבטחות איכות מוגדלים כאשר כל קבוצה של תאים מייצרת רק כמה מינונים עבור מטופל אחד במקום מאות או אלפים. בניגוד לטיפולים בתאי האלוגנאית בהם תהליכי הייצור הם יותר דומה לייצור של נוגדנים וחלבונים רקומביננטי, הטיפולים בתאי האוטוולוגי מיוצרים בדרך כלל כפעולות בקנה מידה קטן1. כתופעה חדשה יחסית בייצור ביופרמקולוגיה2, אפשרויות עיבוד תא בקנה מידה קטן מוגבלות כיום.
החלפת מאגר חיונית לייצור תאים. זהו אחד התהליכים במורד הזרם שבו התאים מוסרים ממדיית התרבות ומרוכז עבור קריוגנית או אינפוזיה. כיום, ייצור תאים בקנה מידה קטן מחיל לעתים קרובות תהליכים דומים לאלה בהגדרת המחקר האקדמי ומסתמך על חדרים נקיים מיוחדים כדי לשמור על עקרות3. תהליכי במורד הזרם ידני להשתמש בצנטריפוגות שחקן הראש כדי גלולה להשעות את התאים להפחתת נפח והחלפת מאגר. התהליכים הפתוחים הללו יקרים (כלומר, עבודה ותחזוקה בחדר נקי) ויש להם יכולת ייצור מוגבלת, שאינם אידיאליים לייצור מסחרי2,3.
יישום האוטומציה הוצע כפתרון לשיפור יעילות הייצור והשגת הפקות בקנה מידה מסחרי2. אין אפשרות להשיג עקרות במוצרים מבוססי-תא באמצעות שיטות מסורתיות המשמשות למוצרי ביולוגי, כגון הקרנה גאמה או סינון קצה מסוף. במקום זאת, מערכת סגורה אוטומטית נפרס כדי להפחית את הסיכונים של זיהום ואופרטורים המתבססים על חדרים נקיים כדי לשמור על עקרות4. אוטומציה של תהליך גם מטפלת בנושא המדרגיות על-ידי הפעלת מערכות מרובות הפועלות במקביל (היקף) או הגדלת קיבולת העיבוד של התקן בודד (היקף), אשר בתורו ממזער את השונות בין אופרטורים. יתרה מזאת, ניתוח מודל העלות של טיפולים עצמיים עולה כי אוטומציה עשויה להפחית את העלות של ייצור5,6. עם זאת, אין תועלת בעלות נמצא בתא גזע אוטוולוגי בניסוי קליני שבו פלטפורמת ייצור אוטומטית שימש7, רומז כי העלות היתרון של האוטומציה עשויה להיות תלויה בתהליך הייצור הפרטני.
קיימות אסטרטגיות שונות שבהן ניתן להציג אוטומציה בתהליך ייצור קיים. ניתן להשיג זאת גם על ידי יישום פלטפורמה משולבת מלאה או שרשרת עיבוד מודולרית מודולרי. קיימות מספר פלטפורמות משולבות באופן מלא הזמינות מסחרית עבור ייצור תאים אוטוולוגי, כגון הפלא של הדיג (Miltenyi Biotec), קוקון (ביוטכנולוגיה), ו קוונטום (טרמו BCT). פלטפורמות משולבות אלה, המתוארות לעתים קרובות כ-GMP-in-box, הן בעלי דרישות נמוכות לגבי תשתיות והן קלות לתפעול. עם זאת, יכולת הייצור של התקנה משולבת מלאה עשויה להיות מוגבלת על-ידי החממה המצורפת למערכת. לדוגמה, יכולת ה-culturing של הפרודיג'י מוגבלת לחדר 400 mL שלו8 ולמחסנית הקוונטית יש שטח מוגבל למשטח שהוגדר ל-2.1 m2 (שווה ערך ל 120 T175 מבחנות)7, שייתכן שלא יספיק למטופלים המחייבים מינונים גבוהים יותר של תאים9,10. בנוסף, הפלא והקוונטים יש תכונה נפוצה המגבילה את השימוש בהם: היחידה המבצעית מאוכלס על ידי קבוצה אחת של תאים לאורך תקופת התרחבות התא, ובכך להגביל את מספר הקבוצות שניתן לייצר על ידי כל יחידה11. הגישה המודולארית לאוטומציה היא יצירת שרשרת ייצור עם יחידות מודולריות מרובות המדמה את תהליך הייצור המסחרי12,13. גישה זו, אשר מפרידה את מכשיר התרבות ממכשיר הכביסה התא, יכול ובכך למקסם את יעילות הייצור. התקן עיבוד אידיאלי יהיה אחד כי הוא הסתגלות ומדרגי לייצור צרכים12.
הטכנולוגיה הצנטריפוגה (CFC), שתחילתה בשנות ה-70, היתה היסטוריה ארוכה בעיבוד תאים14. היא משיגה ריכוז והפרדה של תאים על-ידי איזון כוח צנטריפוגלי עם כוח זרימה נגדית. בדרך כלל, השעיית תא נכנס מהקצה הצר של תא התא תחת קצב זרימה קבוע תוך נתון לכוח צנטריפוגלי (איור 1א). זרימת הנוזל מופעל בכיוון ההפוך אל הכוח הצנטריפוגלי. הדבר נקרא כוח הזרימה הנגדית, היוצר מעבר צבע בתוך תא התא. כוח הזרימה הנגדית פוחת כאשר תא התא מתרחב מקצה תא התא המעוצב בצורת חרוט. תאים עם צפיפות גבוהה יותר קוטר גדול יותר יש קצב משקעי גבוה יותר, ולכן הם מגיעים כוח שיווי משקל לכיוון קצה של תא בצורת חרוט. חלקיקים קטנים יותר עלולים להגיע לשיווי האיזון כלפי בסיס החדר, או להיות קטנים מדי כדי להישמר בחדר והוא יישטף. הטכנולוגיה CFC ידועה בעיקר היישום שלה בעיבוד מוצרי apheresis כגון בידוד מונוציטים עבור טיפולים סלולריים הדנדריטים15,16. במונחים של חילופי מאגר, הטכנולוגיה CFC הוחלה רק בייצור בקנה מידה גדול17 ועדיין לשמש לייצור בקנה מידה קטן יותר של טיפולים אוטוולוגיים.
כדי לטפל בצורך בהתקן מתאים לייצור תאים בקנה מידה קטן, התקן CFC אוטומטי (ראה טבלת חומרים), פותח לאחרונה18. מכשיר העיבוד האוטומטי של התא משתמש בטכנולוגיה צנטריפוגה של זרימה נגדית כדי להסיר פסולת תאים ולהקל על החלפת מאגר. המכשיר מבצע חילופי מאגר עם ערכת שימוש יחיד שניתן לתקן באמצעות שקית העברת תאים, דבר המאפשר עיבוד תאים בתוך מערכת סטרילית ותחומה. כאן, אנו חוקרים את השימוש במכשיר מתקן צנטריפוגלי לבצע חילופי מאגרים בתרביות תאים של מיונקים בפרוטוקולים אוטומטיים. במחקר זה, בדקנו את פרוטוקול חילופי מאגר באמצעות תאים ויוקאט ותאי סטרומה mesenchymal (MSCs) כדי לדגמן סוגים שאינם מחסיד ותאי תאים, בהתאמה. התאים של ג'ורקאט הם תאים מונצח לעתים קרובות משמש למחקר של לוקמיה תא T חריפה19,20. MSCs הם תאי גזע למבוגרים אשר נחקרו בניסויים קליניים אנושיים עבור מגוון רחב של מחלות9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 ml Luer lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>AUST R 46283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156477-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml IV saline bag</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>K690521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (Countess)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stimulation cocktail (500x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4970-93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfer bags</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>T1BBT060CBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Al221C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer (female) fittings</td>
			<td>CPC</td>
			<td>LF41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC laptop or PC tablet device</td>
			<td>ASUS</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (SpectraMax i3)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea single-use processing kit</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>420SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing

מסחור מוצלח של גנים וטיפולים מבוססי תאים דורש תהליכי ייצור יעילים ומדרגיים. המרת מאגר וריכוז המוצר הם רכיבים חיוניים עבור רוב תהליכי הייצור. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פיתוח המוצר, שלבים אלה מבוצעים לעתים קרובות באופן ידני. צנטריפוגה מבוי סתום ידני עבור חילופי מאגרים היא אינטנסיבית לעבודה, יקרה ולא מדרגית. מערכת אוטומטית סגורה יכולה לבטל ביעילות את שלב העמל הזה, אך ההטמעה יכולה להיות מאתגרת. כאן, אנו מתארים מכשיר חדש לעיבוד תאים מפותח המתאים לעיבוד תאים קטנים עד בינונית בקנה מידה ומטרתו לגשר על הפער בין עיבוד ידני ואוטומציה בקנה מידה גדול. פרוטוקול זה ניתן להחיל בקלות על סוגי תאים שונים ותהליכים על ידי שינוי קצב הזרימה ומהירות צנטריפוגה. הפרוטוקול שלנו הפגין שחזור תאים גבוה עם זמני עיבוד קצרים בהשוואה לתהליך הידני. תאים ששוחזרו מהתהליך האוטומטי שמרו גם על שיעורי ההתפשטות שלהם. ניתן להחיל את ההתקן כרכיב מודולרי בתהליך ייצור סגור כדי להתאים לשלבים כגון חילופי מאגרים, ניסוח תאים והקפאה קריוגנית.

בפרוטוקול זה, השתמשנו בתאים של ג'ורקאט ובMSCs כדוגמאות מייצגות כדי להדגים את תהליך החלפת המאגר האוטומטי. במהלך התהליך, שיתפו התאים של ג'ורקאט ו-MSCs את אותם שלבי עיבוד עם הבדלים בכוח צנטריפוגלי ובמהירות המשאבה השולטים בקצב הזרימה (שולחן 1). איור 2 מראה תמונות הנציגה שנת?...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

אוטומציה היא המפתח לשינוי קנה מידה וניהול עלויות בייצור תאים. כתב יד זה מתאר את השימוש בהתקן זרימת תאים צנטריפוגליים לאוטומציה של החלפת מאגר ושלבי הריכוז של התא לצורך ביוביוטינג בקנה מידה קטן.

מערכת הזרמה אוטומטית לעיבוד תאים בקנה מידה קטן

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

פרוטוקול זה מספק פתרון לחילופי מאגרים אוטומטיים סגורים ולריכוז עבור ייצור תאים בקנה מידה קטן. חשוב לציין, חילופי חיץ הוא מסוגל להתבצע עם התאוששות גבוהה משלוח של נפח קטן מאוד של מוצר מרוכז. משתמשים חדשים עשויים להיאבק כדי לבצע את כל שלבי האוטומציה.תרגול תכנות שלבים אלה וביצוע ריצות בדיקה עם מדיום הן דרכים טובות להכיר את המכשיר. לפני תחילת חילופי החיץ, בדרגה 2 ראש זרימה למינארית, להשתמש מזרק ומחט הרכבה כדי להסיר 50 מיליליטר של תמיסת מלח משקית מלוחים 500 מיליליטר. החלף כרך זה ב-50 מיליליטר של אלבומין סרום אנושי של 20%, וקצר את תאי העניין מכלי התרבות שלהם.לאחר הספירה, השתמש במזרק כדי לטעון את התאים לתוך שקית העברה, ולהשתמש במנעול לולר כדי לחבר את תיק ההעברה ערכת עיבוד חד-שימושית. לאחר מכן חבר את השקית שהוכנה בעבר של מאגר לשטוף את ערכת עיבוד חד שימוש. כדי להגדיר חילופי מאגרים אוטומטיים, פתח את ממשק המשתמש הגרפי של ההתקן ולחץ על לחצן התחל.לחץ על חדש כדי ליצור פרוטוקול חדש, ולחץ על פקד כדי לבחור את השסתומים להיפתח ולסגור, מהירויות צנטריפוגלי ומשאבה, כיוון המשאבה, ואת הגורמים המפעילים פעולה. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על שמור. תלה את השקיות המתאימות המחוברות במכשיר והצב את ערכת העיבוד החד-פעמית במחשב.לאחר מכן לחץ על לחצן התחבר והורד את התוכנית השמורדת. כאשר לחצן ההפעלה נדלק, הפרוטוקול מוכן להפעלה. כדי לבצע את חילופי המאגר האוטומטיים, פתח את המהדקים הידניים עבור צינורות תיק ההעברה ולחץ על התחל כדי ליזום את תוכנית חילופי המאגרים.בסוף שלב אוטומציה שש, התהליך יושהה עקב הפעלת חיישן הבועה על ידי האוויר בשקית ריקה עכשיו. אם התיק אכן ריק, לחץ ליד כדי להעביר את התהליך לשלב הבא. לאחר סיום התהליך האוטומטי, סגור את כל מהדקי הצינורות ופתח את דלת ההתקן.לאחר מכן הסר את הערכה החד-שימושית מההתקן ונתק את המזרק כדי לאפשר איסוף של התאים לצורך ניתוח עוקב. בדרך כלל, מיטת התא הנוזלי תופיע כמיוצגות בתמונה זו כאשר התאים מצטברים באמצע ולכיוון חזית הקונוס, חלל קטן בקצה התא שבו התאים אינם מצטברים ופתח גלוי בתוך תא טעינת הכניסה. המיטה הסלולרית הנוזלית עשויה להיות דחוסה בעת הצגת מאגר חדש כי הוא צמיגות שונה או צפיפות.קצב זרימה גבוה עשוי להיות מיושם כדי לבחור עבור תאים חיים כמו תאים מתים הם קטנים וקלים יותר והוא יכול להיות נאלץ לצאת מהתא על ידי הגדלת קצב הזרימה. התהליך האוטומטי של זמן העיבוד של חילופי מאגרים קצר יותר מזה של תהליך חילופי המאגר הידני. בניתוח זה, שיעורי השחזור בין המדריך לתהליכים האוטומטיים היו דומים עבור שני סוגי התאים שנבדקו, וכדאיות התא לא הושפעה משני התהליכים.התאים שנמצאו הפגינו שיעורי התפשטות דומים, יכולות לייצר ציטוקינים ופעילויות איידיאו, ללא קשר לסוג העיבוד. חשוב לזכור כי פרוטוקול זה משמש רק כקווי מנחה, ולכן משתמשים צריכים לתכנת את קצב הזרימה ואת מהירות הצנטריפוגה בהתאם לסוג התא והמאגר שלהם. חילופי מאגרים הם שלב ביניים בייצור תאים שעשויים לעקוב אחר הרחבת תרבות התאים או הקפאה וניסוח.המטרה היא לפתח דרכים להקיף את התהליך כולו. צנטריפוגה נגדית היא פלטפורמה רב-תכליתית מאוד. מחקרים עתידיים יחקרו יישומים בבחירת תאים, כגון הסרת תאים מתים ובידוד תאי מונונוקלוס ממוצר chorisis.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Postproduction עיבוד Fibres Electrospun עבור הנדסת רקמות

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

האוטומטי לחלוטין צנטריפוגלי Microfluidic מכשיר לגילוי חלבון רגיש מן הדם מלא

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

סריקת שקופיות אוטומטיים, פילוח ברקמות שכותרתו Fluorescently באמצעות מערכת ניתוח Widefield גבוהה-תוכן

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

השימוש תפוקה גבוהה אוטומטית Microbioreactor מערכת לייצור של מודל IgG1 בתאים צ'ו

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

חיים תא ניתוח של גזירה על Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת אוטומטית Microfluidic תפוקה גבוהה

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

טיהור וניתוח של נוגדן חד שבטיים מן הסינית שחלות אוגר תאים באמצעות מערכת Microbioreactor חקן אוטומטי

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...