Name: automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Questo lavoro è supportato dal programma operativo di supporto alle infrastrutture del governo vittoriano e dal voucher tecnologico del governo vittoriano fornito dal Dipartimento di Sviluppo Economico, Lavoro, Trasporti e Risorse. RL è il destinatario di una borsa di studio national Health and Medical Research Council Career Developmentship. AL ha ricevuto un Australian Postgraduate Award.

1. Preparazione di reagenti e celle per lo scambio di buffer
<ol><li>Preparare i buffer (vedere Tabella dei materiali) in una cappa di flusso laminare di classe 2. Utilizzando un assemblaggio di siringhe e aghi, rimuovere 50 mL di soluzione salina da un sacchetto salina da 500 mL. Sostituirlo con 50 mL di 20% di albumina di siero umano (HSA) per fare 2% HSA in salina, che servirà come buffer di lavaggio.</li>
	<li>Rimuovere le cellule dai vasi di coltura ed eseguire un conteggio delle cellule per dete...

<ol>
	<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+1.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li><li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factories+of+the+future:+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here?.">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?.</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li><li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing.">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li><li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+cell-based+therapies:+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges.">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li><li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products.">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+2.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System.">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li><li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation:+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like?.">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li><li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stromal+Cells:+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities.">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li><li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+(CAR+T-Cells)+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry?.">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?.</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+automation+in+process+development,+manufacture+of+cell,+gene-based+therapies.">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture.">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li><li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+(CFCL/CCE).">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li><li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+(Elutra&#8482;)+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells.">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra&#8482;) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li><li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+(DC)+therapy:+Clinical+study.">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li><li>Whitford, W. G., Subramanian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).</li><li>. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH &amp; CONCENTRATION Available from: <a target="_blank" href="https://www.scinogy.com/projects">https://www.scinogy.com/projects</a> (2019)</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule.">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li><li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways.">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).</li><li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment.">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products.">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li><li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch.">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li><li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies.">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).</li><li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts.">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li><li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts:+a+preclinical+evaluation.">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li><li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+(Cx601)+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn's+disease:+a+phase+3+randomised,+double-blind+controlled+trial.">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia:+A+Safety+Study.">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li></ol>

Il protocollo di scambio automatico del buffer descritto è semplice e facile da usare. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi chiave in questo protocollo che sono critici e richiedono particolare attenzione. Nella nostra esperienza, durante l'elaborazione di celle più grandi come MSC (diametro medio 10-15 m) ogni esecuzione dovrebbe includere almeno 1 x 107 celle per ottenere un recupero ottimale delle cellule (Figura 4B). L'elaborazione di celle più piccole, come l...

Il panorama della medicina moderna si è rapidamente trasformato attraverso recenti sviluppi nelle terapie geniche e basate sulle cellule (GCT). Essendo uno dei settori in più rapida crescita nella ricerca traslazionale, anche il settore GCT si trova ad affrontare sfide uniche e senza precedenti. Oltre ai solidi risultati clinici, processi di produzione efficienti ed efficienti in termini di costi sono essenziali per il successo commerciale della GCT, che è particolarmente difficile da ottenere nella produzione su piccola scala1. Il costo del tempo, del lavoro e delle garanzie di qualità sono amplificati quando ogni lotto di cellule produce solo poche dosi per un paziente invece di centinaia o migliaia. A differenza delle terapie alle cellule allogeniche in cui i processi di produzione sono più simili alla produzione di anticorpi e proteine ricombinanti, le terapie cellulari autologhe sono tipicamente prodotte come operazioni su piccola scala1. Come fenomeno relativamente nuovo nella produzione biofarmaceutica2, le opzioni per l'elaborazione cellulare su piccola scala sono attualmente piuttosto limitate.
Lo scambio di buffer è essenziale per la produzione di cellule. È uno dei processi a valle in cui le cellule vengono rimosse dai mezzi di coltura e concentrate per la crioconservazione o l'infusione. Attualmente, la produzione di cellule su piccola scala spesso applica processi simili a quelli dell'ambito di ricerca accademica e si basa su camere pulite specializzate per mantenere la sterilità3. I processi manuali a valle spesso utilizzano centrifughe da banco per pellet e resospendere le celle per la riduzione del volume e lo scambio di buffer. Questi processi aperti sono costosi (ad esempio, manodopera e manutenzione delle camere pulite) e hanno una capacità di produzione limitata, che non sono ideali per la produzione commerciale2,3.
L'implementazione dell'automazione è stata proposta come soluzione per migliorare l'efficienza produttiva e realizzare produzioni su scala commerciale2. La sterilità non può essere raggiunta nei prodotti a base di cellule attraverso metodi tradizionali utilizzati per i biologici, come l'irradiazione gamma o la filtrazione terminale. Viene invece implementato un sistema chiuso automatizzato per ridurre i rischi di contaminazione e gli operatori si affidano a camere pulite per mantenere la sterilità4. L'automazione dei processi risolve anche il problema della scalabilità con più sistemi in esecuzione in parallelo (scalabilità orizzontale) o aumentando la capacità di elaborazione di un singolo dispositivo (scalabilità verticale), che a sua volta riduce al minimo la variabilità tra gli operatori. Inoltre, l'analisi di modellazione dei costi delle terapie autologhe suggerisce che l'automazione può ridurre il costo della produzione5,6. Tuttavia, nessun vantaggio in termini di costi è stato riscontrato in uno studio clinico sulle cellule staminali autologhe in cui è stata utilizzata una piattaforma di produzione automatizzata7, suggerendo che il vantaggio in termini di costi dell'automazione può dipendere dal singolo processo di produzione.
Esistono diverse strategie in cui l'automazione può essere introdotta in un processo di produzione esistente. Ciò può essere ottenuto implementando una piattaforma completamente integrata o una catena di elaborazione modulare. Ci sono diverse piattaforme completamente integrate disponibili in commercio per la produzione di cellule autologhe, come CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) e Quantum (Terumo BCT). Queste piattaforme integrate, che sono spesso descritte come "GMP-in-a-box", hanno basse esigenze di infrastruttura e sono facili da usare. Tuttavia, la capacità di produzione di un setup completamente integrato può essere limitata dall'incubatore collegato al sistema. Ad esempio, la capacità di coltura di Prodigy è limitata alla sua camera8 da 400 mL e la cartuccia Quantum ha una superficie limitante impostata su 2,1 m2 (equivalente a 120 flaconi T175)7, che potrebbe non essere sufficiente per i pazienti che richiedono dosi cellulari più elevate9,10. Inoltre, Prodigy e Quantum hanno un attributo comune che ne limita l'uso: l'unità operativa è occupata da un singolo lotto di celle durante il periodo di espansione delle celle, limitando così il numero di lotti che possono essere prodotti da ogni unità11. L'approccio modulare all'automazione è quello di creare una catena di produzione con più unità modulari che simula il processo di produzione commerciale12,13. Questo approccio, che separa il dispositivo di coltura dal dispositivo di lavaggio cellulare, può quindi massimizzare l'efficienza di produzione. Un dispositivo di lavorazione ideale sarebbe uno che è adattabile e scalabile alle esigenze di produzione12.
La tecnologia della centrifugazione antistante (CFC), che risale agli anni '70, ha avuto una lunga storia nell'elaborazione cellulare14. Raggiunge la concentrazione e la separazione delle cellule bilanciando la forza centrifuga con una forza di controflusso. In genere, una sospensione cellulare entra dall'estremità stretta di una camera cellulare sotto una portata costante mentre è soggetta a una forza centrifuga (Figura 1A). Il flusso del fluido viene esercitato nella direzione opposta alla forza centrifuga. Questa è indicata come forza di controflusso, che forma un gradiente all'interno della camera cellulare. La forza di controflusso diminuisce man mano che la camera cellulare si allarga dalla punta della camera cellulare a forma di cono. Le cellule con una maggiore densità e un diametro maggiore hanno un tasso di sedimentazione più elevato, e quindi raggiungono l'equilibrio della forza verso la punta della camera cellulare a forma di cono. Le particelle più piccole possono raggiungere l'equilibrio verso la base della camera o essere troppo piccole per essere mantenute nella camera e saranno lavate via. La tecnologia CFC è principalmente conosciuta per la sua applicazione nella lavorazione di prodotti di aferesi del sangue, come l'isolamento di monociti per terapie cellulari dendritiche15,16. In termini di scambio di buffer, la tecnologia CFC è stata applicata solo nella produzione su larga scala17 e deve ancora essere utilizzata per la produzione su scala più piccola di terapie cellulari autologhe.
Per rispondere alla necessità di un dispositivo adatto per la produzione di celle su piccola scala, è stato recentemente sviluppato18un dispositivo CFC automatizzato (vedere Tabella dei materiali). Il dispositivo di elaborazione cellulare automatizzato utilizza la tecnologia di centrifugazione del controflusso per rimuovere i detriti cellulari e facilitare lo scambio di buffer. Il dispositivo esegue lo scambio di buffer con un kit monouso che può essere sterile a un sacchetto di trasferimento cellulare, che consente alle cellule di essere elaborate all'interno di un sistema sterile e chiuso. In questo caso, esaminiamo l'uso di un dispositivo centrifugo a controflusso per eseguire lo scambio di buffer nelle colture cellulari dei mammiferi in protocolli automatizzati. In questo studio, abbiamo testato il protocollo di scambio tampone utilizzando cellule Jurkat e cellule stromali mesenchymale (MSC) per modellare i tipi di cellule non aderenti e aderenti, rispettivamente. Le cellule giurate sono cellule T immortalate spesso utilizzate per lo studio della leucemia acuta delle cellule T19,20. Le MSC sono cellule staminali adulte che sono state studiate negli studi clinici umani per una vasta gamma di malattie9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 ml Luer lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>AUST R 46283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156477-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml IV saline bag</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>K690521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (Countess)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stimulation cocktail (500x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4970-93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfer bags</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>T1BBT060CBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Al221C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer (female) fittings</td>
			<td>CPC</td>
			<td>LF41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC laptop or PC tablet device</td>
			<td>ASUS</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (SpectraMax i3)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea single-use processing kit</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>420SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing

Una commercializzazione efficace delle terapie geniche e basate sulle cellule richiede processi di produzione convenienti e scalabili. Lo scambio di buffer e la concentrazione dei prodotti sono componenti essenziali per la maggior parte dei processi di produzione. Tuttavia, nelle prime fasi dello sviluppo del prodotto, questi passaggi vengono spesso eseguiti manualmente. La centrifugazione manuale senza uscita senza uscita per lo scambio di buffer è laboriosa, costosa e non scalabile. Un sistema automatizzato chiuso può eliminare efficacemente questo laborioso passo, ma l'implementazione può essere difficile. Qui, descriviamo un dispositivo di elaborazione cellulare di recente sviluppo che è adatto per l'elaborazione di celle su piccola e media scala e mira a colmare il divario tra l'elaborazione manuale e l'automazione su larga scala. Questo protocollo può essere facilmente applicato a vari tipi di cellule e processi modificando la portata e la velocità di centrifugazione. Il nostro protocollo ha dimostrato un elevato recupero cellulare con tempi di elaborazione più brevi rispetto al processo manuale. Anche le cellule recuperate dal processo automatizzato hanno mantenuto i loro tassi di proliferazione. Il dispositivo può essere applicato come componente modulare in un processo di produzione chiuso per adattarsi a passaggi come lo scambio di buffer, la formulazione delle cellule e la crioconservazione.

In questo protocollo, abbiamo usato le celle Jurkat e MSC come esempi rappresentativi per dimostrare il processo di scambio automatico del buffer. Durante il processo, le cellule Jurkat e le MSC condividevano le stesse fasi di lavorazione con differenze di forza centrifuga e velocità di pompaggio che controllano la portata (Tabella 1). La figura 2 mostra le immagini rappresentative catturate dalla fotocamera di come può apparire il letto cellulare fluido durante il process...

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Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

L'automazione è fondamentale per la scalabilità e la gestione dei costi nella produzione di celle. Questo manoscritto descrive l'uso di un dispositivo di elaborazione cellulare centrifuga controil flusso per automatizzare lo scambio di buffer e le fasi di concentrazione cellulare per il bioprocesso su piccola scala.

Sistema automatizzato di centrifuga controflusso per l'elaborazione di celle su piccola scala

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Questo protocollo fornisce una soluzione per lo scambio e la concentrazione di buffer automatizzati chiusi per la produzione di celle su piccola scala. È importante sottolineare che lo scambio tampone può essere eseguito con un elevato recupero e una consegna di un volume molto piccolo di prodotto concentrato. I nuovi utenti potrebbero avere difficoltà a seguire tutti i passaggi di automazione.Praticare la programmazione di questi passaggi ed eseguire esecuzioni di test con mezzi sono buoni modi per familiarizzare con il dispositivo. Prima di iniziare lo scambio tampone, in una testa di flusso laminare di classe due, utilizzare un gruppo di siringhe e aghi per rimuovere 50 millilitri di soluzione salina da un sacchetto salino da 500 millilitri. Sostituire questo volume con 50 millilitri di albumina di siero umano al 20% e raccogliere le cellule di interesse dai loro vasi di coltura.Dopo il conteggio, utilizzare la siringa per caricare le celle in un sacchetto di trasferimento e utilizzare la serratura Luer per collegare la borsa di trasferimento a un kit di elaborazione monouso. Quindi collegare il sacchetto di tampone di lavaggio precedentemente preparato al kit di elaborazione singolo. Per configurare uno scambio automatico di buffer, aprire l'interfaccia utente grafica del dispositivo e fare clic sul pulsante start.Fare clic su nuovo per creare un nuovo protocollo e fare clic sul controllo per selezionare le valvole da aprire e chiudere, le velocità centrifughe e della pompa, la direzione della pompa e i trigger di azione. Una volta impostati tutti i parametri, fare clic su Salva. Appendere i sacchetti appropriati collegati sul dispositivo e posizionare il kit di elaborazione monouso sulla macchina.Quindi fare clic sul pulsante di connessione e scaricare il programma salvato. Quando il pulsante di riproduzione si accende, il protocollo è pronto per essere avviato. Per eseguire lo scambio automatico del buffer, aprire i morsetti manuali per il tubo del sacchetto di trasferimento e fare clic su Avvia per avviare il programma di scambio del buffer.Al termine della fase sei dell'automazione, il processo si fermerà a causa dell'attivazione del sensore a bolle da parte dell'aria nella borsa ora vuota. Se la borsa è effettivamente vuota, premere accanto per spostare il processo al passaggio successivo. Al termine del processo automatizzato, chiudere tutti i morsetti dei tubi e aprire la porta del dispositivo.Quindi rimuovere il kit monouso dal dispositivo e scollegare la siringa per consentire la raccolta delle cellule per un'analisi successiva. Tipicamente, il letto cellulare fluidizzato apparirà come rappresentato in questa immagine con le cellule che si accumulano al centro e verso la parte anteriore del cono, un piccolo spazio sulla punta della camera in cui le cellule non si accumulano e un'apertura visibile all'interno dell'ingresso di caricamento della cella. Il letto cellulare fluido può essere compresso quando si introduce un nuovo tampone che si trova a una viscosità o densità diversa.Una portata elevata può essere applicata per selezionare le cellule vive poiché le cellule morte sono più piccole e leggere e possono essere forzate fuori dalla camera aumentando la portata. Il processo automatizzato di elaborazione dello scambio di buffer è inferiore a quello del processo di scambio manuale del buffer. In questa analisi, i tassi di recupero tra il processo manuale e quello automatizzato erano simili per entrambi i tipi di celle testate e la vitalità cellulare non era influenzata da nessuno dei due processi.Le cellule recuperate hanno dimostrato tassi di proliferazione simili, capacità di produrre citochine e ideo-attività, indipendentemente dal tipo di lavorazione. È importante ricordare che questo protocollo serve solo come linea guida, e quindi gli utenti devono programmare la portata e la velocità di centrifugazione in base al tipo di cella e al buffer. Lo scambio tampone è un passaggio intermedio nella produzione cellulare che può seguire l'espansione della coltura cellulare o la crioconservazione e la formulazione.L'obiettivo è quello di sviluppare modi per racchiudere l'intero processo. La centrifugazione a controflusso è una piattaforma molto versatile. Studi futuri esploreranno le applicazioni nella selezione cellulare, come la rimozione di cellule morte e l'isolamento delle cellule mononucleo da un prodotto di coriasi.

Research

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