Name: automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Dette arbeidet er støttet av den viktorianske regjeringens operative infrastruktur support program, og den viktorianske regjeringen teknologi voucher levert av Institutt for økonomisk utvikling, Jobs, transport og ressurser. RL er mottaker av en National Health and Medical Research Council Career Development Fellowship. AL er mottaker av en australsk Postgraduate Award.

1. utarbeidelse av reagenser og celler for buffer utveksling
<ol><li>Klargjør buffere (se tabell over materialer) i en klasse 2 laminær Flow Hood. Ved hjelp av en sprøyte og nål montering, Fjern 50 mL saltoppløsning fra en 500 mL saltvanns pose. Erstatt dette med 50 mL av 20% humant serum albumin (HSA) å gjøre 2% HSA i saltvann, som vil tjene som vaskebuffer.</li>
	<li>Fjern cellene fra kultur fartøyene og utfør en celle telling for å bestemme Start celle antallet og levedyktigheten ved å tr...

<ol>
	<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+1.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li><li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factories+of+the+future:+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here?.">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?.</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li><li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing.">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li><li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+cell-based+therapies:+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges.">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li><li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products.">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+2.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System.">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li><li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation:+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like?.">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li><li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stromal+Cells:+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities.">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li><li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+(CAR+T-Cells)+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry?.">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?.</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+automation+in+process+development,+manufacture+of+cell,+gene-based+therapies.">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture.">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li><li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+(CFCL/CCE).">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li><li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+(Elutra&#8482;)+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells.">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra&#8482;) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li><li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+(DC)+therapy:+Clinical+study.">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li><li>Whitford, W. G., Subramanian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).</li><li>. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH &amp; CONCENTRATION Available from: <a target="_blank" href="https://www.scinogy.com/projects">https://www.scinogy.com/projects</a> (2019)</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule.">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li><li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways.">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).</li><li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment.">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products.">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li><li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch.">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li><li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies.">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).</li><li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts.">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li><li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts:+a+preclinical+evaluation.">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li><li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+(Cx601)+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn's+disease:+a+phase+3+randomised,+double-blind+controlled+trial.">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia:+A+Safety+Study.">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li></ol>

Den automatiserte buffer utveksling protokollen er beskrevet er enkel og brukervennlig. Likevel er det noen viktige trinn i denne protokollen som er kritiske og krever spesiell oppmerksomhet. I vår erfaring, når du behandler større celler som MSCs (gjennomsnittlig diameter 10 – 15 μm) hver kjøre bør inneholde minst 1 x 107 celler for å oppnå optimal celle utvinning (Figur 4B). Behandling av mindre celler, for eksempel Jurkat celler (gjennomsnitt ~ 10 μm...

Landskapet av moderne medisin har forvandlet raskt gjennom den siste utviklingen i genet og celle-baserte terapier (GCT). Som en av de raskest voksende feltene innen translational forskning, står GCT-sektoren også overfor unike og enestående utfordringer. I tillegg til robuste kliniske utfall er effektive og kostnadseffektive produksjonsprosesser avgjørende for den kommersielle suksessen til GCT, noe som er spesielt vanskelig å oppnå i småskala produksjon1. Kostnaden for tid, arbeid og kvalitet forsikringer er forstørret når hver gruppe av celler bare produserer noen få doser for en pasient i stedet for hundrevis eller tusenvis. I motsetning til allogene celle terapier der produksjonsprosessene er mer beslektet med produksjonen av antistoffer og rekombinant proteiner, er autologous celle terapier vanligvis produsert som småskala operasjoner1. Som et relativt nytt fenomen i biofarmasøytisk produksjon2, alternativer for småskala celle behandling er for tiden ganske begrenset.
Buffer utveksling er viktig for celle produksjon. Det er en av de nedstrøms prosesser der cellene er fjernet fra kultur Media og konsentrert for kryonisk bevaring eller infusjon. For tiden gjelder småskala celle produksjon ofte prosesser som ligner på de i akademisk forskning innstillingen og er avhengig av spesialiserte rene rom for å opprettholde sterilitet3. Manuelle nedstrøms prosesser bruker ofte stasjonære sentrifuger til pellets og resuspend celler for volumreduksjon og buffer utveksling. Disse åpne prosessene er kostbare (dvs. arbeid og ren rom vedlikehold) og har begrenset produksjonskapasitet, som ikke er ideelle for kommersiell produksjon2,3.
Implementering av automatisering har blitt foreslått som en løsning for å forbedre produksjonseffektiviteten og oppnå kommersielle skala produksjoner2. Sterilitet kan ikke oppnås i celle-baserte produkter gjennom tradisjonelle metoder som brukes for biologiske, som gamma bestråling eller Terminal end filtrering. I stedet distribueres et automatisert lukket system for å redusere risikoen for forurensning og operatører som er avhengige av rene rom for å opprettholde sterilitet4. Prosessautomatisering løser også problemet med skalerbarhet ved at du enten har flere systemer som kjører parallelt (skalering) eller øker Prosesseringskapasiteten til en individuell enhet (oppskalering), noe som igjen minimerer variasjonen mellom operatørene. Dessuten antyder kostnads modellerings analyse av autologous behandling at automatisering kan redusere kostnadene ved produksjon5,6. Imidlertid ble det ikke funnet noen kostnadsfordel i en klinisk studie av autologous stamceller der en automatisert produksjonsplattform ble brukt7, noe som tyder på at kostnadsfordelen ved automatisering kan avhenge av den enkelte produksjonsprosessen.
Det finnes ulike strategier der automatisering kan innføres i en eksisterende produksjonsprosess. Dette kan oppnås enten ved å implementere en fullt integrert plattform eller en modulær-basert prosesskjede. Det finnes flere fullt integrerte plattformer kommersielt tilgjengelig for autologous celle produksjon, for eksempel CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (oktan Biotech), og Quantum (TERUMO BCT). Disse integrerte plattformene, som ofte beskrives som "GMP-in-a-Box", har lave krav til infrastruktur og er enkle å betjene. Produksjonskapasiteten til et fullt integrert oppsett kan imidlertid begrenses av inkubator festet til systemet. For eksempel, den dyrking kapasitet vidunderbarn er begrenset til sin 400 ml kammer8 og Quantum kassetten har en begrensende areal satt til 2,1 m2 (tilsvarende 120 T175 flasker)7, som kanskje ikke er tilstrekkelig for pasienter som krever høyere celle doser9,10. I tillegg har Prodigy og Quantum en felles egenskap som begrenser deres bruk: den operative enheten er okkupert av en enkelt gruppe med celler i hele celle Utvidelses perioden, og dermed begrense antall partier som kan produseres av hver enhet11. Den modulære tilnærmingen til automatisering er å opprette en produksjons kjede med flere modulære enheter som simulerer den kommersielle produksjonsprosessen12,13. Denne tilnærmingen, som skiller kulturen enheten fra cellen vaskemaskin, kan dermed maksimere produksjonseffektivitet. En ideell prosesseringsenhet vil være en som er tilpasningsdyktig og skalerbar til produksjon behov12.
Motstrøm sentrifugering (CFC) teknologi, som dateres tilbake til 1970-tallet, har hatt en lang historie i celle prosessering14. Den oppnår celle konsentrasjon og separasjon ved å balansere sentrifugalkraften med en motstrøm kraft. Vanligvis kommer en celle suspensjon fra den smale enden av en celle kammer under en konstant strømningshastighet mens utsatt for en sentrifugalkraft (figur 1a). Flyten av væsken utøves i motsatt retning av sentrifugalkraften. Dette kalles motstrøm kraft, som danner en gradient i celle kammeret. Den motstrøm kraften synker da celle kammeret utvider seg bort fra tuppen av membran-formede celle kammeret. Celler med høyere tetthet og større diameter har en høyere sedimentering hastighet, og dermed de når styrke likevekt mot spissen av kjegle-formede celle kammeret. Mindre partikler kan nå likevekt mot bunnen av kammeret eller være for liten til å bli beholdt i kammeret og vil bli vasket bort. Den CFC teknologien er mest kjent for sin anvendelse i behandling av blod aferese produkter, for eksempel isolere monocytter for dendrittiske celle terapi15,16. Når det gjelder buffer utveksling, har CFC-teknologien bare blitt anvendt i Storskalaproduksjon17 og har ennå ikke blitt brukt for mindre skala produksjon av autologous celle terapier.
For å møte behovet for en egnet enhet for småskala celle produksjon, en automatisert CFC enhet (se tabell over materialer), ble nylig utviklet18. Det automatisert cellen bearbeiding apparat bruker motstrøm sentrifugering teknologien å fjerne cellen rusk og Letter buffer bytte. Enheten utfører buffer utveksling med en enkelt-bruk kit som kan være sterile-koblet til en celle overføring bag, som gjør at cellene skal behandles i et sterilt, lukket system. Her undersøker vi bruken av en motstrøm sentrifugal anordning for å utføre buffer utveksling i pattedyr cellekulturer i automatiserte protokoller. I denne studien, testet vi buffer utvekslings protokoll bruker Jurkat celler og mesenchymal stromal celler (MSCs) til modell nonadherent og tilhenger celletyper, henholdsvis. Jurkat celler er udødeliggjort T celler som ofte brukes til studiet av akutt T celle leukemi19,20. MSCs er voksne stamceller som har blitt studert i Human kliniske studier for et bredt spekter av sykdommer9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 ml Luer lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>AUST R 46283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156477-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml IV saline bag</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>K690521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (Countess)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stimulation cocktail (500x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4970-93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfer bags</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>T1BBT060CBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Al221C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer (female) fittings</td>
			<td>CPC</td>
			<td>LF41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC laptop or PC tablet device</td>
			<td>ASUS</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (SpectraMax i3)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea single-use processing kit</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>420SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing

Vellykket kommersialisering av gen-og cellebasert behandling krever produksjonsprosesser som er kostnadseffektive og skalerbare. Buffer utveksling og produkt konsentrasjon er vesentlige komponenter for de fleste produksjonsprosesser. I de tidlige stadiene av produktutviklingen utføres imidlertid disse trinnene ofte manuelt. Manuelle Dead-End-sentrifugering for buffer utveksling er arbeidsintensiv, kostbar og ikke skalerbar. Et lukket, automatisert system kan effektivt eliminere dette arbeidskrevende trinnet, men implementeringen kan være utfordrende. Her beskriver vi en nyutviklet celle prosessering enhet som er egnet for små og mellom store celle prosessering og har som mål å bygge bro over gapet mellom manuell prosessering og stor skala automatisering. Denne protokollen kan enkelt brukes på ulike celletyper og prosesser ved å endre strømningshastighet og sentrifugering hastighet. Vår protokoll demonstrerte høy celle gjenvinning med kortere behandlingstid i forhold til den manuelle prosessen. Celler utvinnes fra den automatiserte prosessen også opprettholdt deres spredning priser. Enheten kan brukes som en modulær komponent i en lukket produksjonsprosess for å imøtekomme trinn som buffer utveksling, celle formulering og kryonisk bevaring.

I denne protokollen, brukte vi Jurkat celler og MSCs som representative eksempler for å demonstrere automatiserte buffer utveksling prosessen. Under prosessen delte Jurkat celler og MSCs de samme behandlingstrinnene med forskjeller i sentrifugalkraften og pumpehastigheten som styrer strømningshastigheten (tabell 1). Figur 2 viser representative bilder tatt av kameraet på hvordan fluidisert celle seng kan vises under buffer utvekslings prosessen. Vanligvis vil fluidisert c...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Automatisering er nøkkelen til oppskalering og kostnadsstyring i celle produksjon. Dette manuskriptet beskriver bruken av en motstrøm sentrifugal celle prosesserings anordning for automatisering av buffer utveksling og celle konsentrasjons trinn for småskala bioprosessering.

Automatisert motstrøm sentrifugal system for småskala celle behandling

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Denne protokollen gir en løsning for lukket automatisert bufferutveksling og konsentrasjon for småskala celleproduksjon. Viktigere, bufferutvekslingen er i stand til å utføres med høy gjenoppretting og levering av et svært lite volum konsentrert produkt. Nye brukere kan slite med å følge alle automatiseringstrinnene.Å praktisere programmering av disse trinnene og utføre testkjøringer med medium er gode måter å bli kjent med enheten på. Før du begynner bufferutvekslingen, bruk en sprøyte og nåleenhet i klasse to til å fjerne 50 milliliter saltoppløsning fra en saltvannspose på 500 milliliter. Erstatt dette volumet med 50 milliliter på 20% humant serumalbumin, og høst cellene av interesse fra deres kulturkar.Etter telling, bruk sprøyten til å laste cellene inn i en overføringspose, og bruk Luer-låsen til å koble overføringsposen til et engangsbehandlingssett. Koble deretter den tidligere tilberedte posen med vaskebuffer til engangsbehandlingssettet. Hvis du vil konfigurere en automatisk bufferutveksling, åpner du det grafiske brukergrensesnittet til enheten og klikker startknappen.Klikk ny for å opprette en ny protokoll, og klikk kontroll for å velge ventilene som skal åpnes og lukkes, sentrifugal- og pumpehastighetene, pumperetningen og handlingsutløserne. Når alle parameterne er angitt, klikker du lagre. Heng de tilkoblede passende posene på enheten, og plasser engangsbehandlingssettet på maskinen.Klikk deretter på koble til-knappen og last ned det lagrede programmet. Når avspillingsknappen lyser, er protokollen klar til å startes. Hvis du vil utføre den automatiske bufferutvekslingen, åpner du de manuelle klemmene for overføringsposeslangen og klikker start for å starte bufferutvekslingsprogrammet.På slutten av automatisering trinn seks, prosessen vil pause på grunn av utløsning av boblesensoren av luften i den nå tomme posen. Hvis posen faktisk er tom, trykker du ved siden av for å flytte prosessen til neste trinn. Når den automatiserte prosessen er ferdig, lukker du alle slangeklemmene og åpner døren til enheten.Fjern deretter engangssettet fra enheten og koble fra sprøyten slik at cellene kan samles inn for senere analyse. Vanligvis vil den fluidiserte cellesengen vises som representert i dette bildet med cellene som akkumuleres i midten og mot forsiden av kjeglen, et lite mellomrom på spissen av kammeret der cellene ikke akkumuleres, og en synlig åpning i cellelastinntaket. Den fluidiserte cellesengen kan komprimeres når du introduserer en ny buffer som er på en annen viskositet eller tetthet.En høy strømningshastighet kan brukes til å velge for levende celler som døde celler er mindre og lettere og kan tvinges ut av kammeret ved å øke strømningshastigheten. Den automatiserte prosessen med behandlingstiden for bufferutveksling er kortere enn for den manuelle bufferutvekslingsprosessen. I denne analysen var gjenopprettingsfrekvensen mellom håndboken og de automatiserte prosessene like for begge typer celler som ble testet, og celle levedyktigheten ble ikke påvirket av noen av prosessene.De gjenopprettede cellene viste lignende spredningsrater, evner til å produsere cytokiner og ideo-aktiviteter, uavhengig av type behandling. Det er viktig å huske at denne protokollen bare fungerer som en retningslinje, og derfor må brukerne programmere strømningshastigheten og sentrifugeringshastigheten i henhold til celletype og buffer. Bufferutveksling er et mellomliggende trinn i celleproduksjon som kan følge cellekulturutvidelse eller kryopreservation og formulering.Målet er å utvikle måter å omslutte hele prosessen på. Motvirkelse sentrifugering er en svært allsidig plattform. Fremtidige studier vil utforske programmer i cellevalg, for eksempel fjerning av døde celler og mononukleuscelleisolering fra et chorisisprodukt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Postproduction Behandling av Electrospun Fibre for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En allsidig Automated Plattform for Micro-skala Cell Stimulering Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient belastning Chip for stimulerende cellulære atferd i celle-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Helautomatisk Sentrifugal mikrofluid Enhet for Ultra Protein Detection fra Whole Blood

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Automatisert robot flytende håndtering samlingen av modulære DNA enheter

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design og implementering av en automatisert Illuminating, dyrking, og Sampling System for Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automatisert lysbildet skanning og segmentering i Fluorescently-merket vev bruker Widefield høyt innhold analysesystem

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Bruk av høy gjennomstrømming automatisert Microbioreactor System for produksjon av modellen IgG1 i CHO celler

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live celle analyse av skjæring Stress på Pseudomonas aeruginosa bruker en automatisert høyere gjennomstrømming Microfluidic System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Rensing og analyse av en monoklonale antistoff fra kinesisk hamster eggstokk celler ved hjelp av en automatisert Microbioreactor system

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...