Name: automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pelo Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo vitoriano, e pelo Voucher de Tecnologia do Governo Vitoriano fornecido pelo Departamento de Desenvolvimento Econômico, Empregos, Transportes e Recursos. RL é o destinatário de um National Health and Medical Research Council Career Development Fellowship. Al é o destinatário de um Prêmio de Pós-Graduação Australiana.

1. Preparação de reagentes e células para troca de buffer
<ol><li>Prepare amortecedores (ver Tabela de Materiais)em uma capa de fluxo laminar classe 2. Usando uma seringa e montagem de agulhas, retire 50 mL de solução saline de um saco shinhol de 500 mL. Substitua isso por 50 mL de 20% albumina soro humano (HSA) para fazer 2% HSA em soro fisiológico, que servirá como o tampão de lavagem.</li>
	<li>Retire as células dos vasos de cultura e realizar uma contagem celular para determinar a quantida...

<ol>
	<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+1.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li><li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factories+of+the+future:+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here?.">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?.</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li><li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing.">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li><li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+cell-based+therapies:+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges.">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li><li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products.">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+2.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System.">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li><li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation:+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like?.">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li><li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stromal+Cells:+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities.">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li><li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+(CAR+T-Cells)+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry?.">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?.</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+automation+in+process+development,+manufacture+of+cell,+gene-based+therapies.">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture.">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li><li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+(CFCL/CCE).">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li><li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+(Elutra&#8482;)+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells.">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra&#8482;) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li><li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+(DC)+therapy:+Clinical+study.">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li><li>Whitford, W. G., Subramanian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).</li><li>. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH &amp; CONCENTRATION Available from: <a target="_blank" href="https://www.scinogy.com/projects">https://www.scinogy.com/projects</a> (2019)</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule.">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li><li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways.">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).</li><li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment.">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products.">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li><li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch.">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li><li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies.">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).</li><li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts.">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li><li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts:+a+preclinical+evaluation.">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li><li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+(Cx601)+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn's+disease:+a+phase+3+randomised,+double-blind+controlled+trial.">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia:+A+Safety+Study.">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li></ol>

O protocolo automatizado de troca de buffer descrito é simples e amigável. No entanto, existem alguns passos-chave neste protocolo que são críticos e exigem especial atenção. Em nossa experiência, ao processar células maiores, como MSCs (diâmetro médio de 10 a 15 μm), cada corrida deve incluir pelo menos 1 x 107 células para alcançar a recuperação ideal de células(Figura 4B). O processamento de células menores, como as células Jurkat (média de ~...

A paisagem da medicina moderna transformou-se rapidamente através de desenvolvimentos recentes em terapias genéticas e celulares (GCT). Como um dos campos que mais cresce na pesquisa translacional, o setor gct também enfrenta desafios únicos e sem precedentes. Além de resultados clínicos robustos, processos de fabricação eficientes e econômicos são essenciais para o sucesso comercial da GCT, que é particularmente difícil de alcançar na fabricação de pequena escala1. O custo do tempo, do trabalho e das garantias de qualidade são ampliados quando cada lote de células produz apenas algumas doses para um paciente em vez de centenas ou milhares. Ao contrário das terapias de células alogênicas em que os processos de fabricação são mais semelhantes à produção de anticorpos e proteínas recombinantes, as terapias de células autólogas são tipicamente produzidas como operações de pequena escala1. Como um fenômeno relativamente novo na fabricação biofarmacêutica2,as opções para o processamento de células de pequena escala são atualmente bastante limitadas.
A troca de buffers é essencial para a fabricação de células. É um dos processos a jusante onde as células são removidas da mídia cultural e concentradas para criopreservação ou infusão. Atualmente, a fabricação de células de pequena escala muitas vezes aplica processos semelhantes aos do ambiente de pesquisa acadêmica e depende de salas limpas especializadas para manter a esterilidade3. Processos manuais a jusante costumam usar centrífugas bancadas para pelotas e resuspender as células para redução de volume e troca de buffer. Estes processos abertos são caros (ou seja, trabalho e manutenção de quartos limpos) e têm capacidade de fabricação limitada, que não são ideais para a produção comercial2,3.
A implementação da automação tem sido proposta como uma solução para melhorar a eficiência de fabricação e alcançar produções em escala comercial2. A esterilidade não pode ser alcançada em produtos à base de células através de métodos tradicionais utilizados para produtos biológicos, como irradiação gama ou filtragem terminal. Em vez disso, um sistema fechado automatizado é implantado para reduzir os riscos de contaminação e os operadores que dependem de salas limpas para manter a esterilidade4. A automação de processos também aborda a questão da escalabilidade por ter vários sistemas funcionando em paralelo (escala) ou aumentando a capacidade de processamento de um dispositivo individual (escala-up), o que, por sua vez, minimiza a variabilidade entre os operadores. Além disso, a análise de modelagem de custos de terapias autólogas sugere que a automação pode reduzir o custo de fabricação5,6. No entanto, nenhum benefício de custo foi encontrado em um ensaio clínico de células-tronco autólogas, onde uma plataforma de fabricação automatizada foi usada7,sugerindo que o benefício de custo da automação pode depender do processo de fabricação individual.
Existem diferentes estratégias nas quais a automação pode ser introduzida em um processo de fabricação existente. Isso pode ser alcançado através da implementação de uma plataforma totalmente integrada ou de uma cadeia de processamento modular. Existem várias plataformas totalmente integradas comercialmente disponíveis para fabricação de células autólogas, como CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) e Quantum (Terumo BCT). Essas plataformas integradas, que muitas vezes são descritas como "GMP-in-a-box", têm baixas demandas em infraestrutura e são fáceis de operar. No entanto, a capacidade de fabricação de uma configuração totalmente integrada pode ser restringida pela incubadora anexada ao sistema. Por exemplo, a capacidade de cultivo do Prodigy é limitada à sua câmara8 de 400 mL e o cartucho Quantum tem uma área de superfície limitante definida para 2,1 m2 (equivalente a 120 frascos T175)7, o que pode não ser suficiente para pacientes que necessitam de doses celulares mais altas9,10. Além disso, A Prodigy e a Quantum têm um atributo comum que limita seu uso: a unidade operacional é ocupada por um único lote de células durante todo o período de expansão celular, limitando assim o número de lotes que podem ser fabricados por cada unidade11. A abordagem modular para a automação é criar uma cadeia de fabricação com várias unidades modulares que simula o processo de fabricação comercial12,13. Esta aproximação, que separa o dispositivo da cultura do dispositivo de lavagem da pilha, pode desse modo maximizar a eficiência de fabricação. Um dispositivo de processamento ideal seria aquele que é adaptável e escalável às necessidades de fabricação12.
A tecnologia de centrífuga de contrafluxo (CFC), que remonta à década de 1970, teve uma longa história no processamento de células14. Ele atinge a concentração celular e separação, equilibrando a força centrífuga com uma força de contrafluxo. Normalmente, uma suspensão celular entra a partir da extremidade estreita de uma câmara celular uma taxa de fluxo constante, enquanto submetido a uma força centrífuga(Figura 1A). O fluxo do fluido é exercido na direção oposta à força centrífuga. Isto é referido como a força de contrafluxo, que forma um gradiente dentro da câmara celular. A força de contrafluxo diminui então à medida que a câmara celular se alarga para longe da ponta da câmara celular em forma de cone. Células com maior densidade e maior diâmetro têm uma maior taxa de sedimentação e, portanto, atingem o equilíbrio de força em direção à ponta da câmara celular em forma de cone. Partículas menores podem alcançar equilíbrio em direção à base da câmara ou ser pequenas demais para serem mantidas na câmara e serão lavadas. A tecnologia CFC é mais conhecida por sua aplicação no processamento de produtos de apherese sanguínea, como isolar monócitos para terapias de células dendríticas15,16. Em termos de troca de buffer, a tecnologia CFC só foi aplicada na fabricação em larga escala17 e ainda não foi usada para a fabricação de menor escala de terapias de células autólogas.
Para atender à necessidade de um dispositivo adequado para fabricação de células de pequena escala, um dispositivo CFC automatizado (Ver Tabela de Materiais),foi recentemente desenvolvido18. O dispositivo automatizado de processamento de células usa tecnologia de centrífuga de contrafluxo para remover detritos celulares e facilitar a troca de buffers. O dispositivo executa a troca do amortecedor com um jogo single-use que possa ser estéril-conectado a um saco de transferência da pilha, que permita que as pilhas sejam processadas dentro de um sistema estéril, incluido. Aqui, investigamos o uso de um dispositivo centrífuga de contrafluxo para realizar a troca de buffers em culturas celulares de mamíferos em protocolos automatizados. Neste estudo, testamos o protocolo de troca de buffer usando células Jurkat e células estromais mesenchymal (MSCs) para modelar tipos de células não aderentes e aderentes, respectivamente. As células Jurkat são células T imortalizadas frequentemente usadas para o estudo da leucemia aguda de células T19,20. Os MSCs são células-tronco adultas que têm sido estudadas em ensaios clínicos em humanos para uma ampla gama de doenças9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 ml Luer lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>AUST R 46283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156477-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml IV saline bag</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>K690521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (Countess)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stimulation cocktail (500x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4970-93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfer bags</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>T1BBT060CBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Al221C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer (female) fittings</td>
			<td>CPC</td>
			<td>LF41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC laptop or PC tablet device</td>
			<td>ASUS</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (SpectraMax i3)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea single-use processing kit</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>420SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing

A comercialização bem-sucedida de terapias gênicas e celulares requer processos de fabricação que sejam econômicos e escaláveis. A troca de buffers e a concentração de produtos são componentes essenciais para a maioria dos processos de fabricação. No entanto, nos estágios iniciais do desenvolvimento do produto, essas etapas são muitas vezes executadas manualmente. A centrífuga manual sem saída para a troca de buffers é trabalhosa, cara e não escalável. Um sistema automatizado fechado pode efetivamente eliminar essa etapa trabalhosa, mas a implementação pode ser desafiadora. Aqui, descrevemos um dispositivo de processamento de células recém-desenvolvido que é adequado para processamento de células de pequena a média escala e visa preencher a lacuna entre processamento manual e automação em larga escala. Este protocolo pode ser facilmente aplicado a vários tipos e processos celulares, modificando a taxa de fluxo e a velocidade de centrífuga. Nosso protocolo demonstrou a recuperação elevada da pilha com uns tempos de processamento mais curtos em comparação ao processo manual. As células recuperadas do processo automatizado também mantiveram suas taxas de proliferação. O dispositivo pode ser aplicado como um componente modular em um processo de fabricação fechado para acomodar etapas tais como a troca do amortecedor, a formulação da pilha, e a criopreservação.

Neste protocolo, usamos células Jurkat e MSCs como exemplos representativos para demonstrar o processo automatizado de troca de buffers. Durante o processo, as células Jurkat e os MSCs compartilharam as mesmas etapas de processamento com diferenças na força centrífuga e na velocidade da bomba que controlam a taxa de fluxo(Tabela 1). A Figura 2 mostra imagens representativas capturadas pela câmera de como o leito celular fluido pode aparecer durante o processo de troca ...

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Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

A automação é fundamental para aumentar o dimensionamento e o gerenciamento de custos na fabricação de células. Este manuscrito descreve o uso de um dispositivo de processamento de células centrífugas de contrafluxo para automatizar as etapas de troca de buffer e concentração de células para o bioprocessamento em pequena escala.

Sistema centrífuga de contrafluxo automatizado para processamento de células em pequena escala

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Este protocolo fornece uma solução para troca de buffer automatizada fechada e concentração para fabricação de células de pequena escala. É importante ressaltar que a troca de buffers é capaz de ser realizada com uma alta recuperação e uma entrega de um volume muito pequeno de produto concentrado. Novos usuários podem ter dificuldade em seguir todas as etapas de automação.Praticar a programação dessas etapas e realizar testes com meio são boas maneiras de se familiarizar com o dispositivo. Antes de iniciar a troca de tampão, em uma cabeça de fluxo laminar classe dois, use uma seringa e um conjunto de agulhas para remover 50 mililitros de solução salina de um saco salino de 500 mililitros. Substitua este volume por 50 mililitros de albumina de soro humano de 20%, e colmeia as células de interesse de seus vasos culturais.Após a contagem, use a seringa para carregar as células em um saco de transferência e use a trava Luer para conectar o saco de transferência a um kit de processamento de uso único. Em seguida, conecte o saco previamente preparado de tampão de lavagem ao kit de processamento de uso único. Para configurar uma troca de buffer automatizada, abra a interface gráfica do usuário do dispositivo e clique no botão iniciar.Clique novo para criar um novo protocolo e clique no controle para selecionar as válvulas a serem abertas e fechadas, as velocidades centrífugas e da bomba, a direção da bomba e os gatilhos de ação. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, clique em salvar. Pendure os sacos apropriados conectados no dispositivo e coloque o kit de processamento de uso único na máquina.Em seguida, clique no botão conectar e baixe o programa salvo. Quando o botão de reprodução acender, o protocolo está pronto para ser iniciado. Para realizar a troca de buffer automatizada, abra os grampos manuais para a tubulação da bolsa de transferência e clique em iniciar o programa de troca de buffer.No final da etapa de automação seis, o processo fará uma pausa devido ao acionamento do sensor de bolha pelo ar no saco agora vazio. Se o saco estiver realmente vazio, pressione ao lado para mover o processo para o próximo passo. Quando o processo automatizado estiver concluído, feche todos os grampos de tubulação e abra a porta do dispositivo.Em seguida, remova o kit de uso único do dispositivo e desconecte a seringa para permitir que as células sejam coletadas para análise posterior. Normalmente, o leito celular fluidizado aparecerá como representado nesta imagem com as células acumuladas no meio e em direção à frente do cone, um pequeno espaço na ponta da câmara em que as células não se acumulam, e uma abertura visível dentro da entrada de carregamento celular. O leito celular fluidizado pode ser comprimido ao introduzir um novo tampão que esteja em uma viscosidade ou densidade diferente.Uma alta taxa de fluxo pode ser aplicada para selecionar células vivas, pois as células mortas são menores e mais leves e podem ser forçadas a sair da câmara aumentando a taxa de fluxo. O processo automatizado de tempo de processamento de troca de buffer é menor do que o do processo manual de troca de buffer. Nesta análise, as taxas de recuperação entre o manual e os processos automatizados foram semelhantes para ambos os tipos de células testadas, e a viabilidade celular não foi afetada por nenhum dos processos.As células recuperadas demonstraram taxas de proliferação semelhantes, habilidades para produzir citocinas e ideo-atividades, independentemente do tipo de processamento. É importante lembrar que este protocolo serve apenas como uma diretriz e, portanto, os usuários precisam programar a taxa de fluxo e a velocidade de centrifugação de acordo com seu tipo de célula e buffer. O intercâmbio tampão é um passo intermediário na fabricação de células que pode seguir a expansão da cultura celular ou a criopreservação e formulação.O objetivo é desenvolver formas de incluir todo o processo. A centrifugação de contrafluxo é uma plataforma muito versátil. Estudos futuros explorarão aplicações na seleção celular, como remoção de células mortas e isolamento de células mononucleus a partir de um produto de corísis.

Research

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