Name: automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Эта работа поддерживается Викторианской правительством оперативной программы поддержки инфраструктуры, а также викторианской правительства технологии ваучер, предоставляемый Департаментом экономического развития, рабочих мест, транспорта и ресурсов. RL является получателем Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Карьера развития стипендий. AL является лауреатом Австралийской премии последипломного образования.

1. Подготовка реагентов и ячеек для буферного обмена
<ol><li>Подготовка буферов (см. Таблица материалов) в классе 2 ламинарный капот потока. Используя шприц и игольную сборку, удалите 50 мл соблюй раствора из солен-мешка 500 мл. Замените это с 50 мл 20% человеческого сыворотки альбумина (...

<ol>
	<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+1.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li><li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factories+of+the+future:+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here?.">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?.</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li><li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing.">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li><li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+cell-based+therapies:+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges.">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li><li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products.">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+2.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System.">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li><li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation:+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like?.">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li><li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stromal+Cells:+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities.">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li><li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+(CAR+T-Cells)+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry?.">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?.</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+automation+in+process+development,+manufacture+of+cell,+gene-based+therapies.">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture.">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li><li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+(CFCL/CCE).">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li><li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+(Elutra&#8482;)+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells.">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra&#8482;) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li><li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+(DC)+therapy:+Clinical+study.">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li><li>Whitford, W. G., Subramanian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).</li><li>. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH &amp; CONCENTRATION Available from: <a target="_blank" href="https://www.scinogy.com/projects">https://www.scinogy.com/projects</a> (2019)</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule.">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li><li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways.">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).</li><li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment.">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products.">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li><li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch.">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li><li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies.">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).</li><li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts.">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li><li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts:+a+preclinical+evaluation.">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li><li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+(Cx601)+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn's+disease:+a+phase+3+randomised,+double-blind+controlled+trial.">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia:+A+Safety+Study.">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li></ol>

Описанный автоматизированный протокол обмена буфером прост и удобен для пользователя. Тем не менее, есть несколько ключевых шагов в этом протоколе, которые имеют решающее значение и требуют особого внимания. По нашему опыту, при обработке более крупных клеток, таких как MSC (средний диам...

Ландшафт современной медицины быстро преобразился благодаря последним разработкам в области генной и клеточной терапии (GCT). Будучи одной из наиболее быстро растущих областей в области трансляционных исследований, сектор GCT также сталкивается с уникальными и беспрецедентными проблемами. В дополнение к надежным клиническим результатам, эффективные и экономически эффективные производственные процессы имеют важное значение для коммерческого успеха GCT, который особенно трудно достичь в мелкомасштабной обрабатывающей промышленности1. Стоимость времени, труда и гарантий качества увеличивается, когда каждая партия клеток производит только несколько доз на одного пациента, а не сотни или тысячи. В отличие от аллогенной клеточной терапии, в которой производственные процессы больше похожи на производство антител и рекомбинантных белков, аутологичные клеточные методы лечения, как правило, производятся как мелкомасштабные операции1. Как относительно новое явление в биофармацевтическом производстве2, варианты мелкомасштабной обработки клеток в настоящее время весьма ограничены.
Буферный обмен имеет важное значение для производства клеток. Это один из процессов, происходящих вниз по течению, где клетки удаляются из культурных носителей и концентрируются для криоконсервации или инфузии. В настоящее время мелкомасштабное производство клеток часто применяется процессы, аналогичные тем, которые в академических исследований настройки и опирается на специализированные чистые комнаты для поддержания бесплодия3. Ручные процессы вниз по течению часто используют центрифуги скамейки для гранул и повторной работы ячеек для уменьшения объема и буферного обмена. Эти открытые процессы являются дорогостоящими (т.е. обслуживание рабочей силы и чистой комнаты) и имеют ограниченные производственные мощности, которые не являются идеальными для коммерческого производства2,3.
Внедрение автоматизации было предложено в качестве решения для повышения эффективности производства и достижения коммерческих производств2. Стерильность не может быть достигнута в клеточных продуктах с помощью традиционных методов, используемых для биопрепаратов, таких как гамма-облучение или терминальная фильтрация конца. Вместо этого, автоматизированная закрытая система развернута для снижения риска загрязнения и операторов, полагающих на чистые помещения для поддержания стерильности4. Автоматизация процессов также решает проблему масштабируемости, либо имея несколько систем, работающих параллельно (масштабирование), либо увеличивая вычислительную мощность отдельного устройства (масштабирование), что, в свою очередь, сводит к минимуму изменчивость между операторами. Кроме того, анализ затрат моделирования аутологичных методов лечения позволяет предположить, что автоматизация может снизить затраты на производство5,6. Тем не менее, никакой выгоды не было найдено в аутологичном клиническом испытании стволовых клеток, где автоматизированная производственная платформа была использована7, предполагая, что рентабельность автоматизации может зависеть от индивидуального производственного процесса.
Существуют различные стратегии, в которых автоматизация может быть введена в существующий производственный процесс. Этого можно достичь либо путем внедрения полностью интегрированной платформы, либо модульной цепочки обработки. Есть несколько полностью интегрированных платформ, коммерчески доступных для аутологического производства клеток, таких как CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Кокон (Octane Biotech) и Квантовая (Terumo BCT). Эти интегрированные платформы, которые часто называют «GMP-in-a-box», имеют низкие требования к инфраструктуре и просты в эксплуатации. Однако производственные мощности полностью интегрированной установки могут быть ограничены инкубатором, подключенным к системе. Например, культивирование мощности Prodigy ограничено его 400 мл камеры8 и квантовый картридж имеет предельную площадь поверхности установлен 2,1 м2 (эквивалент 120 T175 колбы)7, которые не могут быть достаточными для пациентов, нуждающихся в более высоких дозах клеток9,10. Кроме того, Prodigy и Квантовая имеют общий атрибут, который ограничивает их использование: операционная единица занята одной партии ячеек на протяжении всего периода расширения ячейки, тем самым ограничивая количество партий, которые могут быть изготовлены каждой единицей11. Модульный подход к автоматизации заключается в создании производственной цепочки с несколькими модульными агрегатами, которая имитирует коммерческий производственный процесс12,13. Этот подход, который отделяет прибор культуры от прибора мытья клетки, может таким образом увеличить эффективность изготавливания. Идеальным устройством обработки будет устройство, адаптируемое и масштабируемое для производственных потребностей12.
Технология Counterflow centrifugation (CFC), которая восходит к 1970-м годы, имеет долгую историю в обработке клеток14. Он достигает концентрации клеток и разделения, балансируя центробежную силу с силой контрпотока. Как правило, суспензия ячейки входит из узкого конца камеры клетки при постоянной скорости потока при условии центробежной силы(рисунок 1А). Поток жидкости оказывается в противоположном направлении к центробежной силе. Это называется силой встречного потока, которая образует градиент в ячейке. Сила контрпотока затем уменьшается по мере того как камера клетки расширяет далеко от кончика конус-образной камеры клетки. Клетки с более высокой плотностью и большим диаметром имеют более высокую скорость осадка, и таким образом они достигают силового равновесия к кончику конусообразной клеточной камеры. Меньшие частицы могут достичь равновесия к основанию камеры или быть слишком малы, чтобы быть сохранены в камере и будут смыты. Технология CFC в основном известна своим применением в обработке продуктов афересеза крови, таких как изолирующие моноциты для дендритной клеточной терапии15,16. С точки зрения буферного обмена, технология ХФУ применяется только в крупномасштабном производстве17 и до сих пор не используется для меньшего масштаба производства аутологичной клеточной терапии.
Для удовлетворения потребности в подходящем устройстве для мелкомасштабного производства ячеек, автоматизированное устройство ХФУ (см. Таблица материалов), был недавно разработан18. Автоматизированное устройство обработки клеток использует технологию центрифугирования контрпотока для удаления мусора и облегчения буферного обмена. Устройство выполняет буферный обмен с одноразовым набором, который может быть стерильным подключен к сумке для передачи ячейки, что позволяет обрабатывать ячейки в стерильной, закрытой системе. Здесь мы исследуем использование центробежного устройства противпотока для выполнения буферного обмена в культурах клеток млекопитающих в автоматизированных протоколах. В этом исследовании мы протестировали протокол буферного обмена с использованием ячеек Jurkat и мезенхимальных стромальных ячеек (MSC) для моделирования типов неприверженных и придерживающихся клеток, соответственно. Клетки jurkat увековечены Т-клетки часто используются для изучения острого Т-клеточного лейкоза19,20. MSCs взрослые стволовые клетки, которые были изучены в клинических испытаниях на людях для широкого спектра заболеваний9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 ml Luer lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>AUST R 46283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156477-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml IV saline bag</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>K690521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (Countess)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stimulation cocktail (500x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4970-93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfer bags</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>T1BBT060CBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Al221C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer (female) fittings</td>
			<td>CPC</td>
			<td>LF41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC laptop or PC tablet device</td>
			<td>ASUS</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (SpectraMax i3)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea single-use processing kit</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>420SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing

Успешная коммерциализация генной и клеточной терапии требует производственных процессов, которые являются экономически эффективными и масштабируемыми. Обмен буферами и концентрация продукта являются важными компонентами для большинства производственных процессов. Однако на ранних стадиях разработки продукта эти шаги часто выполняются вручную. Ручная тупиковая центробежка для буферного обмена является трудоемкой, дорогостоящей и не масштабируемой. Закрытая автоматизированная система может эффективно устранить этот трудоемкий шаг, но реализация может быть сложной задачей. Здесь мы описываем недавно разработанное устройство обработки ячеек, которое подходит для обработки ячеек малого и среднего масштаба и направлено на преодоление разрыва между ручной обработкой и крупномасштабной автоматизацией. Этот протокол может быть легко применен к различным типам и процессам клеток путем изменения скорости потока и скорости центрифугирования. Наш протокол продемонстрировал высокое восстановление клеток с более коротким временем обработки по сравнению с ручным процессом. Клетки, извлеченные из автоматизированного процесса, также поддерживали скорость распространения. Устройство может быть применено в качестве модульного компонента в закрытом производственном процессе для размещения таких этапов, как буферный обмен, формулировка ячейки и криоконсервация.

В этом протоколе мы использовали ячейки Jurkat и MSC в качестве репрезентативных примеров для демонстрации автоматизированного процесса обмена буферами. В ходе процесса, jurkat клетки и MSCs разделяют те же шаги обработки с различиями в центробежной силы и скорости насоса, которые контролируют...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Автоматизация является ключом к наращиванию масштабов и управлению затратами в производстве ячеек. Данная рукопись описывает использование устройства обработки центробежных клеток против потока для автоматизации буферного обмена и шагов концентрации клеток для мелкомасштабной биообработки.

Автоматизированная центробежная система Counterflow для мелкомасштабной обработки ячеек

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Этот протокол обеспечивает решение для закрытого автоматизированного буферного обмена и концентрации для мелкомасштабного производства ячеев. Важно отметить, что буферный обмен может выполняться при высоком восстановлении и поставке очень небольшого объема концентрированного продукта. Новые пользователи могут бороться, чтобы следовать всем шагам автоматизации.Практика программирования этих шагов и выполнение тестовых запусков со средой являются хорошими способами ознакомиться с устройством. Перед началом буферного обмена, в классе 2 ламинарной головки потока, используйте шприц и сборку иглы, чтобы удалить 50 миллилитров солевого раствора из 500-миллилитрового солевого мешка. Замените этот том 50 миллилитров 20%человеческого альбумин сыворотки, и урожай клеток, представляющих интерес от их культуры сосудов.После подсчета, используйте шприц, чтобы загрузить клетки в мешок передачи, и использовать замок Luer для подключения передачи мешок одноразовый комплект обработки. Затем подключите ранее подготовленный мешок буфера для мытья к одно используется комплект обработки. Чтобы настроить автоматизированный буферный обмен, откройте графический пользовательский интерфейс устройства и нажмите кнопку "Пуск".Нажмите новый, чтобы создать новый протокол, и нажмите управление, чтобы выбрать клапаны, которые будут открыты и закрыты, центробежные и насос скорости, направление насоса, и действие триггеров. Когда все параметры будут установлены, нажмите сохранить. Повесьте подключенные соответствующие мешки на устройство и поместите одноразовый комплект обработки на машину.Затем нажмите кнопку подключения и загрузите сохраненную программу. Когда кнопка воспроизведения загорается, протокол готов к началу. Для выполнения автоматизированного буферного обмена откройте ручные зажимы для трубки сумки передачи и нажмите кнопку, чтобы начать инициировать программу буферного обмена.В конце шестого шага автоматизации процесс приохлопнится из-за срабатывания датчика пузыря воздухом в теперь уже пустом мешке. Если сумка действительно пуста, нажмите рядом, чтобы переместить процесс на следующий шаг. Когда автоматизированный процесс будет закончен, закройте все зажимы для труб и откройте дверь устройства.Затем удалите одноразовый комплект с устройства и отключите шприц, чтобы клетки были собраны для последующего анализа. Как правило, жидкостные клетки кровать будет отображаться как представлено на этом изображении с клетками, накапливающиеся в середине и к передней части конуса, небольшое пространство на кончике камеры, в которой клетки не накапливаются, и видимое отверстие в клетке загрузки входе. Текучесть клеток кровать может быть сжата при введении нового буфера, который находится на различные вязкости или плотности.Высокая скорость потока может быть применена для выбора живых клеток, так как мертвые клетки меньше и легче и могут быть вытеснены из камеры за счет увеличения скорости потока. Автоматизированный процесс обработки буферного обмена короче, чем процесс ручного обмена буферами. В этом анализе показатели восстановления между руководством и автоматизированными процессами были схожими для обоих типов протестированных ячеек, и на жизнеспособности клеток не повлиял ни один из процессов.Восстановленные клетки продемонстрировали аналогичные темпы распространения, способность производить цитокины и идео-деятельности, независимо от типа обработки. Важно помнить, что этот протокол служит только в качестве ориентира, и поэтому пользователи должны программировать скорость потока и скорость центрифугации в зависимости от их типа ячейки и буфера. Буферный обмен является промежуточным шагом в производстве клеток, которые могут следовать расширению клеточной культуры или криоконсервации и формулировки.Цель состоит в том, чтобы разработать способы, чтобы приложить весь процесс. Центрифугация контрпотока является очень универсальной платформой. Будущие исследования будут изучать приложения в выборе клеток, таких как удаление мертвых клеток и мононуклеусной изоляции клеток от продукта chorisis.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Озвучка обработка волокна Electrospun для тканевой инженерии

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Универсальная автоматизированная платформа для микро-масштабе Эксперименты стимуляции клеток

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Градиент штамм чип для стимулирования клеточных поведения в ячейке Ладена Гидрогель

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Полностью автоматизированный центробежный Микрожидкостных Устройство для сверхчувствительного обнаружения белка из цельной крови

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Автоматизированных роботов жидкой обработке Ассамблеи устройств модульной ДНК

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Разработка и внедрение автоматизированной освещая, культивированием и система отбора проб для микробного оптогенетика приложений

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Автоматизированных слайд сканирование и сегментации в дневно меченых тканей, с использованием системы анализа Widefield высоким содержанием

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Использование высокопроизводительного автоматизированная система Microbioreactor для производства модель IgG1 в клетках Чо

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Жить анализа клеток касательное напряжение на синегнойной палочки с помощью автоматизированной системы Microfluidic высшее-пропускная способность

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Очистка и аналитика моноклонального антитела от китайских яичников хомяка с помощью автоматизированной системы микробиореактора

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...