Name: automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing
Uploaded: 2019-12-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Bu çalışma Viktorya Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı ve Ekonomik Kalkınma, İşler, Ulaştırma ve Kaynaklar Bakanlığı tarafından sağlanan Viktorya Hükümeti Teknoloji Fişi tarafından desteklenir. RL Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kariyer Geliştirme Bursu alıcıdır. AL, Avustralya Lisansüstü Ödülü'nü kazanmıştır.

1. Tampon değişimi için reaktiflerin ve hücrelerin hazırlanması
<ol><li>Sınıf 2 laminar akış başlığında arabellekleri hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu). Şırınga ve iğne tertibatı kullanarak, 500 mL tuzlu torbadan 50 mL tuzlu çözelti çıkarın. Bunu %20 insan serum albumininin (HSA) 50 mL'si ile değiştirin ve %2 hsa'yı tuzlu da yapın ve bu da yıkama tamponu görevi göreceksiniz.</li>
	<li>Hücreleri kültür damarlarından çıkarın ve trypan mavisi hariç tutularak başla...

<ol>
	<li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+1.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1.</a> BioProcess International. 16 (3), (2018).</li><li>Hampson, B., Ceccarelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factories+of+the+future:+Can+Patient-Specific+Cell+Therapies+Get+There+from+Here?.">Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?.</a> BioProcess International. 14 (4), (2016).</li><li>Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+success+for+commercial+cell+therapy+manufacturing.">Mapping success for commercial cell therapy manufacturing.</a> BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).</li><li>Heathman, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translation+of+cell-based+therapies:+clinical+landscape+and+manufacturing+challenges.">The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges.</a> Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).</li><li>Lipsitz, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+roadmap+for+cost-of-goods+planning+to+guide+economic+production+of+cell+therapy+products.">A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).</li><li>Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+Analysis+of+Cell+Therapy+Manufacture:+Autologous+Cell+Therapies,+Part+2.">Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2.</a> BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+manufacturing+of+therapeutic+mesenchymal+stromal+cells+with+the+use+of+the+Quantum+Cell+Expansion+System.">Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).</li><li>Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation:+what+will+the+cell+therapy+laboratory+of+the+future+look+like?.">Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).</li><li>Galipeau, J., Sensebe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stromal+Cells:+Clinical+Challenges+and+Therapeutic+Opportunities.">Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li><li>Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cells+(CAR+T-Cells)+for+Cancer+Immunotherapy+-+Moving+Target+for+Industry?.">Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry?.</a> Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).</li><li>James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+short-term+gain+can+lead+to+long-term+pain.">How short-term gain can lead to long-term pain.</a> Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).</li><li>Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+role+of+automation+in+process+development,+manufacture+of+cell,+gene-based+therapies.">The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies.</a> Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).</li><li>Rafiq, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+Automated+Approaches+for+Cell+and+Gene+Therapy+Manufacture.">Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture.</a> Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).</li><li>Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Granulocyte+Isolation+by+Continuous+Flow+Centrifugation+Leukapheresis+and+Counterflow+Centrifugation+Elutriation+(CFCL/CCE).">Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE).</a> Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).</li><li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+(Elutra&#8482;)+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells.">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra&#8482;) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).</li><li>Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Cobe+AutoPBSC+and+Gambro+Elutra+as+a+platform+for+monocyte+enrichment+in+dendritic+cell+(DC)+therapy:+Clinical+study.">Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study.</a> Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).</li><li>Whitford, W. G., Subramanian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).</li><li>. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH &amp; CONCENTRATION Available from: <a target="_blank" href="https://www.scinogy.com/projects">https://www.scinogy.com/projects</a> (2019)</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Jurkat+T+Lymphocyte+Leukemia+Cells+by+an+Engineered+Interferon-Alpha+Hybrid+Molecule.">Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).</li><li>Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells+Display+Activation+of+Different+Survival+Pathways.">T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways.</a> Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).</li><li>Ling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+use+IDO+to+regulate+immunity+in+tumor+microenvironment.">Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment.</a> Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).</li><li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows.">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).</li><li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyethyl+starch+as+a+substitute+for+dextran+40+for+thawing+peripheral+blood+progenitor+cell+products.">Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products.</a> Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).</li><li>Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+collection+and+processing+with+hydroxyethyl+starch+or+non-hydroxyethyl+starch.">Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch.</a> Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).</li><li>Stroncek, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counter-flow+elutriation+of+clinical+peripheral+blood+mononuclear+cell+concentrates+for+the+production+of+dendritic+and+T+cell+therapies.">Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).</li><li>Mfarrej, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-clinical+assessment+of+the+Lovo+device+for+dimethyl+sulfoxide+removal+and+cell+concentration+in+thawed+hematopoietic+progenitor+cell+grafts.">Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts.</a> Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).</li><li>Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+washing+of+thawed+haematopoietic+progenitor+cell+grafts:+a+preclinical+evaluation.">Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation.</a> Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).</li><li>Panes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+allogeneic+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+(Cx601)+for+complex+perianal+fistulas+in+Crohn's+disease:+a+phase+3+randomised,+double-blind+controlled+trial.">Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial.</a> Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).</li><li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-In-Human+Administration+of+Allogeneic+Amnion+Cells+in+Premature+Infants+With+Bronchopulmonary+Dysplasia:+A+Safety+Study.">First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).</li></ol>

Açıklanan otomatik arabellek değiştirme protokolü basit ve kullanıcı dostudur. Yine de, bu protokolde kritik ve özellikle dikkat gerektiren birkaç önemli adım vardır. Deneyimlerimize göre, MSC'ler (ortalama çap 10-15 μm) gibi daha büyük hücreleri işlerken her çalışmada en az 1 x 107 hücre içermelidir(Şekil 4B). Jurkat hücreleri (ortalama ~10 μm çap) gibi daha küçük hücrelerin işlenmesi, kararlı bir akışkan hücre yatağı elde e...

Modern tıbbın manzarası gen ve hücre temelli tedavilerdeki (GCT) son gelişmelerle hızla değişmiştir. Çeviri araştırmalarında en hızlı büyüyen alanlardan biri olan GCT sektörü, benzersiz ve eşi görülmemiş zorluklarla da karşı karşıyadır. Sağlam klinik sonuçlara ek olarak, verimli ve uygun maliyetli üretim süreçleri GCT ticari başarı için gereklidir, özellikle küçük ölçekli üretim elde etmek zordur1. Zaman maliyeti, işçilik, ve kalite güvenceleri hücrelerin her toplu sadece yüz veya binlerce yerine bir hasta için birkaç doz üretir büyütülür. Üretim süreçlerinin antikor ve rekombinant protein üretimine daha çok benzediği allojen hücre tedavilerinden farklı olarak, otolog hücre tedavileri genellikle küçük ölçeklioperasyonlar1 olarak üretilmektedir. Biyofarmasötik üretiminde nispeten yeni bir fenomen olarak2, küçük ölçekli hücre işleme seçenekleri şu anda oldukça sınırlıdır.
Arabellek değişimi hücre üretimi için gereklidir. Hücrelerin kültür medyasından çıkarıldığı ve kriyopreservation veya infüzyonu için yoğunlaştığı alt akım süreçlerinden biridir. Şu anda, küçük ölçekli hücre üretimi genellikle akademik araştırma ortamında benzer süreçler uygular ve sterilite korumak için özel temiz odalar güvenir3. Manuel downstream süreçleri genellikle hacim azaltma ve tampon değişimi için pelet ve yeniden hücreleri askıya benchtop santrifüjler kullanın. Bu açık süreçler pahalı (yani, işçilik ve temiz oda bakımı) ve ticari üretim için ideal olmayan sınırlı üretim kapasitesine sahip2,3.
Otomasyonun uygulanması, üretim verimliliğini artırmak ve ticari ölçekli üretimlere ulaşmak için bir çözüm olarak önerilmiştir2. Gama ışınlaması veya terminal uç filtrasyon gibi biyolojik yöntemlerle hücre bazlı ürünlerde sterilite elde edilemez. Bunun yerine, kontaminasyon risklerini azaltmak için otomatik kapalı bir sistem kurulur ve operatörler sterilite4korumak için temiz odalara güvenerek. Proses otomasyonu, aynı zamanda birden fazla sistem paralel çalışan (ölçeklendirme) ya da sırayla operatörler arasındaki değişkenliği en aza indirir bireysel bir cihazın işleme kapasitesini (ölçeklendirme) artırarak ölçeklenebilirlik sorunu giderir. Ayrıca, otolog tedavilerin maliyet modelleme analizi otomasyon üretim maliyetini azaltabilir düşündürmektedir5,6. Ancak, otomatik bir üretim platformu7kullanılan bir otolog kök hücre klinik çalışmada hiçbir maliyet avantajı bulundu 7 , otomasyon maliyet yararı bireysel üretim sürecine bağlı olabileceğini düşündürmektedir.
Otomasyonun mevcut bir üretim sürecine dahil edilebildiği farklı stratejiler vardır. Bu, tam entegre bir platform veya modüler tabanlı bir işlem zinciri uygulanarak elde edilebilir. CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Oktan Biotech) ve Quantum (Terumo BCT) gibi otolog hücre üretimi için ticari olarak kullanılabilen birkaç tam entegre platform bulunmaktadır. Genellikle "GMP-in-a-box" olarak tanımlanan bu entegre platformlar, altyapı konusunda düşük taleplere sahiptir ve kullanımı kolaydır. Ancak, tam entegre bir kurulumun üretim kapasitesi sisteme bağlı kuluçka makinesi ile sınırlandırılabilir. Örneğin, Prodigy'nin kültür kapasitesi 400 mL haznesi8 ile sınırlıdır ve Quantum kartuşunun 2,1 m2 (120 T175 şişeye eşdeğer)olarakayarlanmış sınırlayıcı bir yüzey alanı vardır 7 , daha yüksek hücre dozları gerektiren hastalar için yeterli olmayabilir9,10. Ayrıca, Prodigy ve Quantum kullanımlarını sınırlayan ortak bir özelliğe sahiptir: operasyonel birim hücre genişletme dönemi boyunca tek bir hücre grubu tarafından işgal edilir, böylece her birim11tarafından imal edilebilen toplu iş sayısını sınırlandırır. Otomasyon için modüler yaklaşım ticari üretim süreci 12 simüle birden fazla modüler birimleri ile bir üretim zinciri oluşturmaktır12,13. Kültür cihazını hücre yıkama cihazından ayıran bu yaklaşım, böylece üretim verimliliğini en üst düzeye çıkarabilir. İdeal bir işleme cihazı uyarlanabilir ve üretim ihtiyacı12ölçeklenebilir biri olacaktır.
1970'li yıllara dayanan karşı akış santrifüj (CFC) teknolojisi, hücre işleme de uzun bir geçmişe sahip14. Santrifüj kuvvetini bir karşı akış kuvvetiyle dengeleyerek hücre konsantrasyonu ve ayrıştırma sağlar. Tipik olarak, bir hücre süspansiyonu bir hücre odasının dar ucundan sabit bir akış hızı altında bir santrifüj kuvvete maruz kalırken girer (Şekil 1A). Sıvının akışı santrifüj kuvvetine ters yönde yapılır. Buna, hücre odası içinde bir degrade oluşturan karşı akış kuvveti denir. Hücre odası koni şeklindeki hücre odasının ucundan genişledikçe karşı akış kuvveti azalır. Daha yüksek yoğunluklu ve daha büyük çapı olan hücreler daha yüksek bir sedimantasyon hızına sahiptir ler ve böylece koni şeklindeki hücre odasının ucuna doğru kuvvet dengesine ulaşırlar. Küçük parçacıklar haznetabanına doğru dengeye ulaşabilir veya haznede tutulamayacak kadar küçük olabilir ve yıkanır. CFC teknolojisi çoğunlukla dendritik hücre tedavileri için monosit izole gibi kan aferez ürünleri işleme uygulaması için bilinir15,16. Tampon değişimi açısından, CFC teknolojisi sadece büyük ölçekli üretim17 uygulanmıştır ve otolog hücre tedavileri küçük ölçekli üretim için henüz kullanılmak üzere.
Küçük ölçekli hücre üretimi için uygun bir cihaz ihtiyacını gidermek için, otomatik bir CFC cihazı (Malzemeler Tablosubakınız), son zamanlardageliştirilmiştir 18. Otomatik hücre işleme cihazı hücre enkaz kaldırmak ve tampon değişimi kolaylaştırmak için karşı akış santrifüj teknolojisini kullanır. Cihaz, hücrelerin steril, kapalı bir sistem içinde işlenmesini sağlayan hücre aktarım torbasına steril bağlanabilen tek kullanımlık bir kit ile tampon değişimi gerçekleştirir. Burada, otomatik protokollerde memeli hücre kültürlerinde tampon değişimi gerçekleştirmek için bir karşı akım santrifüj cihazının kullanımını araştırıyoruz. Bu çalışmada, nonadherent ve yapışık hücre tiplerini modellemek için Jurkat hücreleri ve mezenkimal stromal hücreleri (MSCs) kullanarak tampon değişim protokolünü test ettik. Jurkat hücreleri genellikle akut T hücreli lösemi19,20çalışma için kullanılan T hücreleri ölümsüzleştirilmiş vardır. MSC'ler, çok çeşitli hastalıklar için insan klinik çalışmalarında çalışılan yetişkin kök hücrelerdir9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20 ml Luer lock syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>302830</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Human serum albumin (HSA)</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>AUST R 46283</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(Dimethylamino)benzaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>156477-25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml IV saline bag</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>K690521</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (Countess)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stimulation cocktail (500x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4970-93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfer bags</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>T1BBT060CBB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3582</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320082</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10099141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Interleukin 2 (IL2) Kit</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Al221C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer (female) fittings</td>
			<td>CPC</td>
			<td>LF41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC laptop or PC tablet device</td>
			<td>ASUS</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader (SpectraMax i3)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea counterflow centrifuge cell processing device</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotea single-use processing kit</td>
			<td>Scinogy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>420SS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399-250g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing

Gen ve hücre bazlı tedavilerin başarılı bir şekilde ticarileştirilmesi, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir üretim süreçleri gerektirir. Tampon değişimi ve ürün konsantrasyonu çoğu üretim süreci için gerekli bileşenlerdir. Ancak, ürün geliştirmenin erken aşamalarında, bu adımlar genellikle el ile gerçekleştirilir. Tampon değişimi için manuel çıkmaz santrifüj emek yoğun, pahalı ve ölçeklenebilir değildir. Kapalı otomatik bir sistem bu zahmetli adımı etkili bir şekilde ortadan kaldırabilir, ancak uygulama zor olabilir. Burada, küçük ve orta ölçekli hücre işleme için uygun olan ve manuel işleme ve büyük ölçekli otomasyon arasındaki boşluğu kapatmayı amaçlayan yeni geliştirilmiş bir hücre işleme cihazını tanımlıyoruz. Bu protokol, akış hızı ve santrifüj hızını değiştirerek çeşitli hücre tiplerine ve süreçlerine kolayca uygulanabilir. Protokolümüz, manuel işlemle karşılaştırıldığında daha kısa işlem süreleriyle yüksek hücre kurtarmasını gösterdi. Otomatik işlemden kurtarılan hücreler de çoğalma oranlarını korudu. Cihaz, arabellek değişimi, hücre formülasyonu ve kriyopreservation gibi adımları karşılamak için kapalı bir üretim sürecinde modüler bir bileşen olarak uygulanabilir.

Bu protokolde, otomatik arabellek değişim sürecini göstermek için Jurkat hücreleri ve MSC'leri temsili örnekler olarak kullandık. İşlem sırasında Jurkat hücreleri ve MSC'ler aynı işlem adımlarını, akış hızını kontrol eden santrifüj kuvvet ve pompa hızı farklılıkları ile paylaşmış(Tablo 1). Şekil 2, tampon değişim işlemi sırasında akışkan hücre yatağının nasıl görünebileceğine kamera tarafından çekilen temsili görüntüleri g...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing at JoVE.com

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Otomasyon, hücre üretiminde yükseltme ve maliyet yönetiminin anahtarıdır. Bu el yazması, küçük ölçekli biyoişleme için arabellek değişimi ve hücre konsantrasyonu adımlarını otomatikleştirmek için bir karşı akış santrifüj hücre işleme cihazının kullanımını açıklar.

Küçük Ölçekli Hücre İşleme için Otomatik Karşı Akım Santrifüj Sistemi

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

Bu protokol, küçük ölçekli hücre üretimi için kapalı otomatik arabellek değişimi ve konsantrasyonu için bir çözüm sağlar. Daha da önemlisi, tampon değişimi yüksek bir kurtarma ve konsantre ürün çok küçük bir hacim teslim ile yapılabilir. Yeni kullanıcılar tüm otomasyon adımlarını takip etmekte zorlanabilir.Bu adımları programlama ve orta ile test çalışır gerçekleştirme pratik cihaz aşina olmak için iyi yollardır. Tampon değişimi başlamadan önce, bir sınıf iki laminar akış kafası, 500 mililitrelik tuzlu çanta dan tuzlu çözelti 50 mililitre kaldırmak için bir şırınga ve iğne montaj kullanın. Bu hacmi %20 insan serum albumininin 50 mililitresi ile değiştirin ve kültür damarlarından ilgi hücrelerini toplayıp.Saydıktan sonra, hücreleri bir aktarım çantasına yüklemek için şırıngayı kullanın ve aktarım torbasını tek kullanımlık işleme kitine bağlamak için Luer kilidini kullanın. Daha sonra önceden hazırlanmış yıkama tampon çantasını tek kullanımlık işleme kitine bağlayın. Otomatik arabellek değişimi ayarlamak için aygıtın grafik kullanıcı arabirimini açın ve başlat düğmesini tıklatın.Yeni bir protokol oluşturmak için yeniyi tıklatın ve açılacak ve kapatılmak üzere vanaları, santrifüj ve pompa hızlarını, pompa yönünü ve eylemi tetiklemenleri seçmek için denetimi tıklatın. Tüm parametreler ayarlandığında kaydet'i tıklatın. Bağlı uygun çantaları cihaza asın ve tek kullanımlık işleme kitini makineye yerleştirin.Ardından bağlan düğmesini tıklatın ve kaydedilen programı indirin. Oynat düğmesi yandığında protokol başlatılacak şekilde hazırdır. Otomatik arabellek değişimini gerçekleştirmek için, transfer çantası tüpü için manuel kelepçeleri açın ve arabellek değişim programını başlatmak için başlat'ı tıklatın.Otomasyon adım altı sonunda, süreç şimdi boş torbada hava tarafından kabarcık sensörü tetikleme nedeniyle duraklayacaktır. Çanta gerçekten boşsa, işlemi bir sonraki adıma taşımak için yanına basın. Otomatik işlem tamamlandığında, tüm boru kelepçelerini kapatın ve cihazın kapısını açın.Ardından tek kullanımlık kiti cihazdan çıkarın ve sonraki analiz için hücrelerin toplanması için şırınganın bağlantısını kesin. Tipik olarak, akışkan hücre yatağı, bu görüntüde, koninin ortasında ve önüne doğru biriken hücreler, hücrelerin birikmediğinin olduğu odanın ucundaküçük bir boşluk ve hücre yükleme girişi içinde görünür bir açıklıkla görünür. Akışkan hücre yatağı, farklı bir viskozite veya yoğunlukta yeni bir tampon tanıtılırken sıkıştırılabilir.Ölü hücreler daha küçük ve daha hafif olduğundan ve akış hızını artırarak odanın dışına çıkmaya zorlanabilirken, canlı hücreler için yüksek akış hızı uygulanabilir. Arabellek değişimi işlem süresinin otomatik işlemi, el ile arabellek değişim işleminden daha kısadır. Bu analizde, manuel ve otomatik işlemler arasındaki kurtarma oranları test edilen her iki hücre türü için de benzerdi ve hücre nin canlılığı her iki işlemden de etkilenmedi.Kurtarılan hücreler benzer çoğalma oranları, sitokin üretme yeteneklerini ve işleme türüne bakılmaksızın ideo-aktiviteleri gösterdiler. Bu protokolün yalnızca bir kılavuz görevi gördüğünüzde, kullanıcıların akış hızını ve santrifüj hızını hücre türüne ve arabelleğine göre programlamaları gerektiğini unutmamak önemlidir. Arabellek değişimi hücre kültürü genişleme veya kriyopreservation ve formülasyon takip edebilir hücre üretiminde bir ara adımdır.Amaç, tüm süreci içine almanın yollarını geliştirmektir. Karşı akış santrifüj çok yönlü bir platformdur. Gelecekteki çalışmalar, ölü hücre kaldırma ve bir korisis üründen mononükleus hücre izolasyonu gibi hücre seçimiuygulamaları araştıracaktır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Doku Mühendisliği için elektrospinning Liflerin Postprodüksiyon İşleme

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Tüm Blood adlı ultrasensitive Protein Algılama için Tam Otomatik Santrifüj mikroakışkan Cihazı

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Otomatik slayt tarama ve segmentasyon Fluorescently etiketli dokularda Widefield yüksek-içeriği analiz sistemi kullanılarak

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...