Name: clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues
Uploaded: 2019-10-23T14:30:00
Duration: 7 min 41 s
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我们感谢叶夫根尼·伊瓦什金博士提供的方法学建议。这项工作得到了瑞典研究理事会（A.S.C）、俄罗斯科学基金会（向ASC提供#19-15-00241赠款）、卡罗林斯卡研究所（A.S.C.）、斯特拉特根基和斯蒂夫特森·科农·古斯塔夫五世（A.S.C.）、斯蒂夫特森（A.S.C.）的财政支助。弗里穆拉雷·巴努塞特和萨尔斯卡佩特·巴纳瓦尔德（P.T.N.），中国奖学金委员会（B.Z.）。共聚焦显微镜由克努特和爱丽丝·沃伦伯格基金会资助。

所有小鼠工作均获得动物实验伦理委员会（斯德哥尔摩北区委员会/Norra Djurfársáksetiska N_md）的批准，并根据瑞典动物局《动物实验规定和准则》进行。
1. 小鼠繁殖
<ol><li>要生成应变，请与感兴趣的 Cre 线交叉 R26R-纸屑鼠标。在21天大的时候把小狗的性。 注：小鼠可用于从大约8周的年龄繁殖，或根据当地指南。基因分型（此处未描述）可以从在钳炎时收集的活检中进行。可以根据当地指南调整分月。</li>
</ol>2. 纸屑标签
注：此标签策略适用于他莫西芬诱导的Cre菌株。
<ol><li>在玻璃瓶中的玉米油中制备高达2.5mg/mOxifen的溶液。在烤箱中加热至 37°C 溶解长达 60 分钟，每 5 分钟使用涡旋搅拌一次，直到粉末溶解。 注：对于增加剂量的他莫西芬，可以使用此方法制备高达20mg/mL的溶液。</li>
	<li>在4°C下储存长达3个月，防光。</li>
	<li>通过在第一个产后日（P1）在玉米油中溶解50μL的2.5mg/mL他莫西芬诱导重组。 注：原则上，他莫西芬可以在任何年龄施用，最早在F1一代。他莫西芬的剂量应根据Cre表达、小鼠年龄和实验应用而变化。更多信息请参阅讨论部分。以同样方式治疗的Cre阴性小鼠可用作纸屑荧光信号的阴性对照。 注意：确保动物处理者收到使用他莫西芬的警告，并确保根据当地环境和安全准则处置笼子材料。</li>
</ol>3. 组织收集
<ol><li>在产后第27天（P27）对小鼠实施安乐死，通过逐渐填充含有二氧化碳的空间，其体积至少达到80%，并保持3分钟的浓度。在解剖其他动物时，将老鼠放在冰上。</li>
	<li>挖出感兴趣的组织。概述如下是一个协议，用于收集近端和远端股骨生长板和关节软骨的膝盖，适合产后小鼠6个月。<ol>
<li>使用锋利的剪刀和齿钳，将后肢周围的皮肤取出至脚部。</li>
		<li>用锋利的剪刀粗略修剪腿部的肌肉和脂肪组织。 注：不要完美地清洁骨骼，因为周围的组织在切片时提供一些结构支持，但可确保去除所有皮肤。</li>
		<li>使用手术刀，切开腿部顶部与身体相交的软组织，直到股骨头可见，然后切开髋关节的韧带以切除腿部。 注：或者，如果找不到股骨头，用强力剪刀切开靠近臀部的股骨。</li>
		<li>用手术刀或锋利的剪刀从腿的其余部分切除脚部。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 组织固定和处理
注：根据感兴趣的组织，遵循下面详述的两种方案之一（4.1 用于软组织，4.2 用于年龄超过 45 天的矿化小鼠组织，详情见下文）。对于这两种方法，将解剖样品储存在冰上3.7%甲醛/磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中，同时解剖剩余的动物。
<ol><li>对于软组织和矿化的 tibiae 和 femora，在大约 P45 的年龄，将组织固定在预冷却的 3.7% 甲醛/PBS 中 6 小时，在 4°C 的旋转器上轻轻滚动。使用比组织体积至少大10倍的体积。继续直接步骤 4.3。</li>
	<li>对于矿化组织，包括年龄超过P45的头骨和女性，需要分化步骤。<ol>
<li>使用氢氧化钠将pH调整至8.05，制备1L的10%EDTA/dH2O溶液。接下来，使用这种溶液将甲醛稀释至3.7%。EDTA 的工作浓度为 9%。</li>
		<li>将预冷却的 3.7% 甲醛/PBS 放入预冷却的 3.7% 甲醛/PBS 中过夜，在 4°C 下轻轻滚动在旋转器上，从而修复组织。</li>
		<li>将组织放入预冷却的3.7%甲醛/9%EDTA/dH2O溶液（pH 8.05），在4°C下轻轻旋转，体积至少比组织体积大10倍。重复此步骤，将骨骼放入新鲜预冷却的 3.7% 甲醛/9% EDTA/dH2O，在接下来的 48 小时内进行 3 倍。 注：这种短的去钙化足以分割多达6个月大的小鼠的股骨和骨骼。对于更密集的矿化组织，可能需要进一步去钙化，以改善组织学。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将组织转移到预冷却的30%蔗糖/dH2O中。确保将容器填充到边缘，并在4°C下轻轻旋转过夜。使用比组织体积至少大10倍的体积。当第一次放入此溶液中时，组织通常会浮动，并在早晨下沉到瓶子的底部。</li>
	<li>要去除残留的蔗糖溶液，请用钳子将其从蔗糖溶液中取出，用大约 5 ml 的最佳切削温度化合物 （OCT） 完全覆盖样品几秒钟，从而短暂清洗组织。</li>
	<li>用 OCT 填充预标记的冷冻体，并将组织放在底部。快速工作，避免样品在室温下长时间等待。 注： 将样品放在切片步骤的方便位置非常重要。要增加使用 Col2CreERT：Confetti 进行跟踪后在整个生长板柱上切片的机会，请使用股骨头作为引导，将中侧朝下放置，并将样品定位为尽可能平放在模具底部。</li>
	<li>将模具放在干冰上，等待 OCT 完全凝固，将样品嵌入。将低温部分尽可能平放，以避免组织在模具中移动/滑动。完成后，如果样品未立即使用，则储存在-20°C。 注意：在 12 周内使用，因为随着年龄的增长，方块变得更难分割。</li>
</ol>5. 分段
注：使用适合硬组织一次性刀片的低温切片。任何标准低温器都适用。
<ol><li>将块从模具中取出，并通过在块顶部和夹头之间应用 OCT 并将其固定到夹头，并在 -20°C 的低温中冷却至少 5 分钟，使 OCT 完全凝固。</li>
	<li>将样品架和刀片支架预冷却至-20°C，然后将样品/夹头放在夹头支架中，将刀片置于刀片支架中，以平衡几分钟。 注：根据低温和感兴趣的组织，指定温度可能变化几度。</li>
	<li>使用低温切割块和切割适当厚度的组织部分，以便对感兴趣的组织中克隆进行可视化。<ol>
<li>对于产后生长板分析，准备30~160μm的截面，并在幻灯片上收集。某些低温模型可能只允许使用修剪设置收集粗截面。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在室温下空气干燥滑轨，直到完全干燥。 注： 此步骤的持续时间可能因组织特性和切片厚度而异。房间的温度也可能会影响此步骤的速度。</li>
	<li>将幻灯片在 -20°C 处存放长达 36 个月，如果立即处理，则继续执行步骤 6.2。</li>
</ol>6. 滑动准备和安装
<ol><li>从冰柜中取出滑轨，在滑动支架中水平升高室温。允许任何冷凝蒸发。</li>
	<li>使用巴斯德移液器将 OCT 移至幻灯片上，在室温下轻轻涂抹 PBS。部分越厚，所需的时间越长。对于 160 μm 厚的部分，进行两次冲洗：孵育一次 15 分钟，取出液体，然后涂抹新鲜 PBS 5 分钟并取出液体。 注：此步骤旨在移除 OCT，并可根据组织特性和切片厚度（视情况而定）进行变化。房间的温度可能会影响此步骤的速度。</li>
	<li>在室温下将滑轨安装在 75% 2，2-二-二-二-二醇/dH2O 溶液中，并采用 60 mm 长盖滑片。 注：在成像前可以立即准备幻灯片，但如果在4°C的加湿室中挡在光外，荧光信号将稳定1⁄2周。</li>
</ol>7. 通过共聚焦显微镜成像
<ol><li>设置显微镜。<ol>
<li>打开显微镜并打开软件。单击"开始系统"按钮。</li>
		<li>首先单击"采集"选项卡下的智能设置，然后选择与红色荧光蛋白 （RFP）、黄色荧光蛋白 （YFP） 和青色荧光蛋白 （CFP） 对应的三个通道，选择通道。染料标题。单击"最佳信号"，然后应用以选择激光器。 注："获取"选项卡的内容显示在补充文件 1A中。如果所需通道不存在，请使用Dye标题下的"+"按钮添加它们。补充文件1B-D中显示了有关激光、激发波长和记录发射波长范围的必要信息。</li>
		<li>在"采集模式"选项卡的"目标"标题下选择 20x 物镜。</li>
	</ol></li>
	<li>找到生长板或其他感兴趣的组织。<ol>
<li>要提供独特的视图，请先通过单击"通道"选项卡中的名称来选择 RFP 通道。这将导致 RFP 通道的详细信息显示在"光路"选项卡中。单击T-PMT旁边的复选框。 注：T-PMT通道显示非反射激光，用于可视化组织的非荧光部分。</li>
		<li>将幻灯片放在滑架中，将生长板或其他感兴趣的组织直接放置在光路和物镜之间。</li>
		<li>为了简化组织本地化，请使用"通道"选项卡的"轨道"标题下的勾选框取消选择 YFP 和 CFP 通道。</li>
		<li>通过单击"轨道"标题中的名称来选择 T-PMT 通道。单击"采集"选项卡中的"实时"，并增加 T-PMT 通道的增益（主），以便可视化屏幕上的组织部分（灰度显示）。</li>
		<li>使用操纵杆移动幻灯片位置以定位感兴趣区域，然后使用适当的显微镜旋钮对焦。</li>
		<li>单击"采集"选项卡中的"停止"以关闭激光曝光。</li>
	</ol></li>
	<li>定义成像参数。<ol>
<li>使用"频道"选项卡中的勾选框选择其中一个通道，然后单击"获取中的实时"选项卡以在屏幕上显示该通道的图像。然后，使用鼠标上的左键单击按钮，调整滑动条以设置收集的发射的荧光信号的范围、激光功率（激光标题下的滑动条）、增益（主）和数字偏移。 通道选项卡可在屏幕上可视化贴片标记的单元格。所有这些参数的指南值在 RFP、YFP 和 CFP的补充文件 1B-D中提供。逐个完成每个通道的此步骤。 注： 为了确保可视化信号不是自荧光，在此步骤中，来自 Cre 负动物的部分可用作负控制。由于 T-PMT 已与 RFP 激光（步骤 7.2.1）结合使用，因此调整 RFP 的激光功率将影响 T-PMT 信号。</li>
		<li>如有必要，调整针孔尺寸以增加荧光检测。 注： 针孔尺寸越高，Z 方向检测到的荧光信号越多。这方面的指导原则是由此产生的 Airy Unit （AU），该单元在针孔指示器下方自动指示，其中 1 AU 是成像质量的最佳值。增加AU太多会损害以后的分析，因为在Z方向中区分单个细胞变得更加困难。</li>
		<li>检查设置以确保记录的信号不会重叠。<ol>
<li>单击"通道"选项卡中的勾选框以选择所有三个通道，然后按"获取"选项卡中的"捕捉"按钮。</li>
			<li>在结果图像中，通过单击"尺寸"选项卡中每个列出的通道上方的蓝色突出显示框，在显示的通道之间滚动。如果信号重叠（例如，如果每个红段也是黄色的），则返回到步骤 7.3 的开头并重复，调整重叠通道的参数，直到它们彼此区分。确保每个标签（即 RFP、YFP 或 CFP）至少可以可视化一个仅包含一个标签的克隆。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>获取图像。<ol>
<li>选择"采集模式"选项卡，使用"帧大小、速度和平均数"值指定图像质量。 注：这些实验的典型设置在补充文件1A中指示。在"采集"选项卡中的"扫描区域"标题下减小"缩放"可以增加视野，而不会更改图像采集所需的时间。</li>
		<li>在"获取"选项卡中，在"尺寸采集"标题下，单击Z-Stack复选框。打开Z 堆栈选项卡，将 Z 方向图像之间的间隔设置为 2.5 μm。</li>
		<li>要设置正确的位置，请在"通道"选项卡中仅选择 RFP/T-PMT，然后单击Live以可视化具有组织可见轮廓的红色克隆。通过单击相应切片上的"设置第一个"和"最后一个"来设置第一个和最后一个切片，使用显微镜旋钮调整焦点。</li>
		<li>单击"获取"选项卡中的"磁贴扫描"选项卡，并在相应框中输入水平和垂直方向中的切片总数。</li>
		<li>对于图像捕获，在"通道"选项卡中选择所有所需的通道，然后单击"捕捉"按钮以收集单个图像，单击"开始实验"按钮以收集Z 堆栈/Tile 扫描。</li>
	</ol></li>
	<li>获取图像后，单击"文件然后另存为"，然后将图像保存为文件类型，以保留尽可能多的有关显微镜设置的信息，以便以后查看和重复使用。</li>
	<li>使用图像分析软件执行进一步分析。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

纸屑模型被广泛用于研究矿化软骨组织12，13，14和描述优化的协议。一个副本或两个R26R-纸屑等位基因的纸屑小鼠2可用于育种和实验。在具有一个Brainbow 2.1构造等位基因的小鼠中重组将给出四个潜在的标签：红色荧光蛋白（RFP、细胞质）、黄色荧光蛋白（YFP、细胞质）、青色荧光蛋白（CFP、膜局部）和绿色荧光蛋白（GFP，细胞核局部），而同源纸屑小鼠的重组（即包含两个Brainbow 2.1结构的副本）将给出10个可能的颜色输出（RFP+RFP，RFP_YFP，RFP+CFP，RFP+GFP，YFP_YFP，YFP_CFP，YFP_CFP，YFP_CFP，YFP]YFPGFP、CFP+CFP、CFP+GFP、GFP+GFP）。然而，由于DNA切除和反转事件以随机方式发生，重组产生GFP只发生在一小部分细胞中，如先前报道的2，并且似乎因细胞类型或Cre线使用2不同。12，13.因此，由于导致GFP表达式的重组事件发生率较低，六种颜色输出在同源纸屑小鼠中最为常见。
在规划纸屑小鼠的实验时，一个重要的考虑因素是找到合适的Cre应变。首先，由于五彩纸屑等位基因有几个 loxP 站点，因此一个重组事件不排除第二个4。这意味着，如果对单元格进行标记并进行分割以生成一种颜色的克隆，则其子单元格中的第二个重组事件将生成不同的颜色，从而掩盖真正的克隆展开。因此，不可诱导的Cre菌株，如果相应的启动子是活跃的，酶总是活跃的，是不可取的。其次，在一些菌株中，Cre重组酶的表达往往以牺牲内源性蛋白质为代价，从而创造出自己的表型（例如，Prg4-GFPCreERT2敲鼠菌株，其中小鼠携带两个克雷塞勒15），因此，一个单一的克雷等位基因的副本是可取的。在描述的所有实验中，由雄性或雌性父母携带一份Col2CreERT16，以产生Col2CreERT：纸屑小鼠，如描述13所述。其次，Cre线对感兴趣的细胞类型的特异性是一个重要的考虑因素。例如，Col2CreERT是软骨细胞特异性，但标签几个不同的软骨细胞种群在产后软骨17。最后，不同Cre菌株的活动可以随动物年龄而发生显著变化，因为用于Cre表达的启动子的内源性活动，即使在同一类型的细胞中（例如Prg4-GFPCreERT2）中，也可能需要增加将表面区域细胞标记为小鼠年龄为 15的他莫西芬剂量数。
标记细胞的数量将由给予的他莫西芬的量来反映，因此并不总是需要给出最大剂量，因为区分克隆彼此可能很困难。由于 Cre 表达会根据不同促进剂以及年龄的变化而变化， 塔莫西芬的剂量将需要调整以优化标签.需要注意的是，细胞在触发重组时不会立即荧光，因为需要时间才能进行重组，并且产生的荧光蛋白足以积累以进行成像。需要广泛的小时（24-72小时之间），这似乎受Cre线、细胞型和动物年龄的影响。由于他莫西芬在施给18后长期具有生物活性，因此建议彻底检查每种型号的重组效率。
在共聚焦显微镜步骤中，荧脂荧光蛋白的激发需要激光穿透组织。由于不同的组织具有不同的特性，激光可能无法穿透所有组织的 160 μm 厚的部分。然而，这种厚部分可用于生长板软骨，如图2，图3所示。请注意，每台显微镜都不同，并且描述中的设置 （补充文件 1） 不太可能在不进行细微调整的情况下完美工作。主要挑战之一是区分不同的荧光蛋白，以确保从一个通道到另一个通道没有污染。例如，YFP通道中由来自GFP的荧光引起的信号在YFP和RFP通道之间重叠。还必须仔细检查 YFP 和 CFP 通道。这可以通过多种方式完成。首先，可以缩小每种荧光蛋白的荧光波长的发射范围。其次，结合数字增益调整激光功率可以优化信号。在这项研究中，这些步骤已经足够了，但它们依赖于强烈的荧光信号。这意味着，从理论上讲，低效的组织处理会降低荧光蛋白的活性，或者弱激光光源会损害通道分离。
纸屑小鼠的优点之一是，它可以与大量的基因突变菌株相结合，从而可以研究特定基因对克隆动力学的影响10，11，12 ，13，14，19，20，尽管有一些限制。例如，当使用基于Cre loxP的突变体与克隆系谱追踪时，不能分离纸屑等位基因和感兴趣的基因的重组。然而，这种重合重组事件可以生效10，14，20。例如，这种可能性用于探索生长板21中TSC1的产后软骨细胞特异性消融后小鼠休息区增加的细胞数，并揭示这些细胞之间的克隆关系。13.此外，使用纸屑小鼠的组织特异性克隆分析可用于非基于CcreloxP的突变小鼠11，并且也可以将这些方法与药理学8、9相结合 ，13和/或手术模型8，以可视化克隆对其他功能扰动的反应。当将纸屑标记部分与免疫荧光对内源性蛋白质的免疫检测相结合时，会出现更多机会。这种分析允许识别被追踪的细胞及其与已知标记的共定位。使用本文所述的固定方法，可以进行免疫荧光，并且仍然可视化来自纸屑荧光蛋白12，13的荧光。然而，在上述论文中，不需要抗原检索。苛刻的抗原检索方法，如在青酸盐缓冲液中煮沸，导致纸屑完全丧失。虽然可以使用抗体22检测出五彩纸屑荧光蛋白，但克隆身份的丧失可能发生。
总之，使用纸屑模型标记体内的细胞是分析这些细胞随时间而的命运的信息工具。所述方法为直接可视化矿化组织中荧光蛋白表达提供了一种快速有效的方法。

在使用动物模型时，改进监测细胞行为的方法是为了提高实验效率。监测体内细胞行为的最翔实的方法之一是用多色报告器小鼠菌株1进行克隆系追踪，包括广泛使用的R26R-纸屑（纸屑）小鼠2。通过用荧光蛋白对单个细胞进行基因标记，并随着时间的推移跟踪这些细胞，许多领域的研究人员都使用纸屑小鼠揭示了对许多不同的生物系统的见解。
纸屑小鼠是一个基于loxP的检测系统，其中Cre依赖性DNA重组导致几种可能的荧光蛋白之一以随机方式永久表达2。R26R-五彩纸屑等位基因包括无处不在的CAGG启动子，它位于一个loxP的NeoR-盒2的上游，其多基因化序列终止转录3，然后Brainbow 2.1 构造4.因此，Cre介导的重组同时切除NeoR-盒，并导致某些荧光蛋白的产生，这取决于Brainbow 2.1结构的哪个部分被切除。此功能使纸屑小鼠具有极强的适应性，因为它可用于针对小鼠中具有特定 Cre 应变的任何细胞群。组织特异性Cre菌株与R26R-纸屑菌株的交叉提供了标签的特异性。然而，Cre菌株也应该是可诱导的（例如，CreERT或CreERT2，它们需要他莫西芬结合才能使它们进入细胞核并诱导DNA重组5），以便在指定的时间点实现标记。因此，细胞群可以通过在所需时间点注射出的CreERT阳性/纸屑阳性后代，并跟踪到一定年龄，从而收集感兴趣的组织进行分析。组织处理后，荧光标记细胞可以通过共聚焦显微镜直接可视化，以便每个最初标记的细胞的后代可以从任何其他标记细胞基于其特定荧光生成的后代中分离出来标签，从而可以评估克隆度（即克隆遗传追踪）。
由于纸屑模型的灵活性，它已被应用于研究在健康和疾病2，6，7，8，9， 许多不同的组织的发展和维护， 10，11.使用该模型的一种常见方法是标记特定细胞群，并确定它们（和/或其后代）对哪些组织做出了贡献。使用这种方法的一个这样的发现是，成人牙齿是由具有胶质起源的细胞6组成。该模型的另一个应用是研究干细胞平衡。例如，五彩纸屑模型显示，肠道密码中的干细胞利基逐渐成为单克隆，因为一些干细胞克隆在干细胞2之间的竞争中占据主导地位。该模型还可用于评估细胞增殖，这对于研究缓慢分裂的细胞特别有用。例如，评估了关节软骨12的克隆形成，并研究了刺猪拮抗剂对生长板软骨细胞的短期影响。
尽管五彩纸屑模型相对简单，但荧光信号在技术上很难保存，直到图像收集，尤其是在分析矿化组织时。在这里，该协议描述了一个优化的模型，将五彩鼠与产后骨骼（最多6个月大）结合使用，使荧光蛋白能够直接通过共聚焦显微镜进行可视化，而无需免疫检测。这种简化的协议可以应用于非矿化组织。此外，还包括如何存储样品，以便长时间保存荧光信号至少3年的说明。图 1中给出了协议的大纲。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-thiodiethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCF9328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm-long cover slips</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>220588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold (standard)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Model: NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cryostat blades</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>207500014</td>
			<td>Specifically for use with hard tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Scharlan</td>
			<td>AC0960005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde concentrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18708.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V7130</td>
			<td>Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software for 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>11-8162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>102094-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06498.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost UltraPlus slides</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware for Confocal laser scanning microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues

给体内的单个细胞贴上标签，以监测其产生和跟踪其通过生物体的迁移或确定其寿命，是揭示组织发育和维护机制的有力方法。目前用于监测体内细胞的最重要工具之一是纸屑小鼠模型。Confetti 模型可用于以细胞类型特定的方式对活小鼠中具有各种荧光蛋白的单个细胞进行基因标记，并监测它们的命运，以及它们后代随时间的变化，这个过程称为克隆基因追踪或克隆系系追踪。这个模型产生于近十年前，有助于加深对许多生物过程的了解，特别是与干细胞生物学、成人组织的发育和更新有关。然而，在图像采集和同时捕获各种荧光信号之前保留荧光信号在技术上具有挑战性，尤其是对于矿化组织。本出版物描述了使用纸屑模型分析可应用于任何矿化或非矿化组织的生长板软骨的分步协议。

为了在表皮软骨中标记软骨，并使用P1上的他莫西芬给法来形象地显示其克隆扩张，Col2CreERT：纸屑小鼠被标记，其后肢在P27上被收集。通过可视化十字韧带（图2A）和近端侧生长板中的克隆被可视化（图2B）来确定中心部分。这些数据表明，在P1上Col2阳性的单个细胞在施用他莫西芬时被贴上了纸屑荧光蛋白的标签，进行了克隆扩张，随后一直留在生长板中，直到P27。克隆扩张从类似的发展时间点的初始变化见于最近出版的第13号图1。
为了举例说，在长期存储后的荧光信号（步骤5.5），收集的部分在准备和成像之前立即存储了3年以上（见图2A，B），然后进行成像（图2C，视频1）.
为了演示协议的一些常见问题，在低温分段步骤中损坏的部分如图3A所示。图3B中扩大的部分区域（生长板和关节软骨之间）表明，这种剂量的他莫西芬导致这一区域的高度重组，从而排除了克隆分析。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig01.jpg"> 图 1：实验概述。汇总方法关键阶段的流程图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig02.jpg"> 图2：来自Col2Creert：纸屑鼠标的纸屑图像。（A） Col2CreERT的样品：无去钙化或长期储存步骤处理的纸屑小鼠。中央部分使用十字韧带作为标记。使用 T-PMT 检测 RFP 后，使用切片扫描（缩放条 = 300 μm）可使用此图像进行可视化。（B） 在 3D 重建后，克隆柱显示在生长板的近端内可见 （A） 中。（C） 在长期储存超过3年的情况下，处理了与A）和（B）所示的相邻幻灯片，用于成像和3D重建。RFP、YFP 和 CFP 显示在 （B） 和 （C） 中 （刻度柱 = 50 μm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig03.jpg"> 图 3：使用方法时的挑战。（A） 白色虚线通过 Col2CreERT 的生长板勾勒出部分的分割：纸屑小鼠（刻度条 = 50 μm）。白色框内的面积以 （B） （刻度条 = 25 μm） 显示。RFP、YFP 和 CFP 显示在两个面板中，非反射激光 （T-PMT） 通道也显示在（A） 中，以可视化组织。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
视频1：从Col2CreERT：纸屑鼠标生长板的三维重建。从 Col2CreERT 准备的幻灯片：纸屑鼠标在切片后长期存放 3 年以上，然后处理以进行成像。使用图像分析软件自动进行三维重建，并作为视频导出。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/video_1.mov" target="_blank">请点击此处下载此视频。</a>
补充文件1：共聚焦显微镜的典型设置。（A）采集选项卡中存在的主要控件 . （B+D） 显示三个纸屑荧光蛋白的激光参数、激发波长和记录发射波长的范围。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424supfig01.jpg" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

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Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

该方法描述了使用R26R-纸屑（纸屑）小鼠模型来研究矿化组织，涵盖了从育种策略到图像获取的所有步骤。包括一个可应用于所有软组织的一般协议和可应用于矿化组织的改良协议。

使用纸屑小鼠研究矿化组织的克隆遗传追踪

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

通过基因标记单个细胞的荧光蛋白，并跟踪这些细胞随着时间的推移，纸屑鼠标使研究人员揭示了许多生物过程的新见解。我们的协议最大限度地减少了组织采集和成像之间的滞后时间，可应用于任何矿化或非矿化组织，并保存荧光数年。这种方法对于再生医学和发育生物学的所有领域都非常有用，因为它可以应用于不同的细胞群，研究它们的命运和动力学，只要有合适的Cre线可用。我们的分步说明将展示区分不同荧光蛋白发出的荧光信号差异的最具有挑战性的步骤。首先准备小鼠组织进行成像。对于软组织和矿化头骨和女性从小鼠长达45天，固定在预冷3.7%甲醛PBS的组织，并在4摄氏度孵育6小时，同时轻轻地滚动在旋转器上。对于 45 天以上的小鼠的矿化组织，如头骨和女性，使用该溶液，准备一升 10%EDTA 溶液，用氢氧化钠将 pH 调整为 8.05，并使用该溶液将甲醛稀释至 3.7%。将组织在4摄氏度下过夜，将甲醛PBS留在3.7%中，以固定组织。第二天，将其放入预冷甲醛EDTA溶液中，在4摄氏度下孵育，同时旋转48小时，确保在孵化过程中更换溶液三次。然后将组织放入预冷的 30% 蔗糖中，确保将容器填充到边缘，并在 4 摄氏度下轻轻旋转过夜。在早上，使用钳子从蔗糖溶液中去除组织，并在五毫升的最佳切削温度化合物（或 OCT）中冲洗几秒钟。用 OCT 填充预先标记的低温，将组织放在底部，快速工作，以避免样品在室温下坐得太久。将模具放在干冰上并等待 OCT 凝固，从而嵌入样品。如果不立即使用样品，它们可以储存在零下20摄氏度。从模具中取出块。在块的顶部和夹头之间应用 OCT，并在低温恒温器中冷却至少五分钟，或直到 OCT 完全凝固。将样品架和铲刀架预冷至零下 20 摄氏度，然后将样品放在夹头支架和刀片架中，让其平衡几分钟。对于产后生长板分析，准备30至160微米的截面。使用低温恒温器将块和切割组织部分修剪到合适的厚度，并在幻灯片上收集它们。然后在室温下空气干燥幻灯片，直到它们完全干燥，并在零下 20 摄氏度下储存长达 36 个月。准备好使用幻灯片时，将其从冰柜中取出，并将其带到幻灯片支架中的室温。要拆下 OCT，请用巴氏移液器轻轻将 PBS 涂抹在幻灯片上。对于 160 微米厚的截面，孵育幻灯片 15 分钟，取出液体并涂抹新鲜 PBS 5 分钟以上。在室温下，用 60 毫米长的盖滑将幻灯片安装在 75%硫化乙醇溶液中。首先，在通道选项卡中单击 RFP 通道，从而使通道的详细信息显示在光路选项卡中。然后单击 T-PMT 旁边的复选框。将幻灯片放在滑动架中，将感兴趣的组织直接放在光路和客观透镜之间。要本地化组织，请取消选择通道选项卡轨道标题下的 YFP 和 CFP 框。在轨道标题中选择 T-PMT 通道，然后单击采集选项卡中的"实时"，并增加 T-PMT 通道的增益，以便在屏幕上可视化组织选择。使用适当的显微镜旋钮调整幻灯片的位置以定位感兴趣区域和焦点。然后单击采集选项卡中的"停止"以关闭激光曝光。根据手稿说明定义成像参数，必要时调整针孔尺寸。检查设置以确保记录的信号不重叠，然后在通道选项卡中选择所有三个通道，然后按下捕捉按钮。单击尺寸选项卡中每个通道上方的蓝色突出显示框，然后手动检查屏幕上的通道之间的重叠，从而在生成的图像中的显示通道之间滚动。如果信号重叠，请重新调整参数，直到它们能够彼此区分。该协议用于标记包骨细胞在表皮软骨和可视化其克隆扩张与年龄。中心部分通过可视化十字韧带确定，并成像近侧三侧生长板中的克隆。在塔莫西芬给药后，Col2阳性并被贴上五彩纸屑荧光蛋白标签的单个细胞，经过克隆扩张，随后留在生长板中。长期储存后，荧光信号可以可视化。在准备和成像之前，有些部分被储存了三年多。使用图像分析软件自动进行三维重建，并导出为视频。在冷冻步骤中断开的一部分包含一个重组程度如此高的区域，它可以防止克隆分析，从而演示了此协议遇到的常见问题之一。根据您的研究问题，使用专门标记您感兴趣的细胞的Cre线可能非常重要。因此，我们建议在重组后不久检查这些细胞中的荧光。使用可致性Cre线至关重要，因为在非可读Cre线中正在进行的DNA重组可以改变溶质细胞的荧光轮廓，从而排除克隆分析。该协议可以与功能扰动相结合，如基因操纵菌株，药理治疗，手术干预，以及免疫荧光染色的准备部分。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

利用共聚焦分析<em&gt;非洲爪蟾</em&gt;调查的Wnt和Shh形态发生素梯度的调节剂

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

科研

发育生物学

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

方法对角膜细胞的谱系追踪使用多色荧光记者小鼠

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

心肌细胞DNA的合成和倍性的同时评价：一个方法来帮助心肌细胞再生和营业额的量化

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

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