Name: clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues
Uploaded: 2019-10-23T14:30:00
Duration: 7 min 41 s
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Wir danken Dr. Evgeny Ivashkin für die methodische Beratung. Diese Arbeit wurde vom Swedish Research Council (A.S.C),The Russian Scientific Foundation (Grant #19-15-00241 an ASC), Karolinska Institute (A.S.C.), StratRegen KI und Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-srsfond (A.S.C.), Stiftelsen, finanziell unterstützt. Frimurare Barnhuset und Sallskapet Barnavard (P.T.N.), Chinese Scholarship Council (B.Z.). Das konfokale Mikroskop wurde von der Knut and Alice Wallenberg Foundation finanziert.

Alle Mausarbeiten wurden vom Ethikausschuss für Tierversuche (Stockholm North Committee/Norra Djurförsöksetiska Nämd) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Bestimmungen und Richtlinien der Schwedischen Tieragentur für Tierversuche durchgeführt.
1. Mauszucht
<ol><li>Um die Spannung zu erzeugen, überqueren Sie die R26R-Konfetti-Maus mit der Cre-Linie von Interesse. Entwöhnen Sie die Welpen im Alter von 21 Tagen. HINWEIS: Mäuse können für die Zucht ab ca. 8 Wochen alt oder nach den lokalen Richtlinien verwendet werden. Genotypisierung (hier nicht beschrieben) kann aus Biopsien durchgeführt werden, die bei der Entwöhnung gesammelt werden. Das Alter bei der Entwöhnung kann gemäß den lokalen Richtlinien angepasst werden.</li>
</ol>2. Konfetti-Etikettierung
HINWEIS: Diese Etikettierungsstrategie eignet sich für tamoxifen induzierbare Cre-Stämme.
<ol><li>Bereiten Sie eine Lösung von bis zu 2,5 mg/ml Tamoxifen in Maisöl in einer Glasflasche vor. Durch Erhitzen auf 37 °C im Ofen bis zu 60 min auflösen und alle 5 min mit einem Wirbel aufrühren, bis sich das Pulver aufgelöst hat. HINWEIS: Für erhöhte Dosen von Tamoxifen können mit dieser Methode Lösungen bis zu 20 mg/ml hergestellt werden.</li>
	<li>Bei 4 °C bis zu 3 Monate vor Licht schützen.</li>
	<li>Induzieren Sie eine Rekombination durch Verabreichung von 50 l 2,5 mg/ml Tamoxifen, die am ersten postnatalen Tag intraperitoneal in Maisöl gelöst werden (P1). HINWEIS: Grundsätzlich kann Tamoxifen bereits in der F1-Generation in jedem Alter verabreicht werden. Die Dosis von Tamoxifen sollte basierend auf Cre-Expression, Mausalter und experimenteller Anwendung variiert werden. Weitere Informationen finden Sie im Diskussionsbereich. Cre negative Mäuse auf die gleiche Weise behandelt kann als negative Kontrolle für Konfetti Fluoreszenzsignale verwendet werden. VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Tierhalter vor der Verwendung von Tamoxifen gewarnt werden und stellen Sie sicher, dass Käfigmaterialien gemäß den örtlichen Umwelt- und Sicherheitsrichtlinien entsorgt werden.</li>
</ol>3. Gewebesammlung
<ol><li>Euthanisieren Sie Mäuse am postnatalen Tag 27 (P27), indem Sie den Raum, der die Mäuse enthält, schrittweise mit Kohlendioxid bis zu mindestens 80 Volumenprozent füllen und diese Konzentration für 3 min beibehalten. Führen Sie zervikale Dislokation durch. Halten Sie Mäuse während der Zerlegung der anderen Tiere auf Eis.</li>
	<li>Sezieren Sie das Gewebe von Interesse. Im Folgenden ist ein Protokoll zum Sammeln der proximalen tibialen und distalen femoralen Wachstumsplatten und des Gelenkknorpels des Knies beschrieben, geeignet für postnatale Mäuse bis zum Alter von 6 Monaten.<ol>
<li>Entfernen Sie die Haut um die Hinterbeine bis zum Fuß, mit scharfer Schere und Zahnzange.</li>
		<li>Schneiden Sie den Muskel und das Fettgewebe grob mit einer scharfen Schere von den Beinen. HINWEIS: Reinigen Sie die Knochen nicht perfekt, da die umgebenden Gewebe beim Schnitt eine gewisse strukturelle Unterstützung bieten, aber sicherstellen, dass die gesamte Haut entfernt wird.</li>
		<li>Mit einem Skalpell durch schneiden Sie das Weichgewebe, wo die Oberseite des Beins trifft den Körper, bis der Oberschenkelkopf sichtbar ist, dann schneiden Sie die Bänder in der Hüftgelenk, um das Bein zu entfernen. HINWEIS: Alternativ, wenn es nicht möglich ist, den Oberschenkelkopf zu finden, durchschneiden Sie den Oberschenkelknochen in der Nähe der Hüfte mit einer starken Schere.</li>
		<li>Sezieren Sie den Fuß vom Rest des Beins mit einem Skalpell oder einer scharfen Schere.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Gewebefixierung und -verarbeitung
HINWEIS: Folgen Sie auf der Grundlage des gewebes von Interesse eines der beiden unten aufgeführten Protokolle (4.1 für Weichgewebe oder 4.2 für mineralisiertes Mausgewebe im Alter von etwa 45 Tagen, wie unten beschrieben). Bei beiden Methoden die sezierten Proben in der 3,7%igen Formaldehyd/Phosphatgepufferte Saline (PBS) Lösung auf Eis lagern, während die verbleibenden Tiere seziert werden.
<ol><li>Bei Weichteilen und mineralisierten Tibia und Femora bis zum Alter von ca. P45 das Gewebe in vorgekühltem 3,7% Formaldehyd/PBS für 6 h fixieren und bei 4 °C sanft auf einem Rotator rollen. Verwenden Sie ein Volumen, das mindestens 10x größer ist als das des Gewebes. Fahren Sie direkt mit Schritt 4.3 fort.</li>
	<li>Für mineralisierte Gewebe, einschließlich Tibiae und Femora über das Alter von ca. P45, ist ein Entkalkungsschritt erforderlich.<ol>
<li>Bereiten Sie 1 L von 10% EDTA/dH2 O Lösung mit dem pH-Wert auf 8,05 mit Natriumhydroxid eingestellt. Als nächstes verdünnen Sie das Formaldehyd mit dieser Lösung auf 3,7 %. Die Arbeitskonzentration von EDTA wird 9 % betragen.</li>
		<li>Befestigen Sie das Gewebe, indem Sie es über Nacht in vorgekühltes 3,7% Formaldehyd/PBS legen und bei 4 °C sanft auf einem Rotator rollen.</li>
		<li>Legen Sie das Gewebe in vorgekühlte 3,7% Formaldehyd/9% EDTA/dH2 O Lösung (pH 8.05), und drehen Sie sich vorsichtig bei 4 °C in einem Volumen, das mindestens 10x größer ist als das des Gewebes. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie die Knochen in frische, vorgekühlte 3,7% Formaldehyd/9% EDTA/dH2O für 3x über die nächsten 48 h legen. HINWEIS: Diese kurze Entkalkung reicht aus, um die Knochen der Oberschenkelknochen und Tibia knochen von bis zu 6 Monate alten Mäusen zu sektionieren. Für dichter mineralisierte Gewebe kann eine weitere Entkalkung erforderlich sein, um die Histologie zu verbessern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie das Gewebe in vorgekühlte 30% Saccharose/dH2O. Achten Sie darauf, den Behälter bis zum Rand zu füllen, und drehen Sie sich vorsichtig über Nacht bei 4 °C. Verwenden Sie ein Volumen, das mindestens 10x größer ist als das des Gewebes. Das Gewebe schwimmt oft, wenn es zuerst in diese Lösung gelegt wird und sinkt bis zum Morgen auf den Boden der Flasche.</li>
	<li>Um die Restsucrose-Lösung zu entfernen, waschen Sie das Gewebe kurz, indem Sie es mit Zangen aus der Saccharoselösung entfernen und die Probe für einige Sekunden vollständig mit ca. 5 ml optimaler Schnitttemperaturverbindung (OCT) abdecken.</li>
	<li>Füllen Sie einen voretikettierten Kryomold mit OCT und positionieren Sie das Gewebe an der Unterseite. Arbeiten Sie schnell, um zu vermeiden, dass die Proben zu lange bei Raumtemperatur sitzen. HINWEIS: Es ist wichtig, die Probe in einer praktischen Ausrichtung für den Schnittschritt zu platzieren. Um die Wahrscheinlichkeit des Schnittes durch ganze Wachstumsplattensäulen nach der Rückverfolgung mit Col2CreERT:Confetti zu erhöhen, legen Sie die mediale Seite nach unten mit dem Oberschenkelkopf als Führung, und positionieren Sie die Probe so flach wie möglich am Boden der Form.</li>
	<li>Die Probe einbetten, indem Sie die Form auf Trockeneis legen und darauf warten, dass das OCT vollständig erstarrt. Legen Sie die Kryomolde so flach wie möglich, um Bewegung/ Gleiten des Gewebes in der Form zu vermeiden. Nach der Fertigstellung die Proben bei -20 °C lagern, wenn sie nicht sofort verwendet werden. HINWEIS: Verwenden Sie innerhalb von 12 Wochen, weil mit dem Alter die Blöcke schwieriger zu abschnitten.</li>
</ol>5. Schnitt
HINWEIS: Führen Sie Kryosektionen mit einem Kryostat mit Einwegklingen durch, die für Hartgewebe geeignet sind. Jeder Standard-Kryostat ist geeignet.
<ol><li>Entfernen Sie den Block aus der Form und befestigen Sie ihn an der Spannvorrichtung, indem Sie OCT zwischen der Oberseite des Blocks und dem Futter und abkühlen im Kryostat bei -20 °C für mindestens 5 min, so dass das OCT vollständig verfestigt ist.</li>
	<li>Sowohl den Probenhalter als auch den Klingenhalter auf -20 °C vorkühlen und dann die Probe/das Futter in den Futterhalter und die Klinge in den Klingenhalter legen, um sie für mehrere Minuten auszubalancieren. HINWEIS: Die angegebenen Temperaturen können je nach Kryostat und Gewebe von Interesse um mehrere Grade variiert werden.</li>
	<li>Verwenden Sie den Kryostat, um den Block zu trimmen und Gewebeabschnitte mit einer geeigneten Dicke zu schneiden, um die Visualisierung der Klone im Gewebe von Interesse zu ermöglichen.<ol>
<li>Für die postnatale Wachstumsplattenanalyse können Sie Abschnitte von 30 bis 160 m vorbereiten und auf Dias sammeln. Einige Kryostatmodelle erlauben möglicherweise nur die Sammlung dicker Abschnitte mit der Trimmeinstellung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Dias trocknen die Dias bei Raumtemperatur bis sie vollständig trocken sind. HINWEIS: Die Dauer dieses Schritts kann je nach Gewebeeigenschaften und Schnittdicke variieren. Die Temperatur des Raumes wird wahrscheinlich auch die Geschwindigkeit dieses Schritts beeinflussen.</li>
	<li>Bewahren Sie die Dias bis zu 36 Monate bei -20 °C auf, oder fahren Sie bei sofortiger Verarbeitung mit Schritt 6.2 fort.</li>
</ol>6. Schiebevorbereitung und -montage
<ol><li>Entfernen Sie die Rutsche aus dem Gefrierschrank und bringen Sie sie horizontal in einem Schiebehalter auf Raumtemperatur. Lassen Sie jegliche Kondensation verdampfen.</li>
	<li>Entfernen Sie das OCT, indem Sie eine Pasteur-Pipette verwenden, um PBS bei Raumtemperatur vorsichtig auf das Dia aufzutragen. Je dicker der Abschnitt, desto länger ist die Zeit erforderlich. Für 160 m dicke Abschnitte zwei Spülungen durchführen: einmal für 15 min inkubieren und die Flüssigkeit entfernen, und dann frisches PBS für 5 min auftragen und die Flüssigkeit entfernen. HINWEIS: Dieser Schritt dient zum Entfernen des OCT und kann je nach Gewebeeigenschaften und Schnittdicke entsprechend variiert werden. Die Temperatur des Raumes wird wahrscheinlich die Geschwindigkeit dieses Schritts beeinflussen.</li>
	<li>Montieren Sie die Schlitten in einer Lösung von 75% 2,2-Thiodiethanol/dH2O bei Raumtemperatur mit 60 mm langen Deckschlips. HINWEIS: Dias können unmittelbar vor der Bildgebung vorbereitet werden, aber das fluoreszierende Signal ist für 1 bis 2 Wochen stabil, wenn es in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C aus dem Licht gehalten wird.</li>
</ol>7. Bildgebung durch konfokale Mikroskopie
<ol><li>Richten Sie das Mikroskop ein.<ol>
<li>Schalten Sie das Mikroskop ein und öffnen Sie die Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche System starten.</li>
		<li>Wählen Sie die Kanäle aus, indem Sie zuerst auf Smart Setup unter der Registerkarte "Erfassung" klicken und dann die drei Kanäle auswählen, die dem roten fluoreszierenden Protein (RFP), dem gelben fluoreszierenden Protein (YFP) und dem Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP) unter dem Farbstoff Überschrift. Klicken Sie auf Bestes Signal, und wählen Sie dann die Laser aus. HINWEIS: Der Inhalt der Registerkarte "Erwerb" wird in der Zusatzdatei 1Aangezeigt. Wenn die erforderlichen Kanäle nicht vorhanden sind, fügen Sie sie mit der Schaltfläche '+' unter der Überschrift Farbstoff hinzu. Die notwendigen Informationen über Laser, Anregungswellenlängen und den Bereich der aufgezeichneten Emissionswellenlängen werden für die drei Konfetti-Fluoreszenzproteine in der Zusatzdatei 1B-Ddargestellt.</li>
		<li>Wählen Sie das 20-fache Objektiv unter der Überschrift Objektiv auf der Registerkarte Erfassungsmodus aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Suchen Sie die Wachstumsplatte oder ein anderes Gewebe von Interesse.<ol>
<li>Um eine eindeutige Ansicht bereitzustellen, wählen Sie zuerst den RFP-Kanal aus, indem Sie auf der Registerkarte Kanäle auf seinen Namen klicken. Dadurch werden Details des RFP-Kanals auf der Registerkarte Lichtpfad angezeigt. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen neben T-PMT. HINWEIS: Der T-PMT-Kanal zeigt nicht reflektiertes Laserlicht, das zur Visualisierung der nicht fluoreszierenden Teile des Gewebes verwendet wird.</li>
		<li>Platzieren Sie den Schlitten in den Schiebehalter und positionieren Sie die Wachstumsplatte oder ein anderes Gewebe von Interesse direkt zwischen dem Lichtpfad und der Objektivlinse.</li>
		<li>Um die Lokalisierung des Gewebes zu vereinfachen, deaktivieren Sie die YFP- und CFP-Kanäle mithilfe der Kontrollkästchen unter der Überschrift Tracks der Registerkarte Kanäle.</li>
		<li>Wählen Sie den T-PMT-Kanal aus, indem Sie in der Überschrift Tracks auf seinen Namen klicken. Klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung" auf Live und erhöhen Sie den Gain (Master) für den T-PMT-Kanal, um den Gewebeabschnitt auf dem Bildschirm zu visualisieren, der in Graustufen angezeigt wird.</li>
		<li>Bewegen Sie die Position des Dias mit dem Joystick, um den Interessenbereich zu lokalisieren, und fokussieren Sie dann mit dem entsprechenden Mikroskopknopf.</li>
		<li>Klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung", um die Laserbelichtung zu deaktivieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Definieren Sie die Bildparameter.<ol>
<li>Verwenden Sie die Kontrollkästchen auf der Registerkarte Kanäle, um einen der Kanäle auszuwählen, und klicken Sie auf der Registerkarte "Erfassung", um das Bild dieses Kanals auf dem Bildschirm anzuzeigen. Passen Sie dann mit der Linksklicktaste auf der Maus die Schiebeleisten an, um den Erfassungsbereich des emittierten Fluoreszenzsignals, die Laserleistung (Schiebeleiste unter Laserüberschrift), Gain (Master) und Digital Offset im Channels-Registerkarte, um die Konfetti-beschrifteten Zellen auf dem Bildschirm zu visualisieren. Richtlinienwerte für alle diese Parameter werden in der Zusatzdatei 1B-D für RFP, YFP und CFP bereitgestellt. Führen Sie diesen Schritt für jeden Kanal nacheinander aus. HINWEIS: Um sicherzustellen, dass das visualisierte Signal keine Autofluoreszenz ist, kann ein Abschnitt von einem Cre-Negativtier während dieses Schritts als Negativkontrolle verwendet werden. Da T-PMT mit dem RFP-Laser (Schritt 7.2.1) kombiniert wurde, wirkt sich die Anpassung der Laserleistung für RFP auf das T-PMT-Signal aus.</li>
		<li>Passen Sie die Pinhole-Größe an, um bei Bedarf die Fluoreszenzerkennung zu erhöhen. HINWEIS: Je höher die Lochgröße, desto mehr fluoreszierendes Signal wird in Z-Richtung erkannt. Eine Richtlinie hierfür ist die resultierende Airy Unit (AU), die automatisch unter dem Pinhole-Indikator angezeigt wird, wobei 1 AE für die Bildqualität optimal ist. Eine zu große Erhöhung der AU wird die spätere Analyse beeinträchtigen, da es schwieriger wird, einzelne Zellen in Z-Richtung zu unterscheiden).</li>
		<li>Überprüfen Sie das Setup, um sicherzustellen, dass sich die aufgezeichneten Signale nicht überlappen.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Kontrollkästchen in der Registerkarte Kanäle, um alle drei Kanäle auszuwählen und die Schaltfläche "Fangen" in der Registerkarte "Erfassung" zu drücken.</li>
			<li>Scrollen Sie im resultierenden Bild zwischen den angezeigten Kanälen, indem Sie auf die blau markierten Kästchen über jedem aufgelisteten Kanal auf der Registerkarte Dimensionen klicken. Überprüfen Sie manuell die Überlappung zwischen den Kanälen auf dem Bildschirm. Wenn sich die Signale überlappen (z. B. wenn jede rote Zelle auch gelb ist), kehren Sie zum Anfang von Schritt 7.3 zurück und wiederholen Sie die Parameter für die überlappenden Kanäle, bis sie voneinander unterschieden werden können. Stellen Sie sicher, dass für jedes Etikett (d. h. RFP, YFP oder CFP) mindestens ein Klon visualisiert werden kann, der nur eine der Beschriftungen enthält.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Bild erfassen.<ol>
<li>Wählen Sie die Registerkarte Erfassungsmodus aus, um die Bildqualität mithilfe der Werte Frame Size, Speedund Averaging Number anzugeben. HINWEIS: Die typischen Einstellungen für diese Experimente sind in der Zusatzdatei 1Aangegeben. Durch das Reduzieren des Zooms unter der Überschrift Scanbereich auf der Registerkarte Erfassung kann das Sichtfeld vergrößert werden, ohne die für die Bildaufnahme erforderliche Zeit zu ändern.</li>
		<li>Klicken Sie auf der Registerkarte "Akquisition" unter der Überschrift Dimensionserfassung auf das Kontrollkästchen Z-Stack. Öffnen Sie die Registerkarte Z-Stack, um das Intervall zwischen den Bildern in Z-Richtung auf 2,5 m festzulegen.</li>
		<li>Um die richtigen Positionen festzulegen, wählen Sie nur das RFP/T-PMT auf der Registerkarte Kanäle aus, und klicken Sie auf Live, um die roten Klone mit einem sichtbaren Umriss des Gewebes zu visualisieren. Legen Sie das erste und letzte Slice fest, indem Sie auf "Erstes festlegen" und "Letzte" auf dem entsprechenden Slice klicken und den Fokus mit dem Mikroskopknopf einstellen.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte Kachelscan auf der Registerkarte "Erfassung", und geben Sie die Gesamtzahl der Kacheln in horizontalen und vertikalen Richtungen in den entsprechenden Feldern ein.</li>
		<li>Wählen Sie für die Bildaufnahme alle gewünschten Kanäle auf der Registerkarte Kanäle aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Fangen", um ein einzelnes Bild zu sammeln, oder auf die Schaltfläche Experiment starten, um einen Z-Stack/Kachel-Scanzu sammeln.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachdem das Bild aufgenommen wurde, klicken Sie auf Datei speichern und speichern Sie das Bild in einem Dateityp, der so viele Informationen wie möglich über die Einstellungen des Mikroskops speichert, um eine spätere Überprüfung und Wiederverwendung zu ermöglichen.</li>
	<li>Führen Sie weitere Analysen mit Bildanalysesoftware durch.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Konfetti-Modell wurde ausgiebig verwendet, um mineralisierte Knorpelgewebe12,13,14 zu untersuchen und das optimierte Protokoll zu beschreiben. Konfettimäuse2 mit einer oder zwei Kopien des R26R-Konfetti-Alleels können für Zucht und Experimente verwendet werden. Die Rekombination bei Mäusen mit einem Allel des Brainbow 2.1-Konstrukts gibt vier potenzielle Bezeichnungen: rotes fluoreszierendes Protein (RFP, zytoplasmatisch), gelbes fluoreszierendes Protein (YFP, zytoplasmatisch), Cyan-Fluoreszenzprotein (CFP, membranlokalisiert) und grün fluoreszierendes Protein (GFP, Nucleus-lokalisiert), während die Rekombination in den homozygoten Konfetti-Mäusen (d.h. zwei Kopien des Brainbow 2.1-Konstrukts) 10 mögliche Farbausgänge (RFP+RFP, RFP+YFP, RFP+GFP, RFP+GFP, YFP+YFP, YFP+CFP, YFP+ GFP, GFP+CFP, GFP+GFP, GFP+GFP). Da die DNA-Exzisions- und Inversionsereignisse jedoch stochastisch auftreten, tritt die Rekombination zur Erzeugung von GFP nur in einem kleinen Bruchteil der Zellen auf, wie zuvor berichtet2, und unterscheidet sich scheinbar nach Zelltyp oder Cre-Linie,die verwendetwird 2, 12,13. Angesichts des geringen Auftretens von Rekombinationsereignissen, die zum GFP-Ausdruck führen, sind daher sechs Farbausgänge die häufigsten bei homozygoten Konfetti-Mäusen.
Ein wichtiger Aspekt bei der Planung von Experimenten mit der Konfettimaus ist die Suche nach einem geeigneten Cre-Stamm. Erstens, da das Konfetti-Allel mehrere loxP-Sites hat, schließt ein Rekombinationsereignis ein zweites4nicht aus. Dies bedeutet, dass, wenn eine Zelle beschriftet ist und sich teilt, um einen Klon einer Farbe zu erzeugen, ein zweites Rekombinationsereignis in einer seiner Tochterzellen eine andere Farbe erzeugen würde, wodurch die wahre klonale Expansion maskiert würde. Daher sind nicht induzierbare Cre-Stämme, bei denen das Enzym immer aktiv ist, wenn der entsprechende Promotor aktiv ist, nicht ratsam. Zweitens geht die Expression der Cre-Recombinase bei einigen Stämmen oft auf Kosten eines endogene Proteins, wodurch ein eigener Phänotyp entsteht (z. B. für den Prg4-GFPCreERT2-Knock-in-Mausstamm, bei dem Mäuse zwei Cre-Allele beherbergen15), daher ist eine einzige Kopie des Cre-Alleels wünschenswert. In allen beschriebenen Experimenten wurde eine einzige Kopie des Col2CreERT16 entweder vom männlichen oder vom weiblichen Elternteil getragen, um Col2CreERT:Konfetti-Mäuse zu erzeugen, wiebeschrieben 13. Als nächstes ist die Spezifität der Cre-Linie für den Zelltyp des Interesses eine wichtige Überlegung. Zum Beispiel ist Col2CreERT chondrocyt-spezifisch, aber kennzeichnet mehrere verschiedene Populationen von Chondrozyten im frühen postnatalen Knorpel17. Schließlich kann sich die Aktivität verschiedener Cre-Stämme mit dem Alter der Tiere erheblich ändern, da sich die endogene Aktivität des für cre-Expression genutzten Promotors ändert, selbst in Zellen desselben Typs (z. B. Prg4-GFPCreERT2, die eine Erhöhung der Anzahl der Tamoxifen-Dosen zur Kennzeichnung oberflächlicher Zonenzellen als Mäuse im Alter von15Jahren ).
Die Anzahl der markierten Zellen wird durch die Menge an Tamoxifen angegeben, so ist es nicht immer wünschenswert, die maximale Dosis zu geben, weil die Unterscheidung klonen voneinander schwierig sein kann. Da Cre Ausdruck unter der Regulierung der verschiedenen Promotoren sowie mit dem Alter variieren, muss die Tamoxifen-Dosierung angepasst werden, um die Etikettierung zu optimieren. Es ist wichtig zu beachten, dass Zellen bei der Auslösen der Rekombination nicht sofort fluoreszierend sind, da Zeit benötigt wird, damit die Rekombination auftritt und sich die resultierenden fluoreszierenden Proteine ausreichend für die Bildgebung ansammeln. Es wird ein breites Stundenspektrum (zwischen 24 und 72 h) benötigt, das durch die Cre-Linie, den Zelltyp und das Alter der Tiere beeinflusst zu sein scheint. Da Tamoxifen lange nach Verabreichung18 biologisch aktiv sein kann, ist es immer ratsam, die Rekombinationseffizienz in jedem Modell gründlich zu überprüfen.
Während des konfokalen Mikroskopieschritts erfordert die Anregung der Konfetti-Fluoreszenzproteine das Eindringen des Gewebes durch Laserlicht. Da verschiedene Gewebe unterschiedliche Eigenschaften haben, kann Laserlicht nicht 160 'm dicke Abschnitte aller Gewebe durchdringen. Solche dicken Abschnitte können jedoch für Wachstumsplattenknorpel verwendet werden, wie in Abbildung 2, Abbildung 3verwendet. Beachten Sie, dass jedes Mikroskop anders ist, und es ist unwahrscheinlich, dass die beschriebenen Einstellungen (Ergänzende Datei 1) ohne geringfügige Anpassungen perfekt funktionieren. Eine der größten Herausforderungen besteht darin, die verschiedenen fluoreszierenden Proteine zu unterscheiden, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination von einem Kanal zum anderen gibt. Beispielsweise überschneidet sich das Signal im YFP-Kanal, das durch die Fluoreszenz von GFP verursacht wird, zwischen den YFP- und RFP-Kanälen. YFP- und GFP-Kanäle müssen ebenfalls sorgfältig geprüft werden. Dies kann auf verschiedene Weise erfolgen. Zunächst kann der Emissionsbereich von fluoreszierenden Lichtwellenlängen, die für jedes fluoreszierende Protein aufgezeichnet werden, verengt werden. Zweitens kann die Einstellung der Laserleistung in Kombination mit der digitalen Verstärkung das Signal optimieren. In dieser Studie waren diese Schritte ausreichend, aber sie verlassen sich auf ein starkes fluoreszierendes Signal. Dies bedeutet, dass theoretisch eine ineffiziente Gewebeverarbeitung die Aktivität der fluoreszierenden Proteine reduzieren kann oder eine schwache Laserlichtquelle die Kanaltrennung beeinträchtigen kann.
Einer der Vorteile der Konfetti-Maus ist, dass sie mit einer großen Anzahl von genetisch mutierten Stämmen kombiniert werden kann, die verfügbar sind, so dass der Einfluss bestimmter Gene auf die klonale Dynamik untersucht werden kann10,11,12 ,13,14,19,20, wenn auch mit einigen Einschränkungen. Beispielsweise kann die Rekombination der Konfetti-Allele und des Gens von Interesse nicht getrennt werden, wenn Cre loxP-basierte Mutanten in Kombination mit klonaler Linienverfolgung verwendet werden. Dennoch können solche gleichzeitigen Rekombinationsereignisse wirksam sein10,14,20. Zum Beispiel wurde diese Möglichkeit genutzt, um die erhöhte Zellzahl in der Ruhezone von Mäusen nach postnataler Chondrozyten-spezifischer Ablation von TSC1 in der Wachstumsplatte21 zu untersuchen und die klonale Beziehung zwischen diesen Zellen im Laufe der Zeit zu zeigen. 13. Zusätzlich kann die gewebespezifische klonale Analyse mit Konfetti-Mäusen mit nicht-Cre LoxP-basierten Mutantenmäusen11verwendet werden, und es ist auch möglich, diese Ansätze mit pharmakologischen8,9 ,13 und/oder chirurgische Modelle8, um klonale Reaktionen auf andere funktionelle Störungen zu visualisieren. Weitere Chancen ergeben sich bei der Kombination von Konfetti-gekennzeichneten Abschnitten mit immunemditionium endogene Proteine durch Immunfluoreszenz. Eine solche Analyse ermöglicht die Identifizierung von verfolgten Zellen und deren Kolokalisierung mit einem bekannten Marker. Mit der hier beschriebenen Fixierungsmethode ist es möglich, Immunfluoreszenz zu leiten und dennoch die Fluoreszenz der Konfettifluoreszenzproteine12,13zu visualisieren. In den genannten Papieren war jedoch keine Antigenrückgewinnung erforderlich. Harte Antigen-Retrieval-Methoden, wie das Kochen im Citratpuffer, führt zu einem vollständigen Verlust der Konfettifluoreszenz. Obwohl die Konfetti-Fluoreszenzproteine dann mit Antikörpern22nachgewiesen werden können, kann ein Verlust der klonalen Identität auftreten.
Zusammenfassend ist die Verwendung des Konfetti-Modells zur Kennzeichnung von Zellen in vivo ein informatives Werkzeug, um das Schicksal dieser Zellen im Laufe der Zeit zu analysieren. Die beschriebene Methode bietet eine schnelle und effiziente Möglichkeit, die fluoreszierende Proteinexpression in mineralisierten Geweben direkt zu visualisieren.

Verbesserte Methoden zur Überwachung des Zellverhaltens sind wünschenswert, um die experimentelle Effizienz bei der Verwendung von Tiermodellen zu erhöhen. Einer der informativsten Ansätze zur Überwachung des Zellverhaltens in vivo ist die klonale Linienverfolgung mit mehrfarbigen Reporter-Mausstämmen1, einschließlich der weit verbreiteten R26R-Konfetti (Confetti) Maus2. Durch die genetische Kennzeichnung einzelner Zellen mit fluoreszierenden Proteinen und die Verfolgung dieser Zellen im Laufe der Zeit haben Forscher in vielen Bereichen die Konfetti-Maus verwendet, um Einblicke in eine Vielzahl verschiedener biologischer Systeme zu gewinnen.
Die Konfetti-Maus ist ein loxP-basiertes Reportersystem, bei dem eine creabhängige DNA-Rekombination die permanente Expression eines von mehreren möglichen fluoreszierenden Proteinen in stochastischer Weise verursacht2. Das R26R-Konfetti-Allel enthält den allgegenwärtig ausgedrückten CAGG-Promotor, der unmittelbar vor einer loxP-flankierten NeoR-Kassette2liegt, deren Polyadenylierungssequenz die Transkription3beendet, gefolgt von der Brainbow 2.1 Konstrukt4. Daher wird die NeoR-Kassettedurch cre-vermittelte Rekombinationen gleichzeitig ausgeschnitten und führt zur Produktion bestimmter fluoreszierender Proteine, je nachdem, welche Teile des Brainbow 2.1-Konstrukts verbrauchen. Diese Funktion macht die Konfetti-Maus extrem anpassungsfähig, da sie verwendet werden kann, um jede zelluläre Population in einer Maus anzusprechen, für die ein bestimmter Cre-Stamm verfügbar ist. Die Überquerung eines gewebespezifischen Cre-Stamms mit dem R26R-Konfetti-Stamm sorgt für die Spezifität der Etikettierung. Der Cre-Stamm sollte jedoch auch induzierbar sein (z. B. CreERT oder CreERT2, die eine Tamoxifenbindung erfordern, damit sie in den Zellkern gelangen und eine DNA-Rekombination induzieren5), so dass die Kennzeichnung zu bestimmten Zeitpunkten erreicht werden kann. So kann eine zelluläre Population durch Injektion des resultierenden CreERT-positiven/Konfetti-positiven Nachwuchses mit Tamoxifen zum gewünschten Zeitpunkt markiert und bis zu einem bestimmten Alter verfolgt werden, wenn die gewebe von Interesse zur Analyse gesammelt werden können. Nach der Gewebeverarbeitung können die fluoreszierend gekennzeichneten Zellen direkt durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden, so dass die Nachkommen jeder ursprünglich beschrifteten Zelle von der Nachkommenschaft getrennt werden können, die von jeder anderen markierten Zelle auf der Grundlage ihrer spezifischen fluoreszierenden klonalen genetischen Spuren) zu ermöglichen, wodurch die Klonalität beurteilt werden kann.
Aufgrund der Flexibilität des Konfetti-Modells wurde es angewendet, um die Entwicklung und Wartung vieler verschiedener Gewebe in Gesundheit und Krankheit zu studieren2,6,7,8,9, 10,11. Eine gängige Möglichkeit, das Modell zu verwenden, besteht darin, eine bestimmte Population von Zellen zu kennzeichnen und zu bestimmen, zu welchem Gewebe sie (und/oder ihre Nachkommen) beigetragen haben. Ein solcher Befund mit diesem Ansatz war, dass der erwachsene Zahn aus Zellen mit einem gliaalen Ursprungbesteht 6. Eine weitere Anwendung des Modells ist die Untersuchung der Stammzellhomöostase. Zum Beispiel zeigte das Konfetti-Modell, dass Stammzellnischen in den Darmkrypten allmählich monoklonal werden, weil einige Stammzellklone im Wettbewerb zwischen Stammzellen2dominant sind. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Zellproliferation zu bewerten, was besonders nützlich für die Untersuchung langsam teilender Zellen ist. Zum Beispiel wurde die klonale Bildung im Gelenkknorpel12 untersucht, und die kurzfristigen Auswirkungen eines Igelantagonisten auf Wachstumsplattenchondrozyten bei fünf Wochen alten Mäusen wurden untersucht13.
Trotz der relativen Einfachheit des Konfetti-Modells kann das fluoreszierende Signal technisch schwierig sein, bis zur Bildsammlung zu erhalten, insbesondere bei der Analyse mineralisierter Gewebe. Hier beschreibt das Protokoll ein optimiertes Modell zur Verwendung der Konfettimaus mit dem postnatalen Knochen (bis zu 6 Monaten), so dass fluoreszierende Proteine direkt durch konfokale Mikroskopie visualisiert werden können, ohne dass eine Immundetektion erforderlich ist. Dieses vereinfachte Protokoll kann auf nichtmineralisierte Gewebe angewendet werden. Darüber hinaus enthält eine Beschreibung, wie die Proben zu speichern, um das Fluoreszenzsignal für einen längeren Zeitraum von mindestens 3 Jahren zu erhalten. Eine Übersicht des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-thiodiethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCF9328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm-long cover slips</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>220588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold (standard)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Model: NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cryostat blades</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>207500014</td>
			<td>Specifically for use with hard tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Scharlan</td>
			<td>AC0960005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde concentrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18708.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V7130</td>
			<td>Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software for 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>11-8162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>102094-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06498.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost UltraPlus slides</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware for Confocal laser scanning microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues

Eine einzelne Zelle im Körper zu beschriften, um zu überwachen, welche Zelltypen sie hervorrufen kann, und ihre Migration durch den Organismus zu verfolgen oder ihre Langlebigkeit zu bestimmen, kann eine leistungsfähige Möglichkeit sein, Mechanismen der Gewebeentwicklung und -erhaltung aufzudecken. Eines der wichtigsten Derzeit verfügbaren Werkzeuge zur Überwachung von Zellen in vivo ist das Konfetti-Mausmodell. Das Konfetti-Modell kann verwendet werden, um einzelne Zellen bei lebenden Mäusen mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen zelltypspezifisch genetisch zu kennzeichnen und ihr Schicksal sowie das Schicksal ihrer Nachkommen im Laufe der Zeit zu überwachen, in einem Prozess, der als klonale genetische Tracing oder klonale Linienverfolgung. Dieses Modell wurde vor fast einem Jahrzehnt erstellt und hat zu einem besseren Verständnis vieler biologischer Prozesse beigetragen, insbesondere im Zusammenhang mit der Stammzellbiologie, der Entwicklung und der Erneuerung von erwachsenen Geweben. Die Erhaltung des fluoreszierenden Signals bis zur Bildaufnahme und gleichzeitigen Erfassung verschiedener fluoreszierender Signale ist jedoch technisch eine Herausforderung, insbesondere für mineralisiertes Gewebe. Diese Publikation beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Verwendung des Konfetti-Modells zur Analyse des Wachstumsplattenknorpels, der auf jedes mineralisierte oder nichtmineralisierte Gewebe aufgebracht werden kann.

Um Chondrozyten im epiphysealen Knorpel zu kennzeichnen und ihre klonale Expansion mit dem Alter mit Tamoxifen-Verabreichung auf P1 zu visualisieren, wurden Col2CreERT:Konfetti-Mäuse beschriftet und ihre Hinterbeine wurden auf P27 gesammelt. Der mittelgroße Abschnitt wurde durch Visualisierung des Kreuzbandes bestimmt (Abbildung 2A) und Klone in der proximalen tibialen Wachstumsplatte wurden visualisiert (Abbildung 2B). Diese Daten zeigen, dass einzelne Zellen, die Col2-positiv auf P1 waren und bei der Verabreichung von Tamoxifen mit Konfetti-Fluoreszenzproteinen gekennzeichnet wurden, klonal enthiv ausexpandierten und anschließend bis P27 in der Wachstumsplatte verblieben. Die ersten Veränderungen der klonalen Expansion von einem ähnlichen Entwicklungszeitpunkt aus sind in Abbildung 1 einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung13zu sehen.
Um ein Beispiel für das fluoreszierende Signal nach langzeitlagerung (Schritt 5.5) zu geben, wurde der gesammelte Abschnitt unmittelbar danach (siehe Abbildung 2A,B) mehr als 3 Jahre lang gespeichert, bevor es vorbereitet und abgebildet wurde (Abbildung 2C, Video 1) .
Um einige häufige Probleme mit dem Protokoll zu veranschaulichen, wird in Abbildung 3Aein Abschnitt dargestellt, der während des Kryosektionsschritts unterbrochen wurde. Der in Abbildung 3B erweiterte Bereich des Abschnitts (zwischen Wachstumsplatte und Gelenkknorpel), der in Abbildung 3B erweitert wurde, zeigt, dass diese Dosis von Tamoxifen zu einem so hohen Rekombinationsgrad in diesem Bereich führt, dass eine klonale Analyse ausgeschlossen würde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig01.jpg"> Abbildung 1: Experimentelle Übersicht. Flussdiagramm, das die wichtigsten Phasen der Methode zusammenfasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig02.jpg"> Abbildung 2: Konfetti-Bilder von einer Col2CreERT:Konfetti-Maus. (A) Proben von Col2CreERT:Konfettimäuse wurden ohne Entkalkung oder langzeitlagerungsschritt verarbeitet. Der mittelgroße Abschnitt wurde mit dem Kreuzband als Marker lokalisiert. Dieses Bild wurde mit einem Kachelscan visualisiert, nachdem RFP mit T-PMT erkannt wurde (Scale bar = 300 m). (B) Clonalsäulen werden innerhalb der proximalen Tibia der Wachstumsplatte angezeigt, die in (A) nach 3D-Rekonstruktion sichtbar ist. (C) Für die Bildgebung und die 3D-Rekonstruktion wurde eine benachbarte Folie zu der in (A) undB) in Langzeitlagerung gehaltenen Folie verarbeitet. RFP, YFP und CFP werden in (B) und (C) (Scale bars = 50 'm) angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig03.jpg"> Abbildung 3: Herausforderungen bei der Verwendung der Methode. (A) Die weißen gestrichelten Linien umreißen einen Split im Abschnitt durch die Wachstumsplatte von Col2CreERT:Konfetti-Mäusen (Scale bar = 50 m). Der Bereich innerhalb des weißen Feldes ist in (B) (Skalenleiste = 25 m) dargestellt. RFP, YFP und CFP werden in beiden Panels angezeigt, und der nicht reflektierte Laserlichtkanal (T-PMT) wird auch in (A) angezeigt, um das Gewebe zu visualisieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Video 1: Dreidimensionale Rekonstruktion einer Wachstumsplatte von Col2CreERT: Konfettimaus. Eine Folie aus einem Col2CreERT vorbereitet: Konfetti-Maus wurde in Langzeitlagerung nach dem Schnitt für mehr als 3 Jahre gehalten, und dann für die Bildgebung verarbeitet. Die dreidimensionale Rekonstruktion wurde automatisch mit Bildanalysesoftware durchgeführt und als Video exportiert. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/video_1.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Zusatzdatei 1: Typische Einrichtung des Konfokalmikroskops. (A) Die hauptsteuerelemente in der Erfassungsregisterkarte. (B-D) Die Laserparameter, die Anregungswellenlänge und der Bereich der aufgezeichneten Emissionswellenlängen werden für drei Konfetti-Fluoreszenzproteine angezeigt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424supfig01.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Diese Methode beschreibt die Verwendung des R26R-Konfetti (Konfetti) Mausmodells zur Untersuchung mineralisierter Gewebe, die alle Schritte von der Zuchtstrategie bis zu den Bilderfassungen abdeckt. Enthalten ist ein allgemeines Protokoll, das auf alle Weichgewebe angewendet werden kann, und ein modifiziertes Protokoll, das auf mineralisierte Gewebe angewendet werden kann.

Clonale genetische Tracing mit der Konfetti-Maus zur Untersuchung mineralisierter Gewebe

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Durch die genetische Kennzeichnung einzelner Zellen mit fluoreszierenden Proteinen und die Anschließende hat die Konfettimaus Forschern neue Erkenntnisse über viele biologische Prozesse ermöglicht. Unser Protokoll minimiert Verzögerungszeiten zwischen Gewebesammlung und Bildgebung, kann auf jedes mineralisierte oder nichtmineralisierte Gewebe angewendet werden und bewahrt die Fluoreszenz für mehrere Jahre. Diese Methode ist sehr nützlich für alle Bereiche der regenerativen Medizin und Entwicklungsbiologie, da sie auf verschiedene Zellpopulationen angewendet werden kann, um ihr Schicksal und ihre Kinetik zu untersuchen, solange eine geeignete Cre-Linie zur Verfügung steht.Unsere Schritt-für-Schritt-Anleitung zeigt den schwierigsten Schritt, um die Differenz der fluoreszierenden Signale zu unterscheiden, die von verschiedenen fluoreszierenden Proteinen emittiert werden. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Mausgewebes für die Bildgebung. Für Weichteile und mineralisierte Tibiae und Femora von Mäusen bis 45 Tage alt, fixieren Sie das Gewebe in vorgekühlten 3,7%Formaldehyd PBS und inkubieren Sie es bei 4 Grad Celsius für sechs Stunden, während es sanft auf einem Rotator rollt.Für mineralisierte Gewebe wie Tibiae und Femora von Mäusen über 45 Tage, bereiten Sie einen Liter von 10%EDTA-Lösung mit dem pH-Wert auf 8,05 mit Natriumhydroxid eingestellt und verdünnen Sie das Formaldehyd auf 3,7%mit dieser Lösung. Fixieren Sie das Gewebe, indem Sie es in 3,7% Formaldehyd PBS über Nacht bei 4 Grad Celsius halten. Legen Sie es am nächsten Tag in die vorgekühlte Formaldehyd-EDTA-Lösung und inkubieren Sie es bei 4 Grad Celsius, während Sie 48 Stunden rotieren, wobei Sie sicherstellen, dass die Lösung während der Inkubation dreimal ersetzt wird.Dann legen Sie das Gewebe in vorgekühlte 30%Saccharose, stellen Sie sicher, den Behälter bis zum Rand zu füllen, und drehen Sie es vorsichtig über Nacht bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie am Morgen Zangen, um das Gewebe aus der Saccharoselösung zu entfernen und es für ein paar Sekunden in fünf Milliliter optimaler Schnitttemperaturverbindung oder OCT zu spülen. Füllen Sie einen vorbeschrifteten Kryomold mit OCT und positionieren Sie das Gewebe an der Unterseite, so dass schnell arbeiten, um zu lange das Sitzen der Probe bei Raumtemperatur zu vermeiden.Die Probe einbetten, indem Sie die Form auf Trockeneis legen und darauf warten, dass das OCT erstarrt. Wenn die Proben nicht sofort verwendet werden, können sie bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Entfernen Sie den Block aus der Form.OCT zwischen der Oberseite des Blocks und dem Futter auftragen und im Kryostat mindestens fünf Minuten abkühlen oder bis das OCT vollständig erstarrt ist. Den Probenhalter und den Klingenhalter auf minus 20 Grad Celsius vorkühlen, dann die Probe in den Futterhalter und die Klinge in den Klingenhalter legen und einige Minuten ausbalancieren lassen. Für die postnatale Wachstumsplattenanalyse bereiten Sie Abschnitte vor, die 30 bis 160 Mikrometer betragen.Verwenden Sie den Kryostat, um den Block zu trimmen und Gewebeabschnitte auf eine geeignete Dicke zu schneiden und sie auf Dias zu sammeln. Dann trocknen die Dias bei Raumtemperatur bis sie vollständig trocken und lagern sie bis zu 36 Monate bei minus 20 Grad Celsius. Wenn Sie bereit sind, die Folie zu verwenden, entfernen Sie sie aus dem Gefrierschrank und bringen Sie sie auf Raumtemperatur in einem Schiebehalter.Um das OCT zu entfernen, tragen Sie PBS vorsichtig mit der Pasteur-Pipette auf den Schlitten auf. Für 160 Mikrometer dicke Abschnitte, inkubieren Sie die Rutsche für 15 Minuten, entfernen Sie die Flüssigkeit und wenden Sie frische PBS für fünf weitere Minuten. Montieren Sie die Dias in einer Lösung von 75%Thiodiethanol bei Raumtemperatur mit 60 Millimeter langen Deckrutschen.Wählen Sie zunächst den RFP-Kanal aus, indem Sie auf der Registerkarte Kanäle darauf klicken, wodurch die Details des Kanals auf der Registerkarte Lichtpfad angezeigt werden. Klicken Sie dann auf das Kontrollkästchen neben T-PMT. Platzieren Sie die Folie in den Schiebehalter und positionieren Sie das von Interesse sindde Gewebe direkt zwischen dem Lichtpfad und der Objektivlinse.Um das Gewebe zu lokalisieren, deaktivieren Sie die Felder YFP und CFP unter der Spurüberschrift der Registerkarte Kanäle. Wählen Sie den T-PMT-Kanal in der Überschrift der Spuren aus, klicken Sie dann live in der Erfassungsregisterkarte und erhöhen Sie die Verstärkung für den T-PMT-Kanal, um die Gewebeauswahl auf dem Bildschirm zu visualisieren. Passen Sie die Position des Dias an, um den Interessenbereich zu lokalisieren und mit dem entsprechenden Mikroskopknopf zu fokussieren.Klicken Sie dann auf Stopp in der Erfassungsregisterkarte, um die Laserbelichtung auszuschalten. Definieren Sie bildgebende Parameter gemäß den Manuskriptanweisungen und passen Sie ggf. die Lochgröße an. Überprüfen Sie das Setup, um sicherzustellen, dass sich die aufgezeichneten Signale nicht überlappen, wählen Sie dann alle drei Kanäle in der Registerkarte Kanäle aus und drücken Sie die Drucktaste.Scrollen Sie zwischen den Anzeigekanälen im resultierenden Bild, indem Sie auf die blau hervorgehobenen Felder über jedem Kanal auf der Registerkarte Dimensionen klicken, und überprüfen Sie manuell, ob sich die Kanäle auf dem Bildschirm überlappen. Wenn sich die Signale überlappen, stellen Sie die Parameter nach, bis sie voneinander unterschieden werden können. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Chondrozyten im epiphysealen Knorpel zu beschriften und ihre klonale Expansion mit dem Alter zu visualisieren.Der mittelgroße Abschnitt wurde durch Visualisierung des Kreuzbandes bestimmt und Klone in der proximalen tibialen Wachstumsplatte wurden abgebildet. Einzelne Zellen, die Col2 positiv waren und bei Dertoxifen-Verabreichung mit Konfetti-Fluoreszenzproteinen gekennzeichnet wurden, wurden klonal erweitert und blieben anschließend in der Wachstumsplatte. Das Fluoreszenzsignal kann nach Langzeitspeicherung visualisiert werden.Einige Abschnitte wurden über drei Jahre vor der Vorbereitung und Bildgebung gelagert. Die dreidimensionale Rekonstruktion wurde automatisch mit Bildanalysesoftware durchgeführt und als Video exportiert. Ein Abschnitt, der während des Kryosektionsschritts unterbrochen wurde, enthält einen Bereich mit einem so hohen Rekombinationsgrad, dass er eine klonale Analyse verhindern würde, was eines der häufigsten Probleme dieses Protokolls demonstriert.Je nach Forschungsfrage kann die Verwendung einer Cre-Linie, die Ihre Zellen speziell als interessant kennzeichnet, sehr wichtig sein. Daher empfehlen wir, die Fluoreszenz in diesen Zellen kurz nach der Rekombination zu überprüfen. Die Verwendung induzierbarer Cre-Linien ist wichtig, da eine fortlaufende DNA-Rekombination in nicht induzierbaren Cre-Linien das fluoreszierende Profil der gelutten Zellen verändern kann und somit eine klonale Analyse ausschließt.Dieses Protokoll kann mit funktionellen Störungen wie genetisch manipulierten Stämmen, pharmakologischen Behandlungen, chirurgischen Eingriffen sowie Immunfluoreszenzfärbung enpariert werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Die gleichzeitige Bewertung der Cardiomyocyte DNA-Synthese und Ploidy: Ein Verfahren zur Förderung des Quantifizierung von Cardiomyocyte Regeneration und Umsatz

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

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Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

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In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

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The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Eine In-Vivo -Methode, um die Maus Blut-Hoden-Schranke Integrität zu studieren

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...