Name: clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues
Uploaded: 2019-10-23T14:30:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues at JoVE.com

אנו מודים לד ר יבגני איבאשקין לקבלת ייעוץ מתודולוגי. עבודה זו נתמכת כספית על ידי המועצה למחקר שוודי (א. ס. ג), הקרן המדעית הרוסית (להעניק #19-15-00241 עולה), מכון Karolinska (A.S.C.), StratRegen קי ו Stiftelsen Konung גוסטב V:s 80-årsfond (A.S.C.), Stiftelsen פרימוראר בארהוסט וסאלוסאפק ברנבארד (P.T.N.), מועצת המלגות הסינית (B.Z.). מיקרוסקופ הקונמוקד מומן על ידי קרן קנוט ואליס ולנברג.

<ol>
	<li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li><li>Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ending+the+message:+poly(A)+signals+then+and+now.">Ending the message: poly(A) signals then and now.</a> Genes &amp; Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+The+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>F&#252;llgrabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Lgr6++Progenitor+Cells+in+the+Hair+Follicle,+Sebaceous+Gland,+and+Interfollicular+Epidermis.">Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).</li><li>Lazzeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocycle-related+tubular+cell+hypertrophy+and+progenitor+proliferation+recover+renal+function+after+acute+kidney+injury.">Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).</li><li>Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolour+lineage+tracing+reveals+clonal+dynamics+of+squamous+carcinoma+evolution+from+initiation+to+metastasis.">Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).</li><li>Yoo, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Castration-Resistant+Bmi1+Sox2++Cells+in+Driving+Recurrence+in+Prostate+Cancer.">The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).</li><li>McConnell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Regulates+Progenitor+Cell+Quiescence+and+Differentiation+in+the+Airway.">p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway.</a> Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+cells+are+self-renewing+chondrocyte+progenitors,+which+form+the+articular+cartilage+in+juvenile+mice.">Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice.</a> Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+radical+switch+in+clonality+reveals+a+stem+cell+niche+in+the+epiphyseal+growth+plate.">A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate.</a> Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, 25902 (2017).</li><li>Kozhemyakina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Prg4-expressing+articular+cartilage+progenitor+cell+population+in+mice.">Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice.</a> Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).</li><li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreERT+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton.">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li><li>Mizuhashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+zone+of+the+growth+plate+houses+a+unique+class+of+skeletal+stem+cells.">Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells.</a> Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).</li><li>Reinert, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen-Induced+Cre+loxP+Recombination+Is+Prolonged+in+Pancreatic+Islets+of+Adult+Mice.">Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice.</a> PloS One. 7 (3), 33529 (2012).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+response+of+primary+human+bone+marrow+stromal+cells+to+recombinant+human+bone+morphogenic+protein-2+in+the+early+and+late+stages+of+osteoblast+differentiation.">In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).</li><li>Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+In+Vivo+model+for+combinatorial+fluorescence+labeling+in+mouse+prostate.">Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate.</a> The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).</li><li>Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., S&#228;vendahl, L., Chagin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC1+in+chondrocytes+does+not+affect+proliferation+or+differentiation,+but+causes+the+resting+zone+of+the+growth+plate+to+become+disordered.">Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered.</a> Bone Reports. 8, 64-71 (2018).</li><li>Xie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+precursors+contribute+to+skeletal+formation+during+embryonic+development+in+mice+and+zebrafish.">Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

מודל קונפטי שימש בהרחבה כדי ללמוד רקמות סחוס מינרליזציה12,13,14 כדי לתאר את הפרוטוקול אופטימיזציה. קונפטי עכברים2 עם עותק אחד או שני עותקים של אלל R26R-קונפטי יכול לשמש לרבייה וניסויים. שילוב מחדש של עכברים עם אלל אחד של במחקר ב2.1 לבנות ייתן ארבע תוויות פוטנציאליות: חלבון פלורסנט אדום (rfp, cytoplasmic), חלבון פלורסנט צהוב (yfp, cytoplasmic), חלבון פלורסנט ציאן (CFP, מקומי מקומית), וירוק חלבון פלורסנט (GFP, גרעין-מקומי), ואילו שילוב מחדש בעכברים homozygous קונפטי (כלומר, המכיל שני עותקים של המוח 2.1 לבנות) ייתן 10 פלטי צבע אפשריים (RFP + RFP, rfp + YFP, RFP + CFP, RFP + מעלה, yfp + בfp, yfp + CFP, FP + GFP, CFP + CFP, CFP + GFP, GFP + GFP. עם זאת, בגלל הכריתה DNA והיפוך האירועים מתרחשים בצורה סטוכסטית, שילוב מחדש כדי לייצר GFP מתרחשת רק חלק קטן של תאים, כפי שדווח קודם לכן2, ולכאורה שונה על-ידי סוג תא או קוהיצור בשימוש2, 12,13. מכאן, בהתחשב בהתרחשות נמוכה של אירועים שילוב מחדש המוביל ביטוי GFP, שישה פלטי צבע הם הנפוצים ביותר בעכברים homozygous קונפטי.
שיקול חשוב כאשר תכנון ניסויים עם עכבר קונפטי הוא למצוא זן המתאים של היצור. ראשון, מאז כולל של קונפטי יש מספר אתרי loxP, אירוע אחד שילוב מחדש לא ממנוע השני4. משמעות הדבר היא שאם תא מסומן ומתחלק להפקת שיבוט של צבע אחד, אירוע שילוב חוזר שני באחד מתאי בתו יפיק צבע שונה, ובכך מסווה את הרחבת השבטים האמיתית. Thus, זנים noninducible, שבו האנזים הוא תמיד פעיל אם היזם המתאים פעיל, לא מומלץ. שנית, בזנים מסוימים את הביטוי של היצור recombinase לעתים קרובות מגיע על חשבון של חלבון אנדוסוגני, ובכך ליצור פנוטיפ משלו (למשל, עבור Prg4-GFPCreERT2 נקישה העכבר למתח שבו עכברים הנמל שני האללים של היצורים15), אז עותק אחד של אלל של היצור הוא רצוי. בכל הניסויים המתוארים, עותק אחד של Col2CreERT16 נישא על ידי הזכר או ההורה הנשי כדי ליצור Col2CreERT: הקונפטי עכברים, כמתואר13. לאחר מכן, הספציפיות של קו היצור לסוג התא של עניין היא שיקול חשוב. לדוגמה, Col2CreERT הוא כchondrocyte ספציפי, אבל תוויות מספר אוכלוסיות נפרדות של כונדרוציטים בתוך הסחוס מוקדם לאחר הלידה17. לבסוף, הפעילות של זנים שונים של היצור יכול לשנות במידה ניכרת עם גיל החיות, כמו פעילות אנדוגניים של היזם מנוצל עבור שינויים ביטוי היצור, גם בתאים מאותו סוג (למשל, Prg4-GFPCreERT2, אשר יכול לדרוש הגדלת מספר מינונים של טמוקסיפן כדי לתייג תאי אזור שטחיים כעכברים בגיל15).
מספר התאים שכותרתו ישתקף על ידי כמות טממוקסיפן נתון, אז זה לא תמיד רצוי לתת את המינון המקסימלי, כי הבחנה שיבוטים אחד מהשני עשוי להיות קשה. בגלל הביטוי היצור שונה תחת התקנה של יזמים שונים כמו גם עם הגיל, מינון טמוקסיפן יהיה צורך לכוונן כדי למטב את התיוג. חשוב לציין כי התאים אינם פלורסנט מיד על מפעיל שילוב, כי הזמן נדרש עבור שילוב מחדש להתרחש ואת החלבונים כתוצאה מפלורסנט לצבור מספיק עבור הדמיה. יש צורך במגוון רחב של שעות (בין 24 ל-72 ש ח), שנראה כמושפע מקו היצור, סוג התא וגיל החיות. מאז טמוקסיפן יכול להיות פעיל ביולוגית זמן רב לאחר מינהל18 זה תמיד מומלץ לבדוק ביסודיות את היעילות שילוב מחדש בכל דגם.
במהלך השלב המיקרוסקופיה, עירור החלבונים הפלורסצנט מחייבת חדירת הרקמה באור לייזר. בגלל רקמות שונות יש מאפיינים שונים, אור לייזר עלול לא לחדור 160 יקרומטר חלקים עבים של כל הרקמות. עם זאת, חלקים עבים כאלה ניתן להשתמש עבור סחוס לוחית הצמיחה, כפי שנעשה בשימוש באיור 2, איור 3. שימו לב כי כל מיקרוסקופ שונה, ולא סביר שההגדרות המתוארות (קובץ משלים 1) יפעלו באופן מושלם ללא התאמות קלות. אחד האתגרים העיקריים הוא להבדיל בין חלבונים פלורסנט שונים כדי להבטיח כי אין זיהום מערוץ אחד למשנהו. לדוגמה, האות בערוץ YFP שנגרם על-ידי הזריחה הבאה מ-GFP חופפת בין ערוצי YFP ו-RFP. יש לבדוק בקפידה גם את ערוצי YFP ו-CFP. ניתן לעשות זאת במספר דרכים. ראשית, טווח הפליטה של אורכי גל אור פלורסנט הנרשמים עבור כל חלבון פלורסנט ניתן לצמצם. שנית, כוונון כוח הלייזר בשילוב עם הרווח הדיגיטלי יכול למטב את האות. במחקר זה שלבים אלה היו מספיקים, אבל הם סומכים על אות פלורסנט חזק. משמעות הדבר היא כי בתאוריה, עיבוד רקמות לא יעיל יכול להפחית את הפעילות של חלבונים פלורסנט, או מקור חלש לייזר אור יכול לפגוע הפרדת הערוץ.
אחד היתרונות של העכבר קונפטי הוא שזה יכול להיות משולב עם מספר גדול של זנים מוטאנטים גנטית זמינים כך ההשפעה של גנים ספציפיים על דינמיקה שבטים ניתן ללמוד10,11,12 ,13,14,19,20. אם כי עם כמה הגבלות לדוגמה, שילוב מחדש של אלטלס הקונפטי והגן של הריבית אינו יכול להיות מופרד בעת שימוש במוטציות מבוססות-שושלת שבטים משולבים עם מעקב אחר השושלת. למרות זאת, כגון שילוב אירועים מחדש יכול להיות יעיל10,14,20. לדוגמה, אפשרות זו שימש כדי לחקור את מספר התא מוגבר באזור מנוחה של עכברים בעקבות כונדרולידה הספציפי אבלציה של TSC1 בלוח הצמיחה21 וחשף את הקשר בין השבטים בין תאים אלה לאורך זמן 13. בנוסף, ניתוח שבטים ספציפיים לרקמה באמצעות עכברי קונפטי יכול לשמש עם עכברים שאינם מבוססי loxp מבוסס מוטציה11, ואפשר גם לשלב גישות אלה עם תרופתי8,9 ,13 ו/או מודלים כירורגיים8 כדי לדמיין תגובות שבטים רטבאליות פונקציונלי אחרים. הזדמנויות נוספות עולות כאשר משלבת קונפטי עם תוויות מקטעים עם זיהוי חיסוני של חלבונים אנדוגניים על ידי immunofluorescence. ניתוח כזה מאפשר זיהוי של תאי מעקב והתאמה לשפות אחרות עם סמן ידוע. עם שיטת הקיבוע שתוארה לעיל, ניתן לבצע immunofluorescence ועדיין להמחיש את הקרינה הפלואורסצנטית מחלבונים פלורסנט12,13. עם זאת, בעיתונים שהוזכרו, אחזור אנטיגן לא היה נדרש. שיטות החזרת אנטיגן קשות, כגון רתיחה במאגר ציטראט, מובילה לאובדן מוחלט של מגזרי הקרינה. למרות החלבונים פלורסנט לאחר מכן ניתן להבחין באמצעות נוגדנים22, אובדן של זהות שבטיים יכול להתרחש.
לסיכום, באמצעות מודל קונפטי כדי לתייג תאים ב vivo הוא כלי אינפורמטיבי כדי לנתח את גורלם של תאים אלה לאורך זמן. השיטה המתוארת מספקת דרך מהירה ויעילה להמחיש ישירות ביטוי חלבון פלורסנט ברקמות מינרליזציה.

שיטות משופרות לניטור התנהגות התא רצוי כדי להגביר את היעילות הניסיונית בעת שימוש בדגמי חיות. אחת הגישות האינפורמטיביות ביותר כדי לפקח על התנהגות התא ב vivo הוא מעקב השושלת השבטיים עם זנים מרובי צבעים עכבר הכתב1, כולל בשימוש נרחב R26R-קונפטי (קונפטי) עכבר2. על ידי תיוג גנטי תאים בודדים עם חלבונים פלורסנט ובעקבות תאים אלה לאורך זמן, חוקרים בתחומים רבים השתמשו בעכבר קונפטי כדי לחשוף תובנות להמון של מערכות ביולוגיות שונות.
העכבר קונפטי הוא מערכת מבוססת loxP העיתונאי שבו שילוב של דנ א התלויים של ה-DNA גורם הביטוי הקבוע של אחד מכמה חלבונים פלורסנט אפשרי בצורה סטוכסטית2. אלל R26R-קונפטי כולל את היזם באופן אוביקאני הביע, אשר שוכנת מיד במעלה הזרם שלloxp-מוקףמשניהקלטת 2, אשר רצף פוליאדלציה מסיים שעתוק3, ואחריו ה ברייבוו 2.1 מבנה4 מכאן, שילוב של היצור-מתווך מחדש בו מחילה את הקלטת ניאוRומוביל לייצור של חלבונים פלורסנט מסוימים בהתאם לחלקים של המבנה 2.1 ברייברכיו הם החוצה. תכונה זו הופכת את העכבר קונפטי מאוד להתאמה משום שהוא יכול לשמש כדי למקד את כל האוכלוסייה התאית בעכבר שעבורו זן מסוים של היצור זמין. החצייה של זן ספציפי לרקמה מסוימת עם זן R26R-קונפטי מספק ספציפיות של תיוג. עם זאת, זן היצור צריך גם להיות inducible (g., creert או CreERT2, אשר דורשים כריכת טממוקסיפן כדי לאפשר להם להיכנס לגרעין ולגרום DNA רקומבינציה5) כך תיוג ניתן להשיג בנקודות זמן שצוינו. לפיכך, ניתן לתייג את האוכלוסייה התאית על-ידי הזרקת הצאצאים של התוצאה החיובית/קונפטי עם טממוקסיפן בזמן הרצוי ומעקב לגיל מסוים, כאשר ניתן לאסוף את רקמות הריבית לצורך ניתוח. לאחר עיבוד רקמות, התאים fluorescently המסומנים באופן ישיר ניתן לדמיין במישרין על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית כך הצאצא של כל תא בתווית בתחילה ניתן להפריד מן הצאצאים שנוצרו על ידי כל תא תווית אחרת מבוסס על פלורסנט ספציפיים שלהם תוויות, ובכך לאפשר הclonality להיות מוערך (כלומר, מעקב גנטי שבטים).
בשל הגמישות של המודל קונפטי, הוא הוחל ללמוד פיתוח ותחזוקה של רקמות שונות רבות בריאות ומחלות2,6,7,8,9, 10,11. אחת הדרכים הנפוצות להשתמש במודל היא לתייג אוכלוסיה מסוימת של תאים ולקבוע באילו רקמות הם (ו/או צאצאם) תרמו. אחד כזה ממצא באמצעות גישה זו היה כי השן הבוגרת מורכבת של תאים עם מקור גליה6. יישום נוסף של המודל הוא לחקור את תאי גזע הומאוסטזיס. לדוגמה, המודל קונפטי חשף כי תאי גזע נישות בתוך המעי קריפטטים בהדרגה להיות חד שבטיים כי כמה שיבוטים תא גזע דומיננטיים במהלך התחרות בין תאי גזע2. המודל יכול לשמש גם כדי להעריך את התפשטות התאים, אשר שימושי במיוחד עבור הלומדים באופן איטי חלוקת תאים. לדוגמה, היווצרות שבטים בסחוס הפרקולארית12 הוערך, ואת ההשפעות לטווח קצר של היריב קיפוד על צלחת הצמיחה כונדרוציטים בעכברים ישנים חמישה שבועות נחקרו13.
למרות הפשטות היחסית של מודל קונפטי, אות פלורסנט יכול להיות מאתגרת טכנית כדי לשמר עד אוסף התמונות, במיוחד בעת ניתוח רקמות מינרליזציה. כאן, הפרוטוקול מתאר מודל ממוטב להשתמש בעכבר קונפטי עם עצם לאחר הלידה (עד 6 חודשים של גיל), המאפשר חלבונים פלורסנט להיות במישרין דמיינו על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ללא צורך בזיהוי חיסוני. ניתן להחיל פרוטוקול מפושט זה על רקמות שאינן מינרליזציה. יתר על כן, כולל תיאור של כיצד לאחסן את הדגימות כדי לשמר את האות פלורסנט לתקופה ממושכת של לפחות 3 שנים. חלוקה לרמות של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-thiodiethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCF9328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm-long cover slips</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>220588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold (standard)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Model: NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cryostat blades</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>207500014</td>
			<td>Specifically for use with hard tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Scharlan</td>
			<td>AC0960005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde concentrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18708.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V7130</td>
			<td>Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software for 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>11-8162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>102094-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06498.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost UltraPlus slides</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware for Confocal laser scanning microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues

תיוג תא בודד בגוף כדי לפקח איזה סוגי תאים זה יכול לתת עלייה ולעקוב אחר הגירה שלה דרך האורגניזם או לקבוע אריכות הימים שלה יכול להיות דרך רבת עוצמה כדי לחשוף מנגנונים של פיתוח רקמות ותחזוקה. אחד הכלים החשובים ביותר הזמינים כעת לניטור תאים בvivo הוא מודל העכבר הקונפטי. מודל קונפטי יכול לשמש לתווית גנטית תאים בודדים בעכברים חיים עם חלבונים פלורסנט שונים באופן ספציפי סוג תא ולפקח על גורלם, כמו גם את גורלם של הצאצאים שלהם לאורך זמן, בתהליך שנקרא מעקב גנטי שבטים או מעקב שושלת שבטים. מודל זה נוצר כמעט לפני עשור, תרם הבנה משופרת של תהליכים ביולוגיים רבים, במיוחד קשור לביולוגיה תא גזע, פיתוח, וחידוש של רקמות מבוגרים. עם זאת, שמירה על אות פלורסנט עד איסוף התמונה ולכידת סימולטני של אותות פלורסנט שונים היא מאתגרת טכנית, במיוחד עבור רקמות מינרליזציה. פרסום זה מתאר פרוטוקול צעד-אחר-צעד לשימוש במודל קונפטי כדי לנתח את הסחוס של לוחית הצמיחה שניתן למרוח על כל רקמה מינרליזציה או לא מינרליזציה.

כדי לתייג כונדרוציטים בסחוס החותם ולדמיין את התפשטות המשובטים שלהם עם הגיל באמצעות מינהל טמוקסיפן על P1, Col2CreERT: עכברים קונפטי סומנו, ואת הגפיים האחוריות שלהם נאספו על P27. החלק המרכזי נקבע על ידי המחשה ברצועה הצולבת (איור 2 א) ושיבוטים בצלחת הצמיחה האבובית הראשי של העיר היו דמיינו (איור 2a). נתונים אלה מראים כי תאים בודדים שהיו Col2-חיוביים על P1 והפך מתויג עם חלבונים פלורסנט כאשר טמוקסיפן היה מנוהל, עברו הרחבת שבטים, ולאחר מכן נשאר בצלחת הצמיחה עד P27. ניתן לראות את השינויים הראשוניים בהרחבת המשובטים מנקודת זמן התפתחותית דומה באיור 1 של הפרסום האחרון13.
כדי להעניק דוגמה לאות הפלורסנט לאחר אחסון לטווח ארוך (שלב 5.5), המקטע שנאסף אוחסן מיד לאחר (ראה איור 2א, ב) במשך יותר מ-3 שנים לפני שהיה מוכן ומחושב (איור 2c, וידאו 1) .
כדי להדגים מספר בעיות נפוצות בפרוטוקול, מקטע שנותק במהלך שלב ההקפאה מוצג באיור 3A. אזור המקטע (בין לוחית הצמיחה והסחוס הפרקולארית) התרחב באיור 3B מראה כי מינון זה של טמוקסיפן מוביל לרמה כזו גבוהה של שילוב מחדש באזור זה כי זה היה למנוע ניתוח שבטים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig01.jpg"> איור 1: סקירה ניסויית. תרשים זרימה המסכם את שלבי המפתח בשיטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig02.jpg"> איור 2: קונפטי תמונות מתוך Col2CreERT: עכבר קונפטי. (א) דגימות של Col2CreERT: עכברי קונפטי עובדו ללא הדקיפיקציה או בשלב האחסון לטווח הארוך. החלק המרכזי היה ממוקם ברצועה הצולבת כסמן. תמונה זו היה דמיינו באמצעות לסרוק אריח לאחר גילוי RFP עם T-PMT (סרגל קנה מידה = 300 μm). (ב) עמודות שבטים מוצגים בתוך השוקה האבובית של צלחת הצמיחה לעין (א), לאחר שחזור תלת-ממד. (ג) שקופית סמוכה לזה המוצגת ב (א) ו-(ב) שנערך באחסון לטווח ארוך במשך יותר מ -3 שנים עובדו עבור דימות ושחזור תלת-ממדי. RFP, YFP ו-CFP מוצגים ב (ב) ו-(ג) (סולם מייצגי פעילויות = 50 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig03.jpg"> איור 3: אתגרים בעת שימוש בשיטה. (א) קווי מקווקו לבן מתווה פיצול במקטע באמצעות צלחת הצמיחה של Col2CreERT: עכברים קונפטי (סרגל קנה מידה = 50 μm). האזור בתוך התיבה הלבנה מוצג ב (ב) (סרגל קנה מידה = 25 μm). RFP, YFP, ו-CFP מוצגים בשני הפאנלים, ואת אור לייזר שאינו משתקף (T-PMT) ערוץ מוצג גם ב (א) כדי להמחיש את הרקמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: שחזור תלת מימדי של צלחת צמיחה מ Col2CreERT: עכבר קונפטי. שקופית שהוכנה מ Col2CreERT: עכבר קונפטי הוחזק באחסון לטווח ארוך לאחר המשך יותר מ 3 שנים, ולאחר מכן מעובד עבור הדמיה. שחזור תלת מימדי נערך באופן אוטומטי עם תוכנת ניתוח תמונה ומיוצא כווידאו. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/video_1.mov" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
קובץ משלים 1: הגדרת אופיינית של המיקרוסקופ קונפוקלית וקד. (א) הפקדים העיקריים הקיימים בכרטיסיה רכישה .(ב-למעלה) הפרמטרים לייזר, העירור אורך הגל, ומגוון אורכי גל פליטה מוקלט מוצגים עבור שלושה חלבונים פלורסצנט. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424supfig01.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues at JoVE.com

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

שיטה זו מתארת את השימוש במודל העכבר R26R-קונפטי (קונפטי) כדי לחקור רקמות מינרליזציה, כיסוי כל הצעדים מאסטרטגיית הרבייה ועד לאפשרות התמונה. כלול הוא פרוטוקול כללי שניתן להחילם על כל הרקמות הרכות ופרוטוקול שהשתנה שניתן להחילם על רקמות מינרליזציה.

מעקב גנטי שבטים באמצעות עכבר קונפטי למחקר רקמות מינרליזציה

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

על ידי תיוג גנטי של תאים בודדים עם חלבונים פלואורסצנטיים ועקוב אחר תאים אלה לאורך זמן, עכבר קונפטי אפשר לחוקרים לחשוף תובנות חדשות על תהליכים ביולוגיים רבים. הפרוטוקול שלנו ממזער את זמן ההשהיה בין איסוף רקמות להדמיה, ניתן ליישם על כל רקמה מינרלית או לא מומרת ושומר על פלואורסצנטיות במשך מספר שנים. שיטה זו שימושית מאוד עבור כל התחומים של רפואה רגנרטיבית וביולוגיה התפתחותית כי זה יכול להיות מיושם על אוכלוסיות הסלולר שונים כדי ללמוד את גורלם ואת הקינטיקה שלהם כל עוד קו Cre מתאים זמין.ההוראות שלנו צעד אחר צעד ידגימו את הצעד המאתגר ביותר להבחין בהבדל של אותות פלואורסצנטיים הנפלטים מחלבונים פלואורסצנטיים שונים. התחל על ידי הכנת רקמת העכבר להדמיה. עבור רקמות רכות ו tibiae מינרלים ו femora מעכברים עד 45 ימים, לתקן את הרקמה precooled 3.7% פורמלדהיד PBS ולטוג אותו ב 4 מעלות צלזיוס במשך שש שעות תוך גלגול בעדינות על מסובב.עבור רקמות מינרליות כגון tibiae ו femora מעכברים מעל גיל 45 ימים, להכין ליטר אחד של 10% פתרון EDTA עם pH מותאם 8.05 עם נתרן הידרוקסידי לדלל את פורמלדהיד ל 3.7% באמצעות פתרון זה. לתקן את הרקמה על ידי שמירה על זה 3.7% פורמלדהיד PBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, למקם אותו לתוך פתרון EDTA פורמלדהיד precooled ודגירה אותו ב 4 מעלות צלזיוס תוך סיבוב במשך 48 שעות, הקפד להחליף את הפתרון שלוש פעמים במהלך הדגירה.לאחר מכן מניחים את הרקמה לתוך סוכרוז 30%, הקפד למלא את המיכל עד שוליים, בעדינות לסובב אותו לילה בארבע מעלות צלזיוס. בבוקר, להשתמש בממטרים כדי להסיר את הרקמה מתסמת סוכרוז ולשטוף אותו בחמישה מיליליטר של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, במשך כמה שניות. מלא cryomold שכותרתו מראש עם OCT ולמקם את הרקמה בתחתית, עובד במהירות כדי למנוע את המדגם של ישיבה בטמפרטורת החדר במשך זמן רב מדי.להטמיע את המדגם על ידי הנחת התבנית על קרח יבש ומחכה OCT להתגבש. אם הדגימות אינן בשימוש מיידי, ניתן לאחסן אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס. הסר את הבלוק מהתבנית.החל OCT בין החלק העליון של הבלוק ואת צ'אק ו לקרר אותו קריוסטט לפחות חמש דקות או עד OCT מתגבש לחלוטין. מקדים את מחזיק הדגימה ואת מחזיק הלהב למינוס 20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מניחים את הדגימה במחזיק הצ'אק ואת הלהב במחזיק הלהב, ומאפשרים להם לצייד במשך מספר דקות. לניתוח לוחיות צמיחה לאחר לידה, הכינו מקטעים שהם 30 עד 160 מיקרומטר.השתמש קריוסטט כדי לקצץ את הבלוק לחתוך קטעי רקמה לעובי מתאים ולאסוף אותם על שקופיות. ואז האוויר לייבש את המגלשות בטמפרטורת החדר עד שהם יבשים לחלוטין ולאחסן אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס עד 36 חודשים. כאשר מוכן להשתמש בשקופית, להסיר אותו מהמקפיא ולהביא אותו לטמפרטורת החדר במחזיק שקופית.כדי להסיר את ה- OCT, החל בעדינות PBS על השקופית עם פיפטה פסטר. במשך 160 חלקים בעובי מיקרומטר, הדגירה את השקופית במשך 15 דקות, להסיר את הנוזל ולהחיל PBS טרי במשך חמש דקות נוספות. הר את המגלשות בתסיכה של 75% thiodiethanol בטמפרטורת החדר עם 60 מילימטר אורך כיסוי מחליק.ראשית, בחר את ערוץ RFP על-ידי לחיצה עליו בכרטיסיה ערוצים, מה שגורם לפרטי הערוץ להיות מוצגים בכרטיסיה נתיב אור. לאחר מכן לחץ על תיבת הסימון לצד T-PMT. מקם את השקופית במחזיק השקופית ומקם את רקמת העניין ישירות בין נתיב האור לעדשת המטרה.כדי להפוך את הרקמה ללאוקלית, בטלו את הבחירה בתיבות YFP ו- CFP מתחת לכותרת הרצועות של הכרטיסיה ערוצים. בחר את ערוץ T-PMT בכותרת הרצועות ולאחר מכן לחץ על שידור חי בכרטיסייה רכישה ולהגדיל את הרווח עבור ערוץ T-PMT כדי לדמיין את בחירת הרקמה על המסך. התאם את מיקום השקופית כדי לאתר את אזור העניין ולהתמקד באמצעות ידית המיקרוסקופ המתאימה.לאחר מכן לחץ על עצור בכרטיסיה רכישה כדי לבטל את החשיפה בלייזר. הגדר פרמטרי הדמיה בהתאם להוראות כתב היד והתאם את גודל חור הסיכה במידת הצורך. בדוק את ההתקנה כדי לוודא כי האותות המוקלטים אינם חופפים ולאחר מכן בחר את כל שלושת הערוצים בכרטיסיה ערוצים ולחץ על לחצן הצמד.גלול בין ערוצי התצוגה בתמונה המתקבלת על-ידי לחיצה על התיבות המסומן הכחולות מעל כל ערוץ בכרטיסיה ממדים ובדוק באופן ידני חפיפה בין הערוצים על המסך. אם האותות חופפים, הסתגל מחדש לפרמטרים עד שניתן יהיה להבדיל אותם זה מזה. פרוטוקול זה שימש לתיוג כונדרוציטים בסחוס האפיפיזי ולהמחיש את התפשטות השיבוטים שלהם עם הגיל.החלק המרכזי נקבע על ידי הדמיה של הרצועה הצולבת ושיבוטים בצלחת הצמיחה הטיביאלית הפרוקסימלית דימוי. תאים בודדים שהיו חיוביים Col2 והפכו מתויגים עם חלבונים פלואורסצנטי קונפטי על ניהול טמוקסיפן, עבר התרחבות שיבוט ולאחר מכן נשאר בצלחת הצמיחה. ניתן לדמיין את האות הפלואורסצנטי לאחר אחסון ארוך טווח.חלקים מסוימים אוחסנו במשך יותר משלוש שנים לפני ההכנה וההדמיה. שחזור תלת מימדי נערך באופן אוטומטי עם תוכנת ניתוח תמונה ומיוצא כסרטון. קטע אחד שבור במהלך שלב cryosectioning מכיל אזור עם רמה כה גבוהה של recombination כי זה ימנע ניתוח שיבוט, המדגים את אחת הבעיות הנפוצות נתקל עם פרוטוקול זה.בהתאם לשאלת המחקר שלך, באמצעות קו Cre כי במיוחד תוויות התאים שלך עניין יכול להיות חשוב מאוד. לכן, אנו ממליצים לבדוק פלואורסצנטיות בתאים אלה זמן קצר לאחר recombination. שימוש בקווי Cre בלתי ניתנים לחיסון הוא חיוני משום שקומבציה מתמשכת של דנ"א בקווי Cre בלתי ניתנים לעיכול יכולה לשנות את הפרופיל הפלואורסצנטי של התאים המסוידים ובכך למנוע ניתוח שיבוטים.פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם הפרעות תפקודיות כגון זנים מניפולציה גנטית, טיפולים תרופתיים, התערבויות כירורגיות, כמו גם כתם פלואורסצנטיות אימונו של חלקים מוכנים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...