Name: clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues
Uploaded: 2019-10-23T14:30:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues at JoVE.com

हम methodological सलाह के लिए डॉ Evgeny Ivashkin धन्यवाद. यह काम आर्थिक रूप से स्वीडिश अनुसंधान परिषद (ए.एस.सी), रूसी वैज्ञानिक फाउंडेशन (एएससी के लिए #19-15-00241 अनुदान), Karolinska संस्थान (ए.एस.सी.), StratRegen KI और Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-rsfond (ए.एस.सी.), Stiftelsen द्वारा समर्थित किया गया था फ्रिमुरे बरनहुसेट और सालस्कापेट बार्नवार्ड (पी.टी.एन.), चीनी छात्रवृत्ति परिषद (बी.जेड.)। confocal माइक्रोस्कोप Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया.

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लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Confetti मॉडल बड़े पैमाने पर खनिज उपास्थि ऊतकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था12,13,14 और अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन. Confetti चूहों2 एक प्रति या R26R-Confetti allele की दो प्रतियों के साथ प्रजनन और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Brainbow 2.1 निर्माण के एक एलील के साथ चूहों में पुनर्संयोजन चार संभावित लेबल दे देंगे: लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP, साइटोप्लाज्मिक), पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP, साइटोप्लाज्मिक), सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी, झिल्ली-स्थानीयकृत), और हरे रंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, नाभिक-स्थानीयकृत), जबकि समयुग्मज कंफ़ेटी चूहों में पुनर्संयोजन (यानी, Brainbow 2.1 निर्माण की दो प्रतियां युक्त) 10 संभव रंग outputs दे देंगे (RFP + आरएफपी, आरएफपी + आरएफपी + CFP, आरएफपी + GF, YFP, YFP, YFP+ YFP+ GFP, CFP+CFP, CFP+GFP, GFP+GFP). हालांकि, क्योंकि डीएनए चीरा और व्युत्क्रम घटना एक stochastic तरीके से होते हैं, GFP का उत्पादन करने के लिए पुनर्संयोजन केवल कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश में होता है, के रूप में पहले की सूचना दी2, और प्रतीत होता है सेल प्रकार या Cre लाइन द्वारा अलग है2, 12,13. इसलिए, GFP अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी पुनर्संयोजन घटनाओं की कम घटना को देखते हुए, छह रंग outputs समयुग्मज Confetti चूहों में सबसे आम हैं.
एक महत्वपूर्ण विचार जब Confetti माउस के साथ प्रयोगों की योजना बना एक उपयुक्त क्रे तनाव मिल रहा है. सबसे पहले, के बाद से Confetti allele कई loxP साइटों है, एक पुनर्संयोजन घटना एक दूसरे4preclude नहीं करता है. इसका मतलब यह है कि अगर एक सेल लेबल और एक रंग का क्लोन का उत्पादन करने के लिए विभाजित है, अपनी बेटी कोशिकाओं में से एक में एक दूसरी पुनर्संयोजन घटना एक अलग रंग उत्पन्न होता है, जिससे सच क्लोनल विस्तार मास्किंग. इस प्रकार, noninducible Cre उपभेदों, जहां एंजाइम हमेशा सक्रिय है अगर इसी प्रमोटर सक्रिय है, उचित नहीं हैं. दूसरा, कुछ उपभेदों में Cre recombinase की अभिव्यक्ति अक्सर एक अंतर्जात प्रोटीन की कीमत पर आता है, जिससे अपनी खुद की एक phenotype बनाने (उदाहरण के लिए, Prg4-GFPCreERT2 दस्तक में माउस तनाव जिसमें चूहों बंदरगाह दो Creles15), तो Crealle की एक प्रति वांछनीय है. वर्णित प्रयोगों के सभी में, Col2CreERT16 की एक प्रतिलिपि या तो पुरुष या महिला माता पिता द्वारा किया गया था Col2CreERT उत्पन्न करने के लिए: Confetti चूहों, के रूप में वर्णित13. इसके बाद, ब्याज के सेल प्रकार के लिए क्रे लाइन की विशिष्टता एक महत्वपूर्ण विचार है. उदाहरण के लिए, Col2CreERT कोन्ड्रोसाइट-विशिष्ट है, लेकिन प्रारंभिक प्रसवोत्तर प्रसव17में कोन्ड्रोसाइट्स की कई अलग-अलग आबादी को लेबल करता है। अंत में, विभिन्न क्रे उपभेदों की गतिविधि पशु उम्र के साथ काफी बदल सकते हैं, के रूप में क्रे अभिव्यक्ति परिवर्तन के लिए उपयोग प्रमोटर के अंतर्जात गतिविधि, यहां तक कि एक ही प्रकार की कोशिकाओं में (जैसे, Prg4-GFPCreERT2, जो एक बढ़ती आवश्यकता कर सकते हैं चूहों की उम्र15के रूप में सतही क्षेत्र कोशिकाओं लेबल करने के लिए tamoxifen खुराक की संख्या ).
लेबल कोशिकाओं की संख्या दिया tamoxifen की राशि से परिलक्षित होगा, तो यह हमेशा के लिए अधिकतम खुराक देने के लिए वांछनीय नहीं है क्योंकि एक दूसरे से क्लोन भेद मुश्किल हो सकता है. क्योंकि क्रे अभिव्यक्ति विभिन्न प्रमोटरों के विनियमन के तहत और साथ ही उम्र के साथ अलग अलग होंगे, tamoxifen खुराक लेबलिंग का अनुकूलन करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को तुरंत पुनर्संयोजन ट्रिगर पर फ्लोरोसेंट नहीं कर रहे हैं क्योंकि समय होने के लिए पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक है और जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग के लिए पर्याप्त रूप से जमा करने के लिए. घंटे की एक विस्तृत श्रृंखला (24 डिग्री 72 एच के बीच) की जरूरत है, जो क्रे लाइन, सेल प्रकार, और पशु उम्र से प्रभावित प्रतीत होता है. के बाद से tamoxifen जैविक रूप से लंबे समय के बाद प्रशासन सक्रिय किया जा सकताहै 18 यह हमेशा अच्छी तरह से प्रत्येक मॉडल में पुनर्संयोजन दक्षता की जांच करने के लिए सलाह दी जाती है.
confocal माइक्रोस्कोपी कदम के दौरान, Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन की उत्तेजना लेजर प्रकाश द्वारा ऊतक के प्रवेश की आवश्यकता है. क्योंकि विभिन्न ऊतकों में अलग-अलग गुण होते हैं, लेजर प्रकाश सभी ऊतकों के 160 डिग्री मीटर मोटी वर्गों में प्रवेश नहीं कर सकता है। तथापि, इस प्रकार के मोटे खंडों का उपयोग वृद्धि प्लेट उपास्थि के लिए किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 2चित्र 3में प्रयुक्त किया गया है। ध्यान दें कि हर माइक्रोस्कोप अलग है, और यह संभावना नहीं है कि वर्णित सेटिंग्स (अनुपूरक फाइल 1) मामूली समायोजन के बिना पूरी तरह से काम करेंगे. प्रमुख चुनौतियों में से एक के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन भेद करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ एक चैनल से दूसरे में कोई संदूषण नहीं है. उदाहरण के लिए, YFP चैनल में संकेत GFP से आने वाले फ्लोरोसेंट के कारण YFP और RFP चैनल के बीच ओवरलैप करता है। YFP और CFP चैनलों को भी सावधानी से जाँच की जानी चाहिए. यह कई तरीकों से किया जा सकता है। सबसे पहले, फ्लोरोसेंट प्रकाश तरंगदैर्ध्य है कि प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए दर्ज कर रहे हैं की उत्सर्जन रेंज सीमित किया जा सकता है. दूसरा, डिजिटल लाभ के साथ संयोजन में लेजर शक्ति का समायोजन संकेत का अनुकूलन कर सकते हैं. इस अध्ययन में इन चरणों के लिए पर्याप्त थे, लेकिन वे एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत पर भरोसा करते हैं. इसका मतलब यह है कि सिद्धांत रूप में, अक्षम ऊतक प्रसंस्करण फ्लोरोसेंट प्रोटीन की गतिविधि को कम कर सकते हैं, या एक कमजोर लेजर प्रकाश स्रोत चैनल जुदाई ख़राब कर सकते हैं.
Confetti माउस के फायदे में से एक यह है कि यह आनुवंशिक रूप से उत्परिवर्ती उपभेदों की एक बड़ी संख्या है कि उपलब्ध हैं ताकि क्लोनल गतिशीलता पर विशिष्ट जीन के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है के साथ जोड़ा जा सकता है10,11,12 ,13,14,19,20, हालांकि कुछ सीमाओं के साथ . उदाहरण के लिए, Confetti alleles और ब्याज के जीन के पुनर्संयोजन अलग नहीं किया जा सकता है जब Cre loxP आधारित उत्परिवर्ती क्लोनल वंश अनुरेखण के साथ संयुक्त का उपयोग कर. फिर भी , इस तरह के संयोग पुनर्संयोजन की घटनाओं प्रभावी हो सकताहै 10,14,20. उदाहरण के लिए, इस संभावना के लिए चूहों के आराम क्षेत्र में वृद्धि हुई कोशिका संख्या का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रसव के बाद कोन्ड्रोसाइट-विशिष्ट विकास प्लेट21 में TSC1 के ablation और समय के साथ इन कोशिकाओं के बीच क्लोनल संबंध से पता चला 13. इसके अतिरिक्त, कंफ़ेटी चूहों का उपयोग कर ऊतक-विशिष्ट क्लोनल विश्लेषण गैर-Cre loxP-आधारित उत्परिवर्ती चूहों11के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है , और यह भी औषधीय8,9 के साथ इन तरीकों गठबंधन करने के लिए संभव है ,13 और / या शल्य मॉडल8 अन्य कार्यात्मक क्षोभ के लिए क्लोनल प्रतिक्रियाओं कल्पना करने के लिए. इसके अलावा अवसर उत्पन्न तब होते हैं जब कॉन्फेटी लेबल वाले वर्गों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा अंतर्जात प्रोटीन के इम्यूनोडिटेक्शन के साथ संयोजित किया जाता है। इस तरह के विश्लेषण का पता लगाया कोशिकाओं की पहचान और एक ज्ञात मार्कर के साथ उनके colocalization की अनुमति देता है. इसमें वर्णित निर्धारण विधि के साथ, इम्यूनोफ्लोरेसी का संचालन करना और अभी भी कंफ़ेटी फ्लोरोसेंट प्रोटीन12,13से फ्लोरोसेंट की कल्पना करना संभव है। तथापि, उल्लिखित पत्रों में प्रतिजन पुनः प्राप्ति की आवश्यकता नहीं थी। इस तरह के साइट्रेट बफर में उबलते के रूप में हर्ष प्रतिजन पुनर्प्राप्ति तरीकों, Confetti फ्लोरोसेंट की एक पूरी हानि की ओर जाता है। हालांकि Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन तो एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है22, क्लोनल पहचान का नुकसान हो सकता है.
सारांश में, Vivo में कोशिकाओं लेबल करने के लिए Confetti मॉडल का उपयोग कर समय के साथ उन कोशिकाओं के भाग्य का विश्लेषण करने के लिए एक जानकारीपूर्ण उपकरण है. वर्णित विधि खनिज ऊतकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति सीधे कल्पना करने के लिए एक तेज और कुशल तरीका प्रदान करता है।

बेहतर तरीकों सेल व्यवहार की निगरानी करने के लिए जब पशु मॉडल का उपयोग प्रयोगात्मक दक्षता बढ़ाने के लिए वांछनीय हैं। विवो में सेल व्यवहार पर नजर रखने के लिए सबसे जानकारीपूर्ण दृष्टिकोणमें से एक बहुरंगा रिपोर्टर माउस उपभेदों 1 के साथ क्लोनल वंश अनुरेखणहै,व्यापक रूप से इस्तेमाल किया R26R-Confetti (Confetti) माउस2सहित. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से लेबलिंग और समय के साथ उन कोशिकाओं का पालन करके, कई क्षेत्रों में शोधकर्ताओं ने Confetti माउस का इस्तेमाल किया है विभिन्न जैविक प्रणालियों की एक भीड़ में अंतर्दृष्टि प्रकट.
Confetti माउस एक loxP आधारित रिपोर्टर प्रणाली है जिसमें Cre निर्भर डीएनए पुनर्संयोजन एक stochastic तरीके से कई संभव फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से एक की स्थायी अभिव्यक्ति का कारण बनता है2. R26R-Confetti allele सर्वव्यापक व्यक्त CAGG प्रमोटर, जो तुरंत एक loxP-फ्लैंक्ड नवआर-कैसेट2के ऊपर स्थित है, जिसका polyadenylation अनुक्रम प्रतिलेखनसमाप्त3 , उसके बाद शामिल Brainbow 2.1 निर्माण4| इसलिए, क्रे-मध्यस्थ पुनर्संयोजन एक साथनियो आर-कैसेट को बढ़ाता है और कुछ फ्लोरोसेंट प्रोटीनों के उत्पादन की ओर जाता है, जिसके आधार पर बीरेनबो 2.1 निर्माण के कुछ हिस्सों को निकाला जाता है। यह सुविधा Confetti माउस अत्यंत अनुकूलनीय बनाता है क्योंकि यह एक माउस में किसी भी सेलुलर आबादी को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जिसके लिए एक विशिष्ट क्रे तनाव उपलब्ध है. R26R-Confetti तनाव के साथ एक ऊतक-विशिष्ट क्रे तनाव के पार लेबलिंग की विशिष्टता प्रदान करता है. हालांकि, क्रेज़ भी प्रेरक होना चाहिए (जैसे, CreERT या CreERT2, जो tamoxifen बाध्यकारी की आवश्यकता के लिए उन्हें नाभिक में प्रवेश करने के लिए और डीएनए पुनर्संयोजन प्रेरित करने की अनुमति5)ताकि लेबलिंग निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकार, एक सेलुलर जनसंख्या परिणामी CreERT-positive/Confetti-सकारात्मक संतानों को वांछित समय बिंदु पर tamoxifen के साथ इंजेक्शन लगाकर लेबल किया जा सकता है और एक निश्चित उम्र के लिए ट्रैक किया जा सकता है, जब ब्याज के ऊतकों को विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है। ऊतक प्रसंस्करण के बाद, फ्लोरोसेंट लेबल कोशिकाओं को सीधे confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है ताकि प्रत्येक शुरू में लेबल सेल की संतान उनके विशिष्ट फ्लोरोसेंट के आधार पर किसी भी अन्य लेबल सेल द्वारा उत्पन्न संतान से अलग किया जा सकता है लेबल, जिससे क्लोनलिटी का मूल्यांकन किया जा करने के लिए अनुमति देता है (यानी, क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण).
कॉन्फेटी मॉडल के लचीलेपन के कारण, यह स्वास्थ्य और रोग2,6,7,8,9में कई विभिन्न ऊतकों के विकास और रखरखाव के अध्ययन के लिए लागू किया गया है, 10,11. मॉडल का उपयोग करने के लिए एक आम तरीका कोशिकाओं की एक निश्चित आबादी लेबल और निर्धारित करने के लिए जो ऊतकों वे (और / इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए ऐसा ही एक निष्कर्ष यह था कि वयस्क दांत में ग्लिल मूल 6 वाली कोशिकाएं होतीहैं. मॉडल का एक अन्य आवेदन स्टेम सेल homeostasis का अध्ययन करने के लिए है. उदाहरण के लिए, Confetti मॉडल से पता चला कि आंतों crypts में स्टेम सेल niches धीरे-धीरे monoclonal हो क्योंकि कुछ स्टेम सेल क्लोन स्टेम सेल2के बीच प्रतिस्पर्धा के दौरान प्रमुख हैं. मॉडल भी सेल प्रसार है, जो धीरे धीरे विभाजित कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, आर्टिकुलर उपास्थि12 में क्लोनल गठन का मूल्यांकन किया गया था, और पांच सप्ताह पुराने चूहों में विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स पर एक हेजहॉग विरोधी के अल्पकालिक प्रभाव का अध्ययन किया गया13.
Confetti मॉडल के रिश्तेदार सादगी के बावजूद, फ्लोरोसेंट संकेत तकनीकी रूप से छवि संग्रह तक बनाए रखने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से जब खनिज ऊतकों का विश्लेषण. यहाँ, प्रोटोकॉल प्रसव के बाद की हड्डी के साथ Confetti माउस का उपयोग करने के लिए एक अनुकूलित मॉडल का वर्णन करता है (उम्र के 6 महीने तक), फ्लोरोसेंट प्रोटीन को सक्षम करने के लिए सीधे इम्यूनोडिटेक्शन के लिए आवश्यकता के बिना confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की. यह सरलीकृत प्रोटोकॉल गैर खनिजीकृत ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, शामिल कैसे नमूने स्टोर करने के लिए कम से कम 3 साल की एक लंबी अवधि के लिए फ्लोरोसेंट संकेत की रक्षा के लिए एक विवरण है. प्रोटोकॉल की एक रूपरेखा चित्र 1में प्रस्तुत की गई है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-thiodiethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCF9328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm-long cover slips</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>220588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold (standard)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Model: NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cryostat blades</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>207500014</td>
			<td>Specifically for use with hard tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Scharlan</td>
			<td>AC0960005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde concentrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18708.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V7130</td>
			<td>Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software for 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>11-8162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>102094-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06498.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost UltraPlus slides</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware for Confocal laser scanning microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues

शरीर में एक व्यक्तिगत कोशिका लेबलिंग की निगरानी करने के लिए जो सेल प्रकार यह करने के लिए वृद्धि दे सकते हैं और जीव के माध्यम से अपने प्रवास को ट्रैक या इसकी लंबी उम्र का निर्धारण ऊतक विकास और रखरखाव के तंत्र प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका हो सकता है. सबसे महत्वपूर्ण उपकरण वर्तमान में vivo में कोशिकाओं की निगरानी के लिए उपलब्ध में से एक Confetti माउस मॉडल है. Confetti मॉडल आनुवंशिक रूप से एक सेल प्रकार विशेष तरीके से विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ चूहों में रहने वाले चूहों में व्यक्तिगत कोशिकाओं लेबल और उनके भाग्य की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही समय के साथ उनकी संतान के भाग्य, एक प्रक्रिया में क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण या कहा जाता है क्लोनल वंश अनुरेखण. इस मॉडल को लगभग एक दशक पहले उत्पन्न किया गया था और कई जैविक प्रक्रियाओं की एक बेहतर समझ में योगदान दिया है, विशेष रूप से स्टेम सेल जीव विज्ञान से संबंधित, विकास, और वयस्क ऊतकों के नवीकरण. हालांकि, जब तक छवि संग्रह और विभिन्न फ्लोरोसेंट संकेतों का एक साथ कब्जा फ्लोरोसेंट संकेत के संरक्षण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से खनिज ऊतक के लिए. यह प्रकाशन विकास प्लेट उपास्थि है कि किसी भी mineralized या nonminralized ऊतक के लिए लागू किया जा सकता का विश्लेषण करने के लिए Confetti मॉडल का उपयोग करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.

epiphyseal उपास्थि में कोन्ड्रोसाइट्स लेबल और P1 पर tamoxifen प्रशासन का उपयोग कर उम्र के साथ उनके क्लोनल विस्तार कल्पना करने के लिए, Col2CreERT: Confetti चूहों लेबल थे, और उनके पिछले limbs P27 पर एकत्र किए गए थे. केंद्रीय खंड का निर्धारण क्रूसिएट स्नायु (चित्र 2क) और निकटस्थ टिबियल वृद्धि प्लेट में क्लोनों को विरूपित करके किया गया था (चित्र 2ख) इन आंकड़ों से पता चलता है कि व्यक्तिगत कोशिकाओं है कि P1 पर Col2 सकारात्मक थे और Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल बन गया जब tamoxifen प्रशासित किया गया था, क्लोनल विस्तार किया गया, और बाद में P27 तक विकास की थाली में बने रहे. इसी प्रकार के विकासात्मक समयांक से क्लोनल विस्तार में प्रारंभिक परिवर्तन हाल ही के प्रकाशन13के चित्र 1 में देखा जा सकता है .
दीर्घकालिक भंडारण (चरण 5.5) के बाद फ्लोरोसेंट सिग्नल का एक उदाहरण देने के लिए, एकत्र किए गए अनुभाग को 3 से अधिक वर्षों के लिए ( चित्र 2A,B) के तुरंत बाद संग्रहीत किया गया था (चित्र 2C, वीडियो 1) .
प्रोटोकॉल के साथ कुछ सामान्य समस्याओं को प्रदर्शित करने के लिए, क्रायोसेक्शनिंग चरण के दौरान टूटा हुआ एक खंड चित्र 3कमें दिखाया गया है। खंड के क्षेत्र (वृद्धि की थाली और संधि उपास्थि के बीच) चित्रा 3B में विस्तार से पता चलता है कि tamoxifen की इस खुराक इस क्षेत्र में पुनर्संयोजन के इस तरह के एक उच्च स्तर की ओर जाता है कि यह क्लोनल विश्लेषण रोक नाबंद होगा.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig01.jpg"> चित्र 1: प्रायोगिक अवलोकन. प्रवाह चार्ट विधि की मुख्य अवस्थाओं को सारांशित करता है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig02.jpg"> चित्रा 2: एक Col2CreERT: Confetti माउस से Confetti छवियों. (क)Col2CreERT: Confetti चूहों के नमूने decalification या दीर्घकालिक भंडारण कदम के बिना संसाधित किया गया. केंद्रीय खंड एक मार्कर के रूप में cruciate स्नायु का उपयोग कर स्थित था. इस छवि को T-PMT (स्केल बार $ 300 $m) के साथ RFP का पता लगाने के बाद टाइल स्कैन का उपयोग करके विज़ुअलाइज़ किया गया था. (ख) क्लोनल कॉलम 3डी पुनर्निर्माण के बाद (क) में दिखाई देने वाली वृद्धि प्लेट के समीपस्थ टिबिया के भीतर दिखाए जाते हैं। (ग) 3 वर्ष से अधिक समय तक दीर्घावधि भंडारण में (ए) और (बी) में दर्शाए गए एक आसन्न स्लाइड को इमेजिंग और 3 डी पुनर्निर्माण के लिए संसाधित किया गया था . RFP, YFP, और CFP में दिखाएजातेहैं ( बी ) और (सी) (स्केल सलाखों $ 50 $m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig03.jpg"> चित्र 3: विधि का उपयोग करते समय चुनौतियां. (ए) सफेद डैश्ड रेखाएँ Col2CreERT:Confetti चूहों की वृद्धि प्लेट के माध्यम से अनुभाग में विभाजन की रूपरेखा तैयार करती हैं (स्केल बार ] 50 उ)। श्वेत बॉक्स के भीतर का क्षेत्रफल (B) (स्केल बार ] 25 उ) में दिखाया गया है। RFP, YFP, और CFP दोनों पैनलों में दिखाए जाते हैं, और nonreflected लेजर प्रकाश (टी पीएमटी) चैनल भी में दिखाया गया है(ए) ऊतक कल्पना करने के लिए. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
वीडियो 1: Col2CreERT से एक विकास प्लेट के तीन आयामी पुनर्निर्माण: Confetti माउस. एक Col2CreERT से तैयार स्लाइड: Confetti माउस से अधिक 3 साल के लिए अनुभागीकरण के बाद लंबी अवधि के भंडारण में आयोजित किया गया था, और फिर इमेजिंग के लिए संसाधित. तीन आयामी पुनर्निर्माण छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ स्वचालित रूप से आयोजित किया गया था और एक वीडियो के रूप में निर्यात. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/video_1.mov" target="_blank">कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए.</a>
अनुपूरक फ़ाइल 1: confocal माइक्रोस्कोप के विशिष्ट सेट अप. (A) अधिग्रहण टैब में उपस्थित मुख्य नियंत्रण . (B]D) लेजर पैरामीटर, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य, और दर्ज उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य की सीमा तीन Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए दिखाए जाते हैं. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424supfig01.jpg" target="_blank">इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.</a>

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Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

इस विधि खनिज ऊतकों का अध्ययन करने के लिए R26R-Confetti (Confetti) माउस मॉडल के उपयोग का वर्णन करता है, छवि अधिग्रहण करने के लिए प्रजनन रणनीति से सभी चरणों को कवर. शामिल एक सामान्य प्रोटोकॉल है कि सभी नरम ऊतकों और एक संशोधित प्रोटोकॉल है कि खनिज ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है के लिए लागू किया जा सकता है.

खनिजीकृत ऊतकों का अध्ययन करने के लिए Confetti माउस का उपयोग कर क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं लेबलिंग और समय के साथ उन कोशिकाओं के बाद, कंफ़ेटी माउस शोधकर्ताओं को कई जैविक प्रक्रियाओं में नई अंतर्दृष्टि प्रकट करने की अनुमति दी है । हमारा प्रोटोकॉल ऊतक संग्रह और इमेजिंग के बीच अंतराल समय को कम करता है, किसी भी खनिज या गैरखनिजित ऊतक पर लागू किया जा सकता है और कई वर्षों तक फ्लोरेसेंस को बरकरार रखता है। यह विधि पुनर्योजी चिकित्सा और विकासात्मक जीव विज्ञान के सभी क्षेत्रों के लिए बहुत उपयोगी है क्योंकि इसे उनके भाग्य और उनके काइनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए विभिन्न सेलुलर आबादी पर लागू किया जा सकता है जब तक कि एक उपयुक्त क्रे लाइन उपलब्ध है।हमारे कदम-दर-कदम निर्देश विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेतों के अंतर को अलग करने के लिए सबसे चुनौतीपूर्ण कदम प्रदर्शित करेंगे। इमेजिंग के लिए माउस ऊतक तैयार करके शुरू करें। 45 दिनों तक चूहों से नरम ऊतकों और खनिज टिबिया और फेमोरा के लिए, ऊतक को प्रीकूल्ड 3.7% फॉर्मलडिहाइड पीबीएस में ठीक करें और इसे छह घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकाएं जबकि एक रोटेटर पर धीरे से रोलिंग करें।45 दिनों की उम्र में चूहों से टिबिया और फेमोरा जैसे खनिज ऊतकों के लिए, सोडियम हाइड्रोक्साइड के साथ 8.05 में समायोजित पीएच के साथ 10% ईडीए समाधान का एक लीटर तैयार करें और इस समाधान का उपयोग करके फॉर्मेल्डिहाइड को 3.7% तक पतला करें। ऊतक को 3.7% फॉर्मलडिहाइड पीबीएस में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखकर ठीक करें। अगले दिन, इसे प्रीकूल्ड फॉर्मलडिहाइड ईडीटीए समाधान में रखें और 48 घंटे तक घुमाते हुए इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जिससे इनक्यूबेशन के दौरान समाधान को तीन बार बदलना सुनिश्चित हो।फिर ऊतक को 30% सुक्रोज में रखें, कंटेनर को किनारा करने के लिए सुनिश्चित करें, और धीरे-धीरे इसे चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर घुमाएं। सुबह में, सुक्रोज समाधान से ऊतक को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे कुछ सेकंड के लिए इष्टतम काटने वाले तापमान यौगिक या OCT के पांच मिलीलीटर में कुल्ला करें। अक्टूबर के साथ एक पूर्व लेबल क्रायोमोल्ड भरें और नीचे ऊतक की स्थिति, जल्दी से काम करने के लिए नमूना बहुत लंबे समय के लिए कमरे के तापमान पर बैठे से बचने के लिए ।सूखी बर्फ पर मोल्ड रखकर नमूना एम्बेड करें और अक्टूबर को जमना का इंतजार कर रहे हैं। यदि नमूनों का तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो उन्हें शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। मोल्ड से ब्लॉक निकालें।ब्लॉक और चक के शीर्ष के बीच अक्टूबर लागू करें और इसे क्रायोस्टेट में कम से कम पांच मिनट के लिए ठंडा करें या जब तक कि अक्टूबर पूरी तरह से जम न जाए। नमूना धारक और ब्लेड धारक को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस तक प्रीकूल करें, फिर नमूना को चक धारक और ब्लेड धारक में ब्लेड में रखें, और उन्हें कई मिनट तक बराबरी करने की अनुमति दें। प्रसवोत्तर विकास प्लेट विश्लेषण के लिए, उन वर्गों को तैयार करें जो 30 से 160 माइक्रोमीटर हैं।ब्लॉक को ट्रिम करने के लिए क्रायोस्टेट का उपयोग करें और ऊतक वर्गों को उपयुक्त मोटाई में काटें और उन्हें स्लाइड पर एकत्र करें। फिर हवा कमरे के तापमान पर स्लाइड सूखी जब तक वे पूरी तरह से शुष्क कर रहे है और उंहें ३६ महीने तक के लिए शूंय से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । जब स्लाइड का उपयोग करने के लिए तैयार है, यह फ्रीजर से निकालें और एक स्लाइड धारक में कमरे के तापमान के लिए ले आओ ।अक्टूबर को हटाने के लिए, धीरे से पाश्चुर पिपेट के साथ स्लाइड पर PBS लागू होते हैं । 160 माइक्रोमीटर मोटी धाराओं के लिए, 15 मिनट के लिए स्लाइड को इनक्यूबेट करें, तरल को हटा दें और पांच मिनट के लिए ताजा पीबीएस लागू करें। 60 मिलीमीटर लंबी कवर स्लिप के साथ कमरे के तापमान पर 75% थिओडिथेनॉल के समाधान में स्लाइड्स माउंट करें।सबसे पहले चैनल टैब में उस पर क्लिक करके आरएफपी चैनल का चयन करें, जिसकी वजह से चैनल का विवरण लाइट पाथ टैब में प्रदर्शित होता है। इसके बाद टी-पीएमटी के बगल में टिक बॉक्स पर क्लिक करें। स्लाइड धारक में स्लाइड रखें और ब्याज के ऊतकों को सीधे प्रकाश पथ और उद्देश्य लेंस के बीच रखें।ऊतक को स्थानीयकृत करने के लिए, चैनल टैब के शीर्षक पटरियों के नीचे वाईएफपी और सीएफपी बक्से का चयन करें। पटरियों शीर्षक में टी-पीएमटी चैनल का चयन करें, फिर अधिग्रहण टैब में लाइव क्लिक करें और स्क्रीन पर ऊतक चयन की कल्पना करने के लिए टी-पीएमटी चैनल के लिए लाभ बढ़ाएं। ब्याज के क्षेत्र का पता लगाने और उचित माइक्रोस्कोप घुंडी का उपयोग करके ध्यान केंद्रित करने के लिए स्लाइड की स्थिति को समायोजित करें।फिर लेजर एक्सपोजर को बंद करने के लिए अधिग्रहण टैब में स्टॉप पर क्लिक करें। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार इमेजिंग मापदंडों को परिभाषित करें और यदि आवश्यक हो तो पिनहोल आकार को समायोजित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए सेटअप की जांच करें कि रिकॉर्ड किए गए सिग्नल ओवरलैप न करें, फिर चैनल टैब में तीनों चैनलों का चयन करें और स्नैप बटन दबाएं।आयाम टैब में प्रत्येक चैनल के ऊपर नीले हाइलाइट किए गए बॉक्स पर क्लिक करके परिणामी छवि में डिस्प्ले चैनलों के बीच स्क्रॉल करें और स्क्रीन पर चैनलों के बीच ओवरलैप के लिए मैन्युअल रूप से जांच करें। यदि संकेत ओवरलैप होते हैं, तो मापदंडों को तब तक समायोजित करें जब तक कि उन्हें एक-दूसरे से अलग न किया जा सके। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एपिफिसियल उपास्थि में कोनड्रोसाइट्स को लेबल करने और उम्र के साथ उनके क्लोनल विस्तार की कल्पना करने के लिए किया गया था।केंद्रीय खंड क्रूसिएट स्नायु की कल्पना करके निर्धारित किया गया था और समीपस्थ टिबियल विकास प्लेट में क्लोन चित्रित किए गए थे। व्यक्तिगत कोशिकाएं जो Col2 सकारात्मक थीं और टैमोक्सिफेन प्रशासन पर कंफ़ेटी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल हो गईं, क्लोनल विस्तार से गुजरी और बाद में विकास की थाली में बनी रहीं। फ्लोरोसेंट सिग्नल को दीर्घकालिक भंडारण के बाद कल्पना की जा सकती है।तैयारी और इमेजिंग से पहले कुछ वर्गों को तीन साल से अधिक समय तक संग्रहीत किया गया था। तीन आयामी पुनर्निर्माण स्वचालित रूप से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ आयोजित किया गया था और एक वीडियो के रूप में निर्यात किया गया था । क्रायोसेक्शनिंग चरण के दौरान टूटे हुए एक खंड में इस तरह के उच्च स्तर के पुनर्संयोजन के साथ एक क्षेत्र होता है कि यह क्लोनल विश्लेषण को रोकेगा, इस प्रोटोकॉल के साथ सामना की गई आम समस्याओं में से एक का प्रदर्शन करेगा।अपने शोध प्रश्न के आधार पर, एक क्रे लाइन का उपयोग करना जो विशेष रूप से आपकी रुचि की कोशिकाओं को लेबल करता है, बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है। इसलिए, हम पुनर्संयोजन के तुरंत बाद उन कोशिकाओं में फ्लोरेसेंस की जांच करने की सलाह देते हैं। प्रेरक क्रे लाइनों का उपयोग करना आवश्यक है क्योंकि गैर-इंडिबल क्रे लाइनों में चल रहे डीएनए पुनर्संयोजन से सोल्यूटेड कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट प्रोफाइल में परिवर्तन हो सकता है जिससे क्लोनल विश्लेषण को पहले से ही शामिल किया जा सकता है ।इस प्रोटोकॉल को कार्यात्मक क्षोभ के साथ जोड़ा जा सकता है जैसे आनुवंशिक रूप से हेरफेर किए गए उपभेदों, औषधीय उपचार, शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप, साथ ही तैयार वर्गों के इम्यूनो फ्लोरेसेंस धुंधला।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Confocal विश्लेषण का उपयोग करना<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Wnt और श्श्श Morphogen ढ़ाल के Modulators जांच

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

बहु रंग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों का उपयोग कॉर्नियल प्रकोष्ठों के वंश पता लगाने के लिए एक विधि

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Cardiomyocyte डीएनए संश्लेषण और Ploidy का एक साथ आकलन: एक तरीका है cardiomyocyte उत्थान और कारोबार की मात्रा असिस्ट करने के लिए

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

आनुवंशिक मॉडल के साथ Intravital फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (IVFM) का मेल अस्थि मज्जा niches के लिए टेम कोशिकाओं के Engraftment गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

इन विट्रो नकली Microgravity के तहत माउस Preantral कूप की वृद्धि

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

जमे हुए अनुभाग के लिए चुंबकीय नैनोकण ट्रांसडक्शन वायरल वेक्टर्स का उपयोग प्राथमिक माउस आंत्र organoids की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic संस्कृति विधि भ्रूण चिकन ऊतकों के विकास का अध्ययन करने के लिए

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

पूरे माउस भ्रूण में β-galactosidase गतिविधि का पता लगाने के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति अनुरेखण

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

एक में इन विट्रो मॉडल एक समानांतर प्लेट छिड़काव प्रणाली के जीवाणु पालन के लिए भ्रष्टाचार के ऊतकों का अध्ययन करने के लिए

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Vivo में एक विधि माउस रक्त-वृषण बाधा अखंडता का अध्ययन करने के लिए

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...