Name: clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues
Uploaded: 2019-10-23T14:30:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues at JoVE.com

Vi takker Dr. Evgeny Ivashkin for metodisk råd. Dette arbeidet ble støttet finansielt av det svenske Forskningsrådet (S.s. C), den russiske vitenskapelige stiftelse (Grant #19-15-00241 til ASC), Karolinska Institute (A.S.C.), StratRegen KI og stiftelsen konung Gustaf V:s 80-årsfond (A.S.C.), stiftelsen Frimurare Barnhuset og Sallskapet Barnavard (P.T.N.), kinesisk stipend Council (B.Z.). Konfokalmikroskopi mikroskop ble finansiert av Knut og Alice Wallenberg Foundation.

Alt muse arbeid ble godkjent av den etiske komiteen for dyre eksperimenter (Stockholm North Committee/Norra Djurförsöksetiska Nämd) og gjennomført i samsvar med det svenske Animal Agency ' s bestemmelser og retningslinjer for dyre eksperimentering.
1. mus avl
<ol><li>For å generere belastningen, krysser R26R-konfetti musen med grobunn linje av interesse. Avvenne det pups for 21 dager av alderen. Merk: mus kan brukes til avl fra ca. 8 ukers alder, eller i henhold til de lokale retningslinjene. Genotyperingteknologi (ikke beskrevet her) kan utføres fra biopsier samlet på avvenning. Alder på avvenning kan justeres i henhold til lokale retningslinjer.</li>
</ol>2. konfetti merking
Merk: Denne merkingen strategien er hensiktsmessig for Tamoxifen induserbart grobunn stammer.
<ol><li>Forbered en løsning på opptil 2,5 mg/mL Tamoxifen i en glass flaske. Oppløses ved oppvarming til 37 ° c i en ovn i opptil 60 min, agitating hver 5 min med en Vortex til pulveret har oppløst. Merk: for økte doser av Tamoxifen kan løsninger på opptil 20 mg/mL tilberedes med denne metoden.</li>
	<li>Oppbevares ved 4 ° c i opptil 3 måneder, beskyttet mot lys.</li>
	<li>Indusere rekombinasjon ved å administrere 50 μL av 2,5 mg/mL Tamoxifen oppløst i mais olje intraperitonealt på den første postnatal dagen (P1). Merk: i prinsippet kan Tamoxifen administreres i alle aldre, så tidlig som F1-generasjonen. Dosen av Tamoxifen bør varieres basert på grobunn uttrykk, mus alder, og eksperimentell søknad. Du finner mer informasjon i diskusjons delen. Grobunn negative mus behandlet på samme måte kan brukes som en negativ kontroll for konfetti fluorescerende signaler. FORSIKTIG: Sørg for at dyre behandlingene advares mot Tamoxifen bruk og sørg for at bur materialene avhendes i henhold til lokale retningslinjer for miljø og sikkerhet.</li>
</ol>3. tissue samling
<ol><li>Euthanize mus på postnatal dag 27 (P27) ved gradvis å fylle plassen inneholder mus med karbondioksid opp til minst 80% av volum og opprettholde denne konsentrasjonen i 3 min. Utfør cervical forvridning. Hold mus på isen under Disseksjon av de andre dyrene.</li>
	<li>Analysere ut vevet av interesse. Skissert nedenfor er en protokoll for å samle de proksimale tibial og de-fylte femur vekst platene og ledd brusk i kneet, egnet for postnatal mus opp til fylte 6 måneder.<ol>
<li>Fjern huden rundt bakbena så langt som til foten, ved hjelp av skarp saks og tann tang.</li>
		<li>Grovt trim muskler og fettvev fra bena med skarpe saks. Merk: ikke Rengjør beina perfekt, fordi de omkringliggende vev gir noen strukturell støtte ved snitting, men sørg for at alle huden er fjernet.</li>
		<li>Bruk en skalpell, skjær gjennom bløtvevet der toppen av benet møter kroppen til lårbenshodet er synlig, og skjær deretter leddbånd i hofteleddet for å fjerne beinet. Merk: Hvis det ikke er mulig å finne lårbenshodet, må du skjære gjennom femur i nærheten av hoften med en sterk saks.</li>
		<li>Analysere foten fra resten av benet ved hjelp av en skalpell eller skarp saks.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. vev fiksering og bearbeiding
Merk: basert på vevet av interesse, Følg en av de to protokollene beskrevet nedenfor (4,1 for bløtvev eller 4,2 for mineralisert mus vev over en alder av ca 45 dager, som beskrevet nedenfor). For begge metodene, lagre dissekert prøvene i 3,7% formaldehyd/fosfat bufret saltvann (PBS) løsning på isen mens dissekere de resterende dyrene.
<ol><li>For bløtvev og mineralisert tibiae og femora opp til fylte ca P45, fikse vevet i forkjøles 3,7% formaldehyd/PBS for 6 h, rullende forsiktig på en Rotator ved 4 ° c. Bruk et volum minst 10x større enn det av vevet. Fortsett direkte til trinn 4,3.</li>
	<li>For mineralisert vev, inkludert tibiae og femora over en alder av ca P45, et Avkalking trinn er nødvendig.<ol>
<li>Forbered 1 L av 10% EDTA/dH2O løsning med pH justert til 8,05 ved hjelp av natriumhydroksid. Deretter fortynne formaldehyd til 3,7% ved hjelp av denne løsningen. Arbeids konsentrasjonen av EDTA vil være 9%.</li>
		<li>Fix vevet ved å plassere i forkjøles 3,7% formaldehyd/PBS over natten, ruller forsiktig på en Rotator ved 4 ° c.</li>
		<li>Plasser vevet i forkjøles 3,7% formaldehyd/9% EDTA/dH2O løsning (pH 8,05), og roter forsiktig ved 4 ° c i et volum minst 10x større enn i vevet. Gjenta dette trinnet ved å plassere beina i frisk, forkjøles 3,7% formaldehyd/9% EDTA/dH2O for 3x over neste 48 h. Merk: denne korte avkalking er nok til å muliggjøre snitting av femur og Tibia bein på opptil 6 måneder gamle mus. For mer tett mineralisert vev ytterligere Avkalking kan være nødvendig å forbedre histologi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Overfør vevet til forkjøles 30% sukrose/dH2O. Sørg for å fylle beholderen til randen, og roter forsiktig over natten ved 4 ° c. Bruk et volum minst 10x større enn det av vevet. Vevet vil ofte flyte når første plassert i denne løsningen og synke til bunnen av flasken ved morgenen.</li>
	<li>For å fjerne rester sukrose løsningen, kort vaske vevet ved å fjerne den fra sukrose løsning med tang og fullstendig dekker prøven med ca 5 ml optimal skjæring temperatur sammensatte (OCT) i flere sekunder.</li>
	<li>Fyll en prelabeled cryomold med OCT og plassere vevet nederst. Arbeid raskt for å unngå at prøvene sitter ved romtemperatur for lenge. Merk: det er viktig å plassere prøven i en praktisk retning for skjære trinnet. Hvis du vil øke sjansene for snitting gjennom hele kolonnene for vekst plate etter sporing med Col2CreERT: konfetti, plasserer du sidekanten vendt ned med lårbenshodet som en hjelpelinje, og plasserer prøven så flat til bunnen av formen som mulig.</li>
	<li>Embed prøven ved å plassere mold på tørr is og venter på OCT å helt stivne. Plasser cryomolds så flatt som mulig for å unngå bevegelse/glidende vev i formen. Når du er ferdig, lagre prøvene ved-20 ° c, hvis de ikke brukes umiddelbart. Merk: bruk innen 12 uker, fordi med alderen blokkene blir vanskeligere å seksjon.</li>
</ol>5. snitting
Merk: Utfør kryosnitt med en kryostaten med engangsblader som er egnet for hardt vev. Enhver standard kryostaten er egnet.
<ol><li>Fjern blokken fra mold og sikre den til Chuck ved å bruke OCT mellom toppen av blokken og Chuck og kjøling i kryostaten ved-20 ° c i minst 5 min, slik at OCT har fullstendig befestet.</li>
	<li>Forkjøle både prøve holderen og bladholderen til-20 ° c og plasser deretter prøven/Chuck i Chuck holderen og bladet i bladholderen for å likevekt i flere minutter. Merk: de angitte temperaturene kan varieres av flere grader avhengig av kryostaten og vevet av interesse.</li>
	<li>Bruk kryostaten å trimme blokken og kutte vev deler av en passende tykkelse for å tillate visualisering av kloner i vevet av interesse.<ol>
<li>For postnatal vekst plate analyse, forberede seksjoner av 30 − 160 μm og samle dem på lysbilder. Noen kryostaten modeller kan bare tillate innsamling av tykke seksjoner ved hjelp av trim-innstillingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Luft tørker lysbildene ved romtemperatur til de er helt tørre. Merk: varigheten av dette trinnet kan variere basert på vevs egenskaper og snitt tykkelse. Temperaturen i rommet er også sannsynlig å påvirke hastigheten på dette trinnet.</li>
	<li>Oppbevar lysbildene ved-20 ° c i opptil 36 måneder, eller hvis behandlingen umiddelbart, Fortsett til trinn 6,2.</li>
</ol>6. klargjøring og montering av Slide
<ol><li>Fjern raset fra fryseren og få opp til romtemperatur horisontalt i en lysbilde holder. La kondens fordampe.</li>
	<li>Fjern OCT ved hjelp av en Pasteur-pipette for å forsiktig bruke PBS ved romtemperatur på lysbildet. Jo tykkere delen er, jo lengre tid er nødvendig. For 160 μm tykke seksjoner, utføre to skyllinger: ruge gang for 15 min og fjerne væsken, og deretter bruke frisk PBS i 5 min og fjerne væsken. Merk: dette trinnet er å fjerne OCT og kan varieres basert på vev egenskaper og snitt tykkelse, etter behov. Temperaturen i rommet er sannsynlig å påvirke hastigheten på dette trinnet.</li>
	<li>Monter lysbildene i en løsning med 75% 2, 2-thiodiethanol/dH2O ved romtemperatur med 60 mm lange deksel slips. Merk: lysbildene kan tilberedes umiddelbart før bildebehandling, men fluorescerende signalet er stabilt i 1 − 2 uker hvis det holdes ute av lyset i et fuktet kammer ved 4 ° c.</li>
</ol>7. Imaging av konfokalmikroskopi mikroskopi
<ol><li>Sett opp mikroskopet.<ol>
<li>Slå på mikroskopet og åpne programvaren. Klikk på Start system -knappen.</li>
		<li>Velg kanalene ved først å klikke på smart oppsett under kategorien Anskaffelse og deretter velge de tre kanalene som tilsvarer rødt fluorescerende protein (RFP), gult fluorescerende protein (YFP) og cyan fluorescerende protein (CFP) under Dye overskriften. Klikk beste signalet deretter gjelde for å velge lasere. Merk: innholdet i kategorien Anskaffelse vises i supplerende fil 1a. Hvis de nødvendige kanalene ikke finnes, legger du dem til ved å bruke '+'-knappen under fargestoff overskriften. Den nødvendige informasjon om laser, eksitasjon bølgelengder, og omfanget av innspilte utslipps bølgelengder vises for de tre konfetti fluorescerende proteiner i supplerende fil 1B-D.</li>
		<li>Velg den 20x objektive linsen under objektiv overskriften i kategorien anskaffelses modus .</li>
	</ol></li>
	<li>Finn vekst plate eller andre vev av interesse.<ol>
<li>Hvis du vil gi en distinkt visning, velger du først RFP-kanalen ved å klikke på navnet i kategorien kanaler . Dette fører til detaljer om RFP-kanalen som skal vises i kategorien lys bane . Klikk i avmerkingsboksen ved siden av T-avdrag. Merk: T-PMT-kanalen viser nonreflected laser lys, som brukes til å visualisere de nonfluorescent delene av vevet.</li>
		<li>Plasser lysbildet i lysbildeholderen, og plasser vekst platen eller et annet vev av interesse direkte mellom lys banen og objektivlinsen.</li>
		<li>For å forenkle lokalisere vevet, fjerne merkingen av YFP og CFP-kanaler ved hjelp av tick-boksene under spor overskriften på kanaler kategorien.</li>
		<li>Velg T-PMT-kanalen ved å klikke på navnet i overskriften spor . Klikk Live i kategorien Anskaffelse , og Øk forsterkningen (Master) for T-PMT-kanalen for å visualisere vevs delen på skjermen, som vises i gråskala.</li>
		<li>Flytt posisjonen til lysbildet ved hjelp av styrespaken for å finne interesseområdet, og fokuser deretter med riktig mikroskop knott.</li>
		<li>Klikk på Stopp i kategorien Anskaffelse for å slå av laser eksponeringen.</li>
	</ol></li>
	<li>Definer bilde parametrene.<ol>
<li>Bruk avmerkingsboksene i kanaler -fanen for å velge en av kanalene og klikk på Live i kategorien Anskaffelse for å vise bildet av den kanalen på skjermen. Deretter, ved hjelp av venstre klikk-knappen på musen, justere Slide-barer for å angi rekkevidden av utsendt fluorescerende signal som er samlet inn, laseren strøm (skyve bar under lasere Heading), Gain (Master) og digital offset i Kanaler -fanen for å visualisere konfetti-merkede celler på skjermen. Retningslinje verdier for alle disse parameterne er gitt i supplerende filen 1B-D for RFP, YFP og CFP. Fullfør dette trinnet for hver kanal, én etter én. Merk: for å sikre at det visualisere signalet ikke er autofluorescence, kan et avsnitt fra et grobunn-negativt dyr brukes som en negativ kontroll under dette trinnet. Som T-PMT har blitt kombinert med RFP laser (trinn 7.2.1) justere laser effekt for RFP vil påvirke T-PMT signal.</li>
		<li>Juster pinhole størrelse for å øke fluorescens deteksjon om nødvendig. Merk: Jo høyere pinhole størrelse, jo mer fluorescerende signal oppdages i Z-retning. En retningslinje for dette er den resulterende Airy Unit (AU), som automatisk angis under pinhole -indikatoren, der 1 au er optimal for bildekvalitet. Øke AU for mye vil svekke senere analyse fordi det blir vanskeligere å skille individuelle celler i Z-retning).</li>
		<li>Kontroller oppsettet for å sikre at de innspilte signalene ikke overlapper hverandre.<ol>
<li>Klikk på avmerkingsboksene i kanaler -fanen for å velge alle tre kanalene og trykk på snap -knappen i kategorien Anskaffelse .</li>
			<li>I det resulterende bildet ruller du mellom de viste kanalene ved å klikke på de blå-uthevede boksene over hver oppførte kanal i kategorien dimensjoner . se manuelt etter overlappingen mellom kanalene på skjermen. Hvis signalene overlapper hverandre (for eksempel hvis hver rød celle også er gul), går du tilbake til begynnelsen av trinn 7,3 og gjentar, og justerer parametrene for de overlappende kanalene til de kan skilles fra hverandre. Sørg for at for hver etikett (dvs. RFP, YFP, eller CFP), kan minst en klone være visualisere som inneholder bare én av etikettene.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Hent bilde.<ol>
<li>Velg kategorien anskaffelses modus for å angi bildekvalitet ved hjelp av rammestørrelse, hastighetog gjennomsnittlig tall verdier. Merk: de typiske innstillingene for disse eksperimentene er angitt i supplerende fil 1a. Redusere Zoom under skanneområdet overskrift innenfor oppkjøpet kategorien kan øke synsfeltet uten å endre tiden som kreves for bilde oppkjøpet.</li>
		<li>I kategorien Anskaffelse klikker du på kryss boksen Z-stabel under dimensjons anskaffelses overskriften. Åpne z-stabel -fanen for å angi intervallet mellom bilder i z-retningen til 2,5 μm.</li>
		<li>Hvis du vil angi de riktige plasseringene, velger du bare RFP/T-avdrag i kategorien kanaler og klikker Live for å visualisere de røde kloner med en synlig skisse av vevet. Angi første og siste sektor ved å klikke Sett først og Sett sist på tilsvarende skive, justere fokus ved hjelp av mikroskopet knotten.</li>
		<li>Klikk på kategorien flis skanning i kategorien Anskaffelse , og angi totalt antall brikker i de horisontale og vertikale retningene i de respektive boksene.</li>
		<li>For Image Capture, velger du alle de ønskede kanalene i kategorien kanaler , og klikk deretter på snap -knappen for å samle et enkelt bilde, eller Start Experiment knappen for å samle en Z stack/Tile Scan.</li>
	</ol></li>
	<li>Når bildet er anskaffet, klikker du på fil og deretter Lagre som og lagre bildet i en filtype som bevarer så mye informasjon om mikroskop innstillingene som mulig, for å tillate senere gjennomgang og gjenbruk.</li>
	<li>Utføre ytterligere analyser ved hjelp av bildeanalyse programvare.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li><li>Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ending+the+message:+poly(A)+signals+then+and+now.">Ending the message: poly(A) signals then and now.</a> Genes &amp; Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+The+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>F&#252;llgrabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Lgr6++Progenitor+Cells+in+the+Hair+Follicle,+Sebaceous+Gland,+and+Interfollicular+Epidermis.">Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).</li><li>Lazzeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocycle-related+tubular+cell+hypertrophy+and+progenitor+proliferation+recover+renal+function+after+acute+kidney+injury.">Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).</li><li>Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolour+lineage+tracing+reveals+clonal+dynamics+of+squamous+carcinoma+evolution+from+initiation+to+metastasis.">Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).</li><li>Yoo, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Castration-Resistant+Bmi1+Sox2++Cells+in+Driving+Recurrence+in+Prostate+Cancer.">The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).</li><li>McConnell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Regulates+Progenitor+Cell+Quiescence+and+Differentiation+in+the+Airway.">p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway.</a> Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+cells+are+self-renewing+chondrocyte+progenitors,+which+form+the+articular+cartilage+in+juvenile+mice.">Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice.</a> Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+radical+switch+in+clonality+reveals+a+stem+cell+niche+in+the+epiphyseal+growth+plate.">A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate.</a> Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, 25902 (2017).</li><li>Kozhemyakina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Prg4-expressing+articular+cartilage+progenitor+cell+population+in+mice.">Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice.</a> Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).</li><li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreERT+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton.">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li><li>Mizuhashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+zone+of+the+growth+plate+houses+a+unique+class+of+skeletal+stem+cells.">Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells.</a> Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).</li><li>Reinert, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen-Induced+Cre+loxP+Recombination+Is+Prolonged+in+Pancreatic+Islets+of+Adult+Mice.">Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice.</a> PloS One. 7 (3), 33529 (2012).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+response+of+primary+human+bone+marrow+stromal+cells+to+recombinant+human+bone+morphogenic+protein-2+in+the+early+and+late+stages+of+osteoblast+differentiation.">In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).</li><li>Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+In+Vivo+model+for+combinatorial+fluorescence+labeling+in+mouse+prostate.">Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate.</a> The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).</li><li>Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., S&#228;vendahl, L., Chagin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC1+in+chondrocytes+does+not+affect+proliferation+or+differentiation,+but+causes+the+resting+zone+of+the+growth+plate+to+become+disordered.">Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered.</a> Bone Reports. 8, 64-71 (2018).</li><li>Xie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+precursors+contribute+to+skeletal+formation+during+embryonic+development+in+mice+and+zebrafish.">Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Den konfetti modellen ble brukt mye for å studere mineralisert brusk vev12,13,14 og for å beskrive den optimaliserte protokollen. Konfetti mus2 med ett eksemplar eller to eksemplarer av R26R-konfetti allel kan brukes til avl og eksperimenter. Rekombinasjon i mus med en allel av Brainbow 2,1 konstruere vil gi fire mulige etiketter: rødt fluorescerende protein (RFP, cytoplasmatiske), gult fluorescerende protein (YFP, cytoplasmatiske), cyan fluorescerende protein (CFP, membran-lokaliserte), og grønn fluorescerende protein (GFP, Nucleus-lokaliserte), mens rekombinasjon i homozygote konfetti mus (dvs. inneholder to eksemplarer av Brainbow 2,1 konstruere) vil gi 10 mulige farge utganger (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + CFP, RFP + GFP, YFP + YFP, YFP + CFP, YFP + GFP, CFP + CFP, CFP + GFP, GFP + GFP). Men fordi DNA forbruker-og inversjon hendelser oppstår i en Stokastisk måte, rekombinasjon å produsere GFP oppstår i bare en liten brøkdel av celler, som tidligere rapportert2, og tilsynelatende avviker med celle-type eller grobunn linje brukt2, 12,13. Derfor, gitt den lave forekomsten av rekombinasjon hendelser som fører til GFP-uttrykket, er seks farge utganger de vanligste i homozygote konfetti-mus.
En viktig faktor når du planlegger eksperimenter med konfetti musen er å finne en passende grobunn. Først, siden konfetti allel har flere loxP nettsteder, en rekombinasjon hendelse utelukker ikke en andre4. Dette betyr at hvis en celle er merket og deler for å produsere en klone av en farge, en annen rekombinasjon hendelse i en av sine datter celler ville generere en annen farge, og dermed maskering den sanne klonal ekspansjon. Således, noninducible grobunn stammer, der enzymet er alltid aktiv hvis tilsvarende promoter er aktiv, er ikke tilrådelig. For det andre, i noen stammer uttrykket av grobunn recombinase ofte kommer på bekostning av en endogene protein, og dermed skape en fenotype av sine egne (f. eks, for Prg4-GFPCreERT2 knock-in musen belastning der mus havn to grobunn alleler15), så en enkelt kopi av grobunn allel er ønskelig. I alle de beskrevne forsøkene, en enkelt kopi av Col2CreERT16 ble båret av enten den mannlige eller kvinnelige forelder å generere Col2CreERT: konfetti mus, som beskrevet13. Deretter er det spesifisitet av grobunn linje til cellen type interesse en viktig faktor. For eksempel, Col2CreERT er chondrocyte-spesifikk, bortsett fra etiketter adskillige adskilt befolkninger av chondrocytes inne tidlig postnatal brusk17. Til slutt, aktiviteten av ulike grobunn stammer kan endre betraktelig med dyre alder, som den endogene aktiviteten til arrangøren benyttet for grobunn uttrykk endringer, selv i celler av samme type (f. eks Prg4-GFPCreERT2, som kan kreve en økende antall Tamoxifen doser for å merke overfladiske sone celler som mus alder15).
Antall merket celler vil bli reflektert av mengden av Tamoxifen gitt, så det er ikke alltid ønskelig å gi maksimal dose fordi skille kloner fra hverandre kan være vanskelig. Fordi grobunn uttrykket vil variere under regulering av ulike arrangører så vel som med alderen, den Tamoxifen dosering må justeres for å optimalisere merking. Det er viktig å merke seg at cellene ikke er umiddelbart fluorescerende ved utløser rekombinasjon fordi tiden er nødvendig for rekombinasjon å skje og de resulterende fluorescerende proteiner å akkumulere tilstrekkelig for Imaging. Et bredt spekter av timer (mellom 24-72 h) er nødvendig, noe som synes å være påvirket av grobunn linje, celle-type, og dyre alder. Siden Tamoxifen kan være biologisk aktive lenge etter administrering18 det er alltid tilrådelig å grundig sjekke rekombinasjon effektivitet i hver modell.
Under konfokalmikroskopi mikroskopi trinn, eksitasjon av konfetti fluorescerende proteiner krever inntrengning av vevet med laser lys. Fordi ulike vev har forskjellige egenskaper, laser lys kan ikke trenge 160 μm tykke deler av alle vev. Imidlertid kan slike tykke seksjoner brukes for vekst plate brusk, som brukes i figur 2, Figur 3. Merk at hvert mikroskop er forskjellig, og det er usannsynlig at de beskrevne innstillingene (supplerende fil 1) vil fungere perfekt uten mindre justeringer. En av de store utfordringene er å skille de ulike fluorescerende proteiner for å sikre at det ikke er forurensning fra en kanal til en annen. For eksempel signalet i YFP kanal forårsaket av fluorescens kommer fra GFP overlappinger mellom YFP og RFP kanaler. YFP og CFP-kanaler må også sjekkes nøye. Dette kan gjøres på flere måter. For det første kan utslippsområdet til lysbølgelengder som er registrert for hvert fluorescerende protein begrenses. For det andre kan justering av laser effekt i kombinasjon med den digitale forsterkningen optimalisere signalet. I denne studien var disse trinnene tilstrekkelige, men de er avhengige av et sterkt fluorescerende signal. Dette betyr at i teorien, ineffektiv vevs behandling kan redusere aktiviteten av fluorescerende proteiner, eller en svak laser lyskilde kan svekke kanal separasjon.
En av fordelene med konfetti musen er at den kan kombineres med et stort antall genetisk muterte stammer som er tilgjengelige slik at virkningen av spesifikke gener på klonal dynamikk kan bli studert10,11,12 ,13,14,19,20, riktignok med noen begrensninger. For eksempel kan rekombinasjon av konfetti alleler og genet av interesse ikke skilles ved bruk av grobunn loxP-baserte mutanter kombinert med klonal avstamning tracing. Likevel kan slike samtidig rekombinasjon hendelser være effektive10,14,20. For eksempel ble denne muligheten brukt til å utforske det økte celle tallet i hvile sonen til mus etter postnatal chondrocyte-spesifikke ablasjon av TSC1 i vekst platen21 og avslørte det klonal forholdet mellom disse cellene over tid 13. i tillegg kan den vevs spesifikke klonal analysen ved hjelp av konfetti mus brukes med ikke-grobunn loxP-baserte mutant mus11, og det er også mulig å kombinere disse tilnærmingene med farmakologisk8,9 ,13 og/eller kirurgiske modeller8 for å visualisere klonal reaksjoner på andre funksjonelle forstyrrelser. Ytterligere muligheter oppstår når kombinere konfetti merket seksjoner med immunodetection av endogene proteiner av immunofluorescence. Slik analyse tillater identifisering av spores celler og deres colocalization med en kjent markør. Med fiksering metoden beskrevet her, er det mulig å gjennomføre immunofluorescence og fortsatt visualisere fluorescens fra konfetti fluorescerende proteiner12,13. Men i avisene nevnt, antigen henting var ikke nødvendig. Harde antigen gjenfinning metoder, slik som koking i citrate buffer, fører til et fullstendig tap av konfetti fluorescens. Selv om konfetti fluorescerende proteiner kan oppdages ved å bruke antistoffer22, kan det oppstå tap av klonal identitet.
Oppsummert, ved hjelp av konfetti modellen for å merke celler in vivo er et informativt verktøy for å analysere skjebnen til disse cellene over tid. Den beskrevne metoden gir en rask og effektiv måte å direkte visualisere fluorescerende protein uttrykk i mineralisert vev.

Forbedrede metoder for å overvåke celle atferden er ønskelig å øke den eksperimentelle effektiviteten ved bruk av dyremodeller. Ettall av de fleste opplysende tilnærmelser å dataskjerm cellen opptreden inne Vivo er klonal avstamning tracing med flerfarget journalist musen belastninger1, inkluderer det vidt anvendt R26R-konfetti (konfetti) musen2. Ved genetisk merking individuelle celler med fluorescerende proteiner og følge disse cellene over tid, forskere i mange felt har brukt konfetti musen til å avdekke innsikt i en rekke ulike biologiske systemer.
Den konfetti musen er en loxP-basert reporter system der grobunn avhengig DNA rekombinasjon forårsaker den permanente uttrykk for en av flere mulige fluorescerende proteiner i et Stokastisk måte2. Den R26R-konfetti allel inkluderer overalt uttrykt CAGG arrangøren, som ligger umiddelbart oppstrøms av en loxP-flankert neoR-kassett2, hvis polyadenylation sekvensen opphører transkripsjon3, etterfulgt av Brainbow 2,1 konstruere4. Derfor, grobunn-mediert rekombinasjon samtidig avgifter neoR-kassett og fører til produksjon av visse fluorescerende proteiner avhengig av hvilke deler av Brainbow 2,1 konstruere er excised. Denne funksjonen gjør konfetti musen svært tilpasningsdyktig fordi den kan brukes til å målrette noen cellulære befolkningen i en mus som en bestemt grobunn er tilgjengelig. Krysset av en vev-spesifikk grobunn med R26R-konfetti belastningen gir spesifisitet av merking. Imidlertid bør grobunn også være induserbart (f. eks CreERT eller CreERT2, som krever Tamoxifen bindende å tillate dem å gå inn i kjernen og indusere DNA rekombinasjon5) slik at merking kan oppnås på angitte tidspunkt poeng. Således kan en cellulær befolkning merkes ved å injisere den resulterende CreERT-positive/konfetti-positive avkom med Tamoxifen på ønsket tidspunkt og spores til en viss alder, når vevet av interesse kan samles for analyse. Etter vevs behandling, kan fluorescensmerkete merket celler bli direkte visualisere av konfokalmikroskopi mikroskopi slik at avkom av hver først-merket celle kan skilles fra avkom generert av en annen merket celle basert på deres spesifikke fluorescerende og dermed tillate celleklonalitet å bli vurdert (dvs. klonal genetisk tracing).
På grunn av fleksibiliteten i konfetti modellen, har det vært brukt til å studere utvikling og vedlikehold av mange forskjellige vev i helse og sykdom2,6,7,8,9, 10,11. En vanlig måte å bruke modellen er å merke en viss befolkning av celler og bestemme hvilke vev de (og/eller deres avkom) har bidratt til. En slik oppdagelse ved hjelp av denne tilnærmingen var at den voksne tannen består av celler med en gliacellene opprinnelse6. En annen anvendelse av modellen er å studere stilk cellen homeostase. For eksempel avslørte konfetti modellen at Stamcelle nisjer i tarm Krypter gradvis blir monoklonale fordi noen Stamcelle kloner er dominerende under konkurransen mellom stamceller2. Modellen kan også brukes til å vurdere celle spredning, noe som er spesielt nyttig for å studere langsomt dele celler. For eksempel ble klonal formasjon i ledd brusk12 vurdert, og de kortsiktige virkningene av et pinnsvin som var motstander av vekst plate chondrocytes i fem uker gamle mus, ble studert13.
Til tross for den relative enkelhet av konfetti modellen, kan fluorescerende signalet være teknisk utfordrende å bevare til bilde samlingen, spesielt når analysere mineralisert vev. Her beskriver protokollen en optimalisert modell for å bruke konfetti musen med postnatal bein (opptil 6 måneders alder), slik at fluorescerende proteiner å være direkte visualisere av konfokalmikroskopi mikroskopi uten behov for immunodetection. Denne forenklede protokollen kan brukes på nonmineralized vev. Videre er inkludert en beskrivelse av hvordan du lagrer prøvene for å bevare fluorescerende signal i en lengre periode på minst 3 år. En skisse av protokollen er presentert i figur 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-thiodiethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCF9328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm-long cover slips</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>220588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold (standard)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Model: NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cryostat blades</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>207500014</td>
			<td>Specifically for use with hard tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Scharlan</td>
			<td>AC0960005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde concentrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18708.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V7130</td>
			<td>Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software for 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>11-8162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>102094-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06498.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost UltraPlus slides</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware for Confocal laser scanning microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues

Merking en individuell celle i kroppen til å overvåke hvilke celletyper det kan gi opphav til og spore sin migrasjon gjennom organismen eller bestemme levetid kan være en effektiv måte å avdekke mekanismer for vev utvikling og vedlikehold. En av de viktigste verktøyene som er tilgjengelige for å overvåke celler in vivo er konfetti musemodell. Den konfetti modellen kan brukes til genetisk Label individuelle celler i levende mus med ulike fluorescerende proteiner i en celle type-spesifikk måte og overvåke deres skjebne, samt skjebnen til deres avkom over tid, i en prosess som kalles klonal genetisk tracing eller klonal avstamning tracing. Denne modellen ble generert nesten et ti år siden og har bidratt til en bedre forståelse av mange biologiske prosesser, særlig knyttet til stilk cellen biologi, utvikling, og fornyelse av voksen vev. Imidlertid, bevarer det fluorescerende signal til image innsamling av og samtidig fanger av forskjellige fluorescerende signaler er teknisk utfordrende, spesielt for mineralisert tissue. Denne publikasjonen beskriver en trinnvis protokoll for bruk av konfetti-modellen til å analysere vekst plate brusk som kan brukes på alle mineralisert eller nonmineralized vev.

Å merke chondrocytes i epifysal brusk og visualisere deres klonal ekspansjon med alderen bruker Tamoxifen administrasjon på P1, Col2CreERT: konfetti mus ble merket, og deres hind-lemmer ble samlet på P27. Den sentrale delen ble bestemt ved å visualisere cruciate leddbånd (figur 2a) og kloner i den proksimale tibial vekst platen ble visualisere (figur 2b). Disse dataene viser at individuelle celler som var Kol2-positive på P1 og ble merket med konfetti fluorescerende proteiner når Tamoxifen ble administrert, gjennomgikk klonal ekspansjon, og deretter forble i vekst platen til P27. De første endringene i klonal ekspansjon fra et lignende utviklings tidspunkt kan sees i figur 1 av en nylig publikasjon13.
For å gi et eksempel på fluorescerende signal etter langtidslagring (trinn 5,5), ble den innsamlede delen lagret umiddelbart etter (se figur 2A, B) i mer enn 3 år før den ble klargjort og avbildet (figur 2C, Video 1) .
For å demonstrere noen vanlige problemer med protokollen, vises en del som er brutt under det kryosnitt trinnet, i figur 3a. Regionen i seksjonen (mellom vekst platen og ledd brusk) utvidet i figur 3b viser at denne dosen av Tamoxifen fører til et så høyt nivå av rekombinasjon i dette området at det ville utelukke klonal analyse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig01.jpg"> Figur 1: eksperimentell oversikt. Flow diagram som oppsummerer de viktigste stadiene av metoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig02.jpg"> Figur 2: konfetti bilder fra en Col2CreERT: konfetti-mus. (A) prøver av Col2CreERT: konfetti mus ble behandlet uten Avkalking eller langtidslagring trinn. Den sentrale delen ble plassert ved hjelp av cruciate leddbånd som en markør. Dette bildet ble avbildet ved hjelp av en flis skanning etter å oppdage RFP med T-PMT (Scale bar = 300 μm). (B) klonal kolonner vises i proksimale Tibia av veksten plate synlig i (A), etter 3D rekonstruksjon. (C) et tilstøtende lysbilde som vises i (A) og (B) holdt i langtidslagring i mer enn 3 år ble behandlet for bildebehandling og 3D-rekonstruksjon. RFP, YFP og CFP vises i (B) og (C) (skala bars = 50 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig03.jpg"> Figur 3: utfordringer ved bruk av metoden. (A) de hvite stiplede linjene skisserer en splitt i seksjonen gjennom vekst platen til Col2CreERT: konfetti mus (Scale bar = 50 μm). Området innenfor den hvite boksen er vist i (B) (Scale bar = 25 μm). RFP, YFP, og CFP er vist i begge panelene, og nonreflected laser lys (T-PMT) kanal er også vist i (A) for å visualisere vevet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Video 1: tredimensjonal rekonstruksjon av en vekst plate fra Col2CreERT: konfetti mus. Et lysbilde fremstilt av en Col2CreERT: konfetti mus ble holdt i langtidslagring etter snitting i mer enn 3 år, og deretter behandlet for bildebehandling. Tredimensjonal rekonstruksjon ble utført automatisk med bildeanalyse programvare og eksporteres som en video. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/video_1.mov" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Tilleggsfil 1: typisk oppsett av det konfokalmikroskopi mikroskopet. (A) de viktigste kontrollene som finnes i kategorien Anskaffelse . (B−D) laser parametrene, eksitasjon bølgelengde, og rekkevidden av innspilte utslipps bølgelengder vises for tre konfetti fluorescerende proteiner. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424supfig01.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues at JoVE.com

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Denne metoden beskriver bruken av R26R-konfetti (konfetti) musemodell for å studere mineralisert vev, som dekker alle trinn fra avl strategien til bildet oppnåelser. Inkludert er en generell protokoll som kan brukes på alle myke vev og en modifisert protokoll som kan brukes på mineralisert vev.

Klonal genetisk tracing bruke konfetti musen til å studere Mineralisert vev

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Ved å genetisk merke individuelle celler med fluorescerende proteiner og følge disse cellene over tid, har Confetti Mouse tillatt forskere å avsløre ny innsikt i mange biologiske prosesser. Vår protokoll minimerer forsinkelsestid mellom vevsinnsamling og bildebehandling, kan brukes på ethvert mineralisert eller ikke-mineralisert vev og bevarer fluorescens i flere år. Denne metoden er svært nyttig for alle områder av regenerativ medisin og utviklingsbiologi fordi den kan brukes på forskjellige cellulære populasjoner for å studere deres skjebne og deres kinetikk så lenge en passende Cre-linje er tilgjengelig.Våre trinnvise instruksjoner vil demonstrere det mest utfordrende skrittet for å skille forskjell på fluorescerende signaler som slippes ut av forskjellige fluorescerende proteiner. Begynn med å forberede musevevet for avbildning. For bløtvev og mineralisert tibiae og femora fra mus opp til 45 dager gammel, fikse vevet i precooled 3,7% formaldehyd PBS og inkubere det ved 4 grader Celsius i seks timer mens du ruller forsiktig på en rotator.For mineraliserte vev som tibiae og femora fra mus over 45 dager, lag en liter 10% EDTA-løsning med pH justert til 8,05 med natriumhydroksid og fortynne formaldehyd til 3,7% ved hjelp av denne løsningen. Fest vevet ved å holde det i 3,7% formaldehyd PBS over natten ved 4 grader Celsius. På neste dag, plasser den i den forkjølte formaldehyd EDTA-løsningen og inkuber den ved 4 grader Celsius mens du roterer i 48 timer, og sørg for å erstatte løsningen tre ganger under inkubasjonen.Plasser deretter vevet i forkjølet 30% sukrose, sørg for å fylle beholderen til randen, og roter den forsiktig over natten ved fire grader Celsius. Om morgenen, bruk tang for å fjerne vevet fra sukroseløsningen og skyll det i fem milliliter med optimal skjæretemperaturforbindelse, eller OCT, i noen sekunder. Fyll en forhåndsmerket kryomold med OCT og plasser vevet nederst, og arbeid raskt for å unngå prøvens sitte ved romtemperatur for lenge.Bygg inn prøven ved å plassere formen på tørris og vente på at OCT skal stivne. Hvis prøvene ikke brukes umiddelbart, kan de lagres ved minus 20 grader Celsius. Fjern blokken fra formen.Påfør OCT mellom toppen av blokken og chucken og avkjøl den i kryostaten i minst fem minutter eller til OCT stivner helt. Forkoler prøveholderen og bladholderen til minus 20 grader Celsius, plasser deretter prøven i chuckholderen og bladet i bladholderen, og la dem likevekte i flere minutter. For postnatal vekstplateanalyse, klargjør seksjoner som er 30 til 160 mikrometer.Bruk kryostaten til å trimme blokken og kutte vevsseksjoner til en passende tykkelse og samle dem på lysbilder. Deretter tørker luften lysbildene ved romtemperatur til de er helt tørre og lagrer dem på minus 20 grader Celsius i opptil 36 måneder. Når du er klar til å bruke lysbildet, fjerner du det fra fryseren og bringer den til romtemperatur i en glideholder.For å fjerne OCT, påfør forsiktig PBS på lysbildet med Pasteur pipetten. I 160 mikrometer tykke seksjoner, inkuber lysbildet i 15 minutter, fjern væsken og påfør fersk PBS i fem minutter til. Monter lysbildene i en løsning på 75% tiodietanol ved romtemperatur med 60 millimeter lange dekselslipp.Først velger du RFP-kanalen ved å klikke på den i kanalfanen, noe som fører til at detaljene for kanalen vises i lysbanefanen. Klikk deretter på avmerkingsboksen ved siden av T-PMT. Plasser lysbildet i glideholderen og plasser vevet av interesse direkte mellom lysbanen og objektivobjektivet.Hvis du vil lokalisere vevet, fjerner du merket for YFP- og CFP-boksene under sporoverskriften til kanalfanen. Velg T-PMT-kanalen i sporoverskriften, klikk deretter live i kategorien anskaffelse og øk gevinsten for T-PMT-kanalen for å visualisere vevsvalget på skjermen. Juster plasseringen av lysbildet for å finne interesseområdet og fokuser ved hjelp av riktig mikroskopknapp.Klikk deretter stopp i oppkjøpsfanen for å slå av lasereksponeringen. Definer bildeparametere i henhold til manuskriptinstruksjoner og juster pinholestørrelsen om nødvendig. Kontroller oppsettet for å sikre at de innspilte signalene ikke overlapper hverandre, velg deretter alle tre kanalene i kanalfanen og trykk på snap-knappen.Bla mellom visningskanalene i det resulterende bildet ved å klikke på de blå uthevede boksene over hver kanal i dimensjonsfanen og se etter overlapping mellom kanalene på skjermen manuelt. Hvis signalene overlapper hverandre, justerer du parametrene på nytt til de kan skilles fra hverandre. Denne protokollen ble brukt til å merke kondrocytter i epifyseal brusk og visualisere deres kloniske ekspansjon med alderen.Den sentrale delen ble bestemt ved å visualisere korsbåndet og klonene i den proksimale tibiale vekstplaten ble avbildet. Individuelle celler som var Col2 positive og ble merket med Konfetti fluorescerende proteiner ved tamoxifen administrasjon, gjennomgikk klonisk ekspansjon og deretter forble i vekstplaten. Det fluorescerende signalet kan visualiseres etter langvarig lagring.Noen seksjoner ble lagret i over tre år før forberedelse og bildebehandling. Tredimensjonal rekonstruksjon ble automatisk utført med bildeanalyseprogramvare og eksportert som en video. En seksjon som brytes under kryoseksjonstrinnet inneholder et område med et så høyt rekombinasjonsnivå at det ville forhindre kloneringsanalyse, noe som viser et av de vanlige problemene som oppstår med denne protokollen.Avhengig av forskningsspørsmålet ditt, kan det være svært viktig å bruke en Cre-linje som spesifikt merker cellene dine av interesse. Derfor anbefaler vi å sjekke fluorescens i disse cellene kort tid etter rekombinasjon. Bruk av indukne Cre linjer er viktig fordi pågående DNA rekombinasjon i ikke-induserende Cre linjer kan endre fluorescerende profilen til de solutede cellene og dermed utelukke kloniske analyse.Denne protokollen kan kombineres med funksjonelle perturbasjoner som genetisk manipulerte stammer, farmakologiske behandlinger, kirurgiske inngrep, samt immunfluorescensfarging av forberedte seksjoner.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Bruke Confocal Analyse av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; For å undersøke modulatorer av Wnt og Shh Morphogen Gradienter

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

En metode for Lineage Sporing av Korneale Cells Bruke Multi-farge Fluorescent Reporter Mus

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Samtidig Vurdering av kardiomyocytt DNA syntese og ploidiundersøkelse: En metode for å hjelpe Kvantifisering av kardiomyocytt Regeneration og Omsetning

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Kombinerer Intravital fluorescerende mikroskopi (IVFM) med genetisk modeller å studere Engraftment dynamikken i blodkreft cellene benmarg nisjer

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Veksten av musen Preantral follikler Under simulert mikrogravitasjon

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetisk engineering av primær mus intestinal Organoids bruke magnetisk Nanopartikkel Transduction viral vektorer for frossen snitting

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metoden å studere utviklingen av embryonale kylling vev

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genuttrykk gjennom påvisning av β-galactosidase aktivitet i hele Mouse embryoer

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

En In Vitro -modell av en parallell-Plate perfusjon System å studere bakteriell tilslutning å pode vev

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

En i Vivo -metode for å studere musen blod-testikkel barriere integritet

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...