Name: clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues
Uploaded: 2019-10-23T14:30:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues at JoVE.com

Благодарим доктора Евгения Ивашкина за методологическую консультацию. Финансовую поддержку этой работе оказали Шведский научно-исследовательский совет (A.S.C.), Российский научный фонд (грант #19-15-00241 аСК), Каролинский институт (A.S.C.), StratRegen KI и Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-sfond (A.S.C.), Stiftelsen Фримурар Барнхусет и Сальскакет Барнавард (P.T.N.), Китайский совет стипендий (B.). Конфокальный микроскоп финансировался Фондом Кнута и Элис Валленберг.

<ol>
	<li>Weissman, T. A., Pan, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainbow:+New+resources+and+emerging+biological+applications+for+multicolor+genetic+labeling+and+analysis.">Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis.</a> Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143 (1), 134-144 (2010).</li><li>Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ending+the+message:+poly(A)+signals+then+and+now.">Ending the message: poly(A) signals then and now.</a> Genes &amp; Development. 25 (17), 1770-1782 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+The+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).</li><li>Kaukua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+origin+of+mesenchymal+stem+cells+in+a+tooth+model+system.">Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system.</a> Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).</li><li>F&#252;llgrabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Lgr6++Progenitor+Cells+in+the+Hair+Follicle,+Sebaceous+Gland,+and+Interfollicular+Epidermis.">Dynamics of Lgr6+ Progenitor Cells in the Hair Follicle, Sebaceous Gland, and Interfollicular Epidermis.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 843-855 (2015).</li><li>Lazzeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocycle-related+tubular+cell+hypertrophy+and+progenitor+proliferation+recover+renal+function+after+acute+kidney+injury.">Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).</li><li>Reeves, M. Q., Kandyba, E., Harris, S., Del Rosario, R., Balmain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolour+lineage+tracing+reveals+clonal+dynamics+of+squamous+carcinoma+evolution+from+initiation+to+metastasis.">Multicolour lineage tracing reveals clonal dynamics of squamous carcinoma evolution from initiation to metastasis.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 699-709 (2018).</li><li>Yoo, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Castration-Resistant+Bmi1+Sox2++Cells+in+Driving+Recurrence+in+Prostate+Cancer.">The Role of Castration-Resistant Bmi1+Sox2+ Cells in Driving Recurrence in Prostate Cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 111 (3), 311-321 (2018).</li><li>McConnell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Regulates+Progenitor+Cell+Quiescence+and+Differentiation+in+the+Airway.">p53 Regulates Progenitor Cell Quiescence and Differentiation in the Airway.</a> Cell Reports. 17 (9), 2173-2182 (2016).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficial+cells+are+self-renewing+chondrocyte+progenitors,+which+form+the+articular+cartilage+in+juvenile+mice.">Superficial cells are self-renewing chondrocyte progenitors, which form the articular cartilage in juvenile mice.</a> Faseb Journal. 31 (3), 1067-1084 (2017).</li><li>Newton, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+radical+switch+in+clonality+reveals+a+stem+cell+niche+in+the+epiphyseal+growth+plate.">A radical switch in clonality reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plate.</a> Nature. 567 (7747), 234-238 (2019).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, 25902 (2017).</li><li>Kozhemyakina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Prg4-expressing+articular+cartilage+progenitor+cell+population+in+mice.">Identification of a Prg4-expressing articular cartilage progenitor cell population in mice.</a> Arthritis Rheumatology. 67 (5), 1261-1273 (2015).</li><li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreERT+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton.">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreERT to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Developmental Dynamics. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li><li>Mizuhashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+zone+of+the+growth+plate+houses+a+unique+class+of+skeletal+stem+cells.">Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells.</a> Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).</li><li>Reinert, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tamoxifen-Induced+Cre+loxP+Recombination+Is+Prolonged+in+Pancreatic+Islets+of+Adult+Mice.">Tamoxifen-Induced Cre loxP Recombination Is Prolonged in Pancreatic Islets of Adult Mice.</a> PloS One. 7 (3), 33529 (2012).</li><li>Kim, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+response+of+primary+human+bone+marrow+stromal+cells+to+recombinant+human+bone+morphogenic+protein-2+in+the+early+and+late+stages+of+osteoblast+differentiation.">In vitro response of primary human bone marrow stromal cells to recombinant human bone morphogenic protein-2 in the early and late stages of osteoblast differentiation.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 50 (7), 553-564 (2008).</li><li>Fang, X., Gyabaah, K., Nickkholgh, B., Cline, J. M., Balaji, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+In+Vivo+model+for+combinatorial+fluorescence+labeling+in+mouse+prostate.">Novel In Vivo model for combinatorial fluorescence labeling in mouse prostate.</a> The Prostate. 75 (9), 988-1000 (2015).</li><li>Newton, P. T., Xie, M., Medvedeva, E. V., S&#228;vendahl, L., Chagin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+mTORC1+in+chondrocytes+does+not+affect+proliferation+or+differentiation,+but+causes+the+resting+zone+of+the+growth+plate+to+become+disordered.">Activation of mTORC1 in chondrocytes does not affect proliferation or differentiation, but causes the resting zone of the growth plate to become disordered.</a> Bone Reports. 8, 64-71 (2018).</li><li>Xie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+precursors+contribute+to+skeletal+formation+during+embryonic+development+in+mice+and+zebrafish.">Schwann cell precursors contribute to skeletal formation during embryonic development in mice and zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (30), 15068-15073 (2019).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Модель Confetti широко использовалась для изучения минерализованных тканей хряща12,13,14 и для описания оптимизированного протокола. Конфетти мышей2 с одной копией или двумя копиями аллеля R26R-Confetti могут быть использованы для разведения и экспериментов. Рекомбинация у мышей с одним аллелем конструкции Brainbow 2.1 даст четыре потенциальных метки: красный флуоресцентный белок (RFP, цитоплазматический), желтый флуоресцентный белок (YFP, цитоплазмический), циановый флуоресцентный белок (CFP, мембранно-локализованный) и зеленый зеленый флуоресцентный белок (GFP, ядро-локализованный), в то время как рекомбинация у гомозиготных мышей Confetti (т.е. содержащие две копии конструкции Brainbow 2.1) даст 10 возможных цветовых выходов (RFP-RFP, RFP-YFP, RFP-CFP, RFP-FFP, RFP-FFP, RFP-FFP, RFP-YFP GFP, CFP-CFP, CFP-GFP, GFP-GFP). Однако, поскольку иссечение ДНК и инверсии события происходят в стохастической образом, рекомбинации для производства GFP происходит только в небольшой части клеток, как сообщалось ранее2, и, казалось бы, отличается по типу клеток или Cre линии используется2, 12,13. Таким образом, учитывая низкий уровень рекомбинации событий, ведущих к выражению GFP, шесть цветовых выходов являются наиболее распространенными в гомозиготных мышей Confetti.
Важным соображением при планировании экспериментов с мышью Confetti является поиск подходящего штамма Cre. Во-первых, так как аллель Confetti имеет несколько сайтов loxP, одно событие рекомбинации не исключает второго4. Это означает, что если ячейка помечена и делится, чтобы произвести клон одного цвета, второе событие рекомбинации в одной из дочерних ячеек будет генерировать другой цвет, тем самым маскируя истинное клональное расширение. Таким образом, невызывающиеся штаммы Cre, где фермент всегда активен, если соответствующий промоутер активен, не рекомендуется. Во-вторых, в некоторых штаммов выражение Cre рекомбиназы часто приходит за счет эндогенного белка, тем самым создавая собственный фенотип (например, для Prg4-GFPCreERT2 стук-в мыши штамм, в котором мыши гавани два Cre аллелей15), так что одна копия Аллеля Cre желательно. Во всех описанных экспериментах, одна копия Col2CreERT16 была проведена либо мужчины или женщины родителей для создания Col2CreERT: Confetti мышей, как описано13. Далее, специфичность Cre линии к типу ячейки интерес является важным фактором. Например, Col2CreERT является хондроцитов конкретных, но этикетки несколько различных популяций хондроцитов в начале послеродового хряща17. Наконец, активность различных штаммов Cre может значительно измениться с возрастом животного, так как эндогенная активность промоутера используется для Cre изменения выражения, даже в клетках того же типа (например, Prg4-GFPCreERT2, которые могут потребовать увеличения количество дозах тамоксифена для обозначения поверхностных клеток зоны, как мыши в возрасте15).
Количество помеченных клеток будет отражаться количеством данного тамоксифена, поэтому не всегда желательно давать максимальную дозу, так как отличить клонов друг от друга может быть сложно. Потому что Cre выражение будет меняться в соответствии с регулированием различных промоутеров, а также с возрастом, тамоксифен дозировка должна быть скорректирована для оптимизации маркировки. Важно отметить, что клетки не сразу флуоресцентные при запуске рекомбинации, потому что время требуется для рекомбинации происходит и в результате флуоресцентные белки накапливаться достаточно для визуализации. Требуется широкий диапазон часов (между 24–72 ч), что, по-видимому, зависит от линии Кре, типа клеток и возраста животных. Так как тамоксифен может быть биологически активным долго после введения18 всегда целесообразно тщательно проверить эффективность рекомбинации в каждой модели.
Во время шага конфокальной микроскопии возбуждение флуоресцентных белков Confetti требует проникновения в ткани лазерным светом. Поскольку различные ткани имеют различные свойства, лазерный свет не может проникать 160 мкм толщиной разделов всех тканей. Тем не менее, такие толстые секции могут быть использованы для роста пластины хряща, как это используется на рисунке 2, Рисунок 3. Обратите внимание, что каждый микроскоп отличается, и маловероятно, что описанные настройки(Дополнительный файл 1) будет работать идеально без незначительных корректировок. Одна из основных проблем заключается в том, чтобы различать различные флуоресцентные белки, чтобы убедиться, что нет загрязнения от одного канала к другому. Например, сигнал в канале YFP, вызванный флуоресценцией, поступающей от GFP, перекрывается между каналами YFP и RFP. Каналы YFP и CFP также должны быть тщательно проверены. Это можно сделать несколькими способами. Во-первых, диапазон выбросов люминесцентных длин световых волн, которые регистрируются для каждого флуоресцентного белка, может быть сужен. Во-вторых, регулировка мощности лазера в сочетании с цифровым усилением может оптимизировать сигнал. В этом исследовании этих шагов было достаточно, но они полагаются на сильный флуоресцентный сигнал. Это означает, что в теории, неэффективная обработка тканей может снизить активность флуоресцентных белков, или слабый лазерный источник света может ухудшить разделение канала.
Одним из преимуществ мыши Confetti является то, что она может быть объединена с большим количеством генетически мутантных штаммов, которые доступны так, что влияние конкретных генов на клональную динамику можно изучить10,11,12 ,13,14,19,20, хотя и с некоторыми ограничениями. Например, рекомбинация аллелей Confetti и гена интереса не могут быть разделены при использовании Cre loxP основе мутантов в сочетании с клональной линии отслеживания. Тем не менее, такие совпадающие события рекомбинации могут бытьэффективными 10,14,20. Например, эта возможность была использована для изучения увеличения числа клеток в зоне покоя мышей после послеродовой хондроцитов конкретных абляции TSC1 в рост пластины21 и показал клональные отношения между этими клетками с течением времени 13. Кроме того, ткани конкретных клональный анализ с использованием Confetti мышей могут быть использованы с не-Cre loxP основе мутантов мышей11, и это также можно объединить эти подходы с фармакологическим8,9 ,13 и/или хирургические модели8 для визуализации клональных реакций на другие функциональные возмущения. Дополнительные возможности возникают при объединении конфетти помеченных разделов с иммунодиагностикой эндогенных белков иммунофлуоресценцией. Такой анализ позволяет выявить прослеженный клетки и их колокализацию с помощью известного маркера. С помощью метода фиксации, описанного в настоящем, можно проводить иммунофлуоресценцию и при этом визуализировать флуоресценцию из флуоресцентных белков Confetti12,13. Однако, в упомянутых документах, поиск антигена не требуется. Суровые методы извлечения антигенов, такие как кипячение в цитратном буфере, приводят к полной потере флуоресценции Confetti. Хотя Confetti флуоресцентные белки могут быть обнаружены с помощью антител22, потеря клональной идентичности может произойти.
Таким образом, использование модели Confetti для обозначения клеток in vivo является информативным инструментом для анализа судьбы этих клеток с течением времени. Описанный метод обеспечивает быстрый и эффективный способ непосредственнов визуализации флуоресцентного белка экспрессии в минерализованных тканях.

Улучшенные методы мониторинга поведения клеток желательно повысить экспериментальную эффективность при использовании моделей животных. Один из самых информативных подходов для мониторинга поведения клеток in vivo является клональная линия трассировки с многоцветной репортёр мыши штаммов1, в том числе широко используется R26R-Confetti (Confetti) мышь2. По генетически маркировки отдельных клеток с флуоресцентными белками и после этих клеток с течением времени, исследователи во многих областях использовали мышь Confetti, чтобы выявить понимание множества различных биологических систем.
Мышь Confetti является loxP-системы репортера, в котором Cre зависимых рекомбинации ДНК вызывает постоянное выражение одного из нескольких возможных флуоресцентных белков в стохастической образом2. R26R-Confetti аллель включает в себя повсеместно выраженный промоутер CAGG, который лежит сразу вверх по течению loxP-фланговые NeoR-кассета2, чья последовательность полиаденилации прекращает транскрипции3, а затем Brainbow 2.1 построить4. Таким образом, Cre-опосредованноерекомбинации одновременно акцизы Neo R-кассета и приводит к производству определенных флуоресцентных белков в зависимости от того, какие части Brainbow 2.1 конструкции вырезаны. Эта функция делает мышь Confetti чрезвычайно адаптируемой, потому что она может быть использована для целевой любой клеточной популяции в мыши, для которой имеется определенный штамм Cre. Пересечение ткани конкретных Cre штамм с R26R-Confetti штамм обеспечивает специфику маркировки. Тем не менее, штамм Cre также должен быть индуцированным (например, CreERT или CreERT2, которые требуют связывания тамоксифена, чтобы позволить им войти в ядро и вызвать рекомбинацию ДНК5),так что маркировка может быть достигнута в указанные моменты времени. Таким образом, клеточная популяция может быть помечена путем введения резвенного CreERT-позитивного/Confetti-положительного потомства с тамоксифеном в нужную точку времени и отследить до определенного возраста, когда ткани интереса могут быть собраны для анализа. После обработки тканей, флуоресцентно помеченные клетки могут быть непосредственно визуализированы конфокальной микроскопией, так что потомство каждой первоначально маркированной клетки могут быть отделены от потомства, генерируемого любой другой помеченной клеткой на основе их специфических флуоресцентных этикетки, тем самым позволяющие оценивать клональность (т.е. клональную генетическую трассировку).
Благодаря гибкости модели Confetti, он был применен для изучения развития и поддержания многих различных тканей в области здоровья и болезней2,6,7,8,9, 10,11. Один из распространенных способов использования модели заключается в маркировке определенной популяции клеток и определении того, какие ткани они (и/или их потомство) внесли свой вклад. Одним из таких выводов с помощью этого подхода было то, что взрослый зуб состоит из клеток с глиальным происхождением6. Еще одно применение модели является изучение гомеостаза стволовых клеток. Например, модель Confetti показала, что ниши стволовых клеток в кишечных склепов постепенно становятся моноклональными, потому что некоторые клоны стволовых клеток доминируют во время конкуренции между стволовыми клетками2. Модель также может быть использована для оценки пролиферации клеток, что особенно полезно для изучения медленно деления клеток. Например, было оценено клональное образование в суставном хряще12, а кратковременные эффекты антагониста ежа на рост плиты хондроцитов у пятинедельных мышей изучали13.
Несмотря на относительную простоту модели Confetti, флуоресцентный сигнал может быть технически сложным для сохранения до сбора изображений, особенно при анализе минерализованных тканей. Здесь протокол описывает оптимизированную модель для использования мыши Confetti с послеродовой костью (до 6 месяцев), что позволяет флуоресцентным белкам быть непосредственно визуализированы конфокальной микроскопией без необходимости иммунообнаружения. Этот упрощенный протокол может быть применен к неминерализованным тканям. Кроме того, включено описание того, как хранить образцы для сохранения флуоресцентного сигнала в течение длительного периода не менее 3 лет. Набросок протокола представлен на рисунке 1.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2-thiodiethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCF9328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm-long cover slips</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>220588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold (standard)</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Model: NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cryostat blades</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>207500014</td>
			<td>Specifically for use with hard tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Scharlan</td>
			<td>AC0960005P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde concentrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.18708.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V7130</td>
			<td>Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image analysis software for 3D reconstruction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>11-8162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>102094-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06498.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost UltraPlus slides</td>
			<td>Mendel-Gl&#228;zer</td>
			<td>J3800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen2 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Freeware for Confocal laser scanning microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

clonal genetic tracing using the confetti mouse to study mineralized tissues

Маркировка отдельных клеток в организме, чтобы контролировать, какие типы клеток это может привести к и отслеживать его миграцию через организм или определить его долговечность может быть мощным способом выявления механизмов развития и поддержания тканей. Одним из наиболее важных инструментов, доступных в настоящее время для мониторинга клеток in vivo, является модель мыши Confetti. Модель Confetti может быть использована для генетически маркировки отдельных клеток у живых мышей с различными флуоресцентными белками в клеточном типе-специфического образом и контролировать их судьбу, а также судьбу их потомства с течением времени, в процессе, называемом клональным генетическим отслеживанием или клональная линия отслеживания. Эта модель была создана почти десять лет назад и способствовала более глубокому пониманию многих биологических процессов, в частности связанных с биологией стволовых клеток, развитием и обновлением тканей взрослых. Однако сохранение флуоресцентного сигнала до сбора изображений и одновременного захвата различных флуоресцентных сигналов является технически сложной задачей, особенно для минерализованной ткани. Эта публикация описывает пошаговой протокол для использования модели Confetti для анализа роста пластины хряща, которые могут быть применены к любой минерализованной или неминерализованной ткани.

Для обозначения хондроцитов в эпификациальном хрящеи и визуализации их клонального расширения с возрастом с помощью тамоксифена администрации на P1, Col2CreERT:Confetti мышей были помечены, и их задние конечности были собраны на P27. Центральный раздел был определен путем визуализации крестообразной связки(Рисунок 2A) и клоны в проксимальной пластины роста косых были визуализированы(рисунок 2B). Эти данные показывают, что отдельные клетки, которые были Col2-положительный на P1 и стал помечены Confetti флуоресцентных белков, когда тамоксифен был введен, прошли клональной расширения, а затем остался в рост пластины до P27. Первоначальные изменения в клональном расширении от аналогичной точки времени развития можно увидеть на рисунке 1 недавней публикации13.
Чтобы привести пример флуоресцентного сигнала после длительного хранения (шаг 5.5), собранный раздел хранился сразу после (см. Рисунок 2A,B) в течение более 3 лет, прежде чем он был подготовлен и изображен(Рисунок 2C, Видео 1) .
Чтобы продемонстрировать некоторые общие проблемы с протоколом, раздел, сломанный во время криосекционного шага, показан на рисунке 3A. Область секции (между пластиной роста и суставным хрящом), расширенная на рисунке 3B, показывает, что эта доза тамоксифена приводит к такому высокому уровню рекомбинации в этой области, что это исключило бы анализ клона.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig01.jpg"> Рисунок 1: Экспериментальный обзор. Диаграмма потока, обобщающая ключевые этапы метода. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig02.jpg"> Рисунок 2: Конфетти изображения из Col2CreERT: Confetti мыши. (A) Образцы Col2CreERT:Confetti мышей были обработаны без декальцинации или долгосрочного шага хранения. Центральная секция была расположена с использованием крестообразной связки в качестве маркера. Это изображение было визуализировано с помощью сканирования плитки после обнаружения RFP с помощью T-PMT (шкала бар 300 мкм). (B) Клональные колонны показаны в проксимальной тибии пластины роста видны в (A), после 3D реконструкции. (C) Смежный слайд, который показан в (A) и (B) провел в долгосрочном хранении в течение более 3 лет был обработан для визуализации и 3D-реконструкции. RFP, YFP и CFP отображаются в (B) и (C) (Шкала баров 50 мкм). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60424/60424fig03.jpg"> Рисунок 3: Проблемы при использовании метода. (A) Белые линии пунктирной наметить раскол в разделе через рост пластины Col2CreERT: Confetti мышей (шкала бар 50 мкм). Область в белом поле отображается в (B) (Шкала бар 25 мкм). RFP, YFP и CFP показаны в обеих панелях, а неотраженный лазерный свет (T-PMT) также показан в(A) для визуализации ткани. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Видео 1: Трехмерная реконструкция пластины роста от Col2CreERT: Мышь Confetti. Слайд, приготовленный из col2CreERT: Confetti мыши был проведен в долгосрочном хранении после секции в течение более 3 лет, а затем обрабатываются для визуализации. Трехмерная реконструкция проводилась автоматически с помощью программного обеспечения для анализа изображений и экспортировалась в виде видео. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/video_1.mov" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.</a>
Дополнительный файл 1: Типичная настройка конфокального микроскопа. ()Основные элементы управления, присутствующие в вкладке Приобретение. (BиD) Лазерные параметры, волнообразное возбуждение длины волны, и диапазон записанных длин волн выбросов показаны для трех люминесцентных белков Confetti. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60424/60424supfig01.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues at JoVE.com

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Этот метод описывает использование модели мыши R26R-Confetti (Confetti) для изучения минерализованных тканей, охватывающих все этапы от стратегии размножения до приобретения изображения. Включен общий протокол, который может быть применен ко всем мягким тканям и измененный протокол, который может быть применен к минерализованным тканям.

Клональная генетическая трассировка с помощью мыши Confetti для изучения минерализованных тканей

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Генетически маркировки отдельных клеток с флуоресцентными белками и после этих клеток с течением времени, Конфетти мышь позволила исследователям выявить новые идеи во многих биологических процессов. Наш протокол сводит к минимуму время задержки между сбором тканей и визуализацией, может применяться к любой минерализованной или неминерализации тканей и сохраняет флуоресценцию в течение нескольких лет. Этот метод очень полезен для всех областей регенеративной медицины и биологии развития, потому что он может быть применен к различным клеточным популяциям для изучения их судьбы и их кинетики до тех пор, пока доступна подходящая линия Cre.Наши пошаговые инструкции продемонстрируют самый сложный шаг, чтобы различать разницу флуоресцентных сигналов, испускаемых различными флуоресцентными белками. Начните с подготовки ткани мыши для визуализации. Для мягких тканей и минерализованных tibiae и бедренной кости от мышей до 45 дней, исправить ткани в предварительно заколенной 3,7%формальдегида PBS и инкубировать его при 4 градусах по Цельсию в течение шести часов, а прокатки мягко на ротатор.Для минерализованных тканей, таких как голени и бедренной кости от мышей в возрасте старше 45 дней, подготовить один литр 10%EDTA раствор с рН скорректированы до 8,05 с гидроксидом натрия и разбавить формальдегид до 3,7% с помощью этого решения. Исправить ткани, сохраняя его в 3,7%формальдегид PBS ночь на 4 градуса по Цельсию. На следующий день поместите его в предварительно обожожте раствор формальдегида EDTA и инкубировать его при 4 градусах по Цельсию при стыя в течение 48 часов, убедившись, что заменить раствор три раза во время инкубации.Затем поместите ткань в предварительно заколеной 30% сахарозы, убедившись, чтобы заполнить контейнер до краев, и аккуратно поверните его на ночь при четырех градусах по Цельсию. Утром используйте типсы, чтобы удалить ткань из раствора сахарозы и промыть его в пять миллилитров оптимального соединения температуры резки, или OCT, в течение нескольких секунд. Заполните предварительно помечены криомольда с OCT и положение ткани в нижней части, работая быстро, чтобы избежать образца сидит при комнатной температуре слишком долго.Встраивание образца путем размещения формы на сухом льду и ожидания OCT затвердеть. Если образцы используются не сразу, они могут храниться при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Удалите блок из формы.Применить OCT между верхней части блока и патрон и охладить его в криостат, по крайней мере пять минут или до тех пор, пока OCT полностью затвердевает. Предварительно застелите держатель образца и держатель лезвия до минус 20 градусов по Цельсию, затем поместите образец в держатель патрона и лезвие в держатель лезвия, и дайте им уравночные в течение нескольких минут. Для послеродового анализа пластин роста подготовьтесь к разделам, которые от 30 до 160 микрометров.Используйте криостат, чтобы обрезать блок и сократить секции тканей до подходящей толщины и собирать их на слайдах. Затем воздух сушит горки при комнатной температуре до тех пор, пока они полностью не высохнут, и храните их при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 36 месяцев. Когда он будет готов к использованию слайда, удалите его из морозильной камеры и доввелите до комнатной температуры в держателе слайда.Чтобы удалить OCT, аккуратно нанесите PBS на слайд с пипеткой Pasteur. В течение 160 микрометров толщиной разделы, инкубировать слайд в течение 15 минут, удалить жидкость и применять свежие PBS в течение еще пяти минут. Намонтировать горки в растворе 75%thiodiethanol при комнатной температуре с 60 миллиметров длиной крышки скользит.Во-первых, выберите канал RFP, нажав на него во вкладке каналов, что приводит к тому, что детали канала отображаются во вкладке «Путь света». Затем нажмите галочку поле рядом с T-PMT. Поместите слайд в держатель слайда и распоимить ткани, представляющие интерес непосредственно между световой траекторией и объективом.Чтобы локализовать ткани, отсоедините коробки YFP и CFP под заголовком заголовок вкладки каналов. Выберите канал T-PMT в заголовке треков, а затем нажмите в прямом эфире во вкладке приобретения и увеличить прибыль для канала T-PMT для того, чтобы визуализировать выбор тканей на экране. Отрегулируйте положение слайда, чтобы найти область интереса и фокус с помощью соответствующей ручки микроскопа.Затем нажмите стоп в вкладке приобретения, чтобы отключить лазерное воздействие. Определите параметры изображения в соответствии с инструкциями рукописи и при необходимости отрегулируйте размер пинхол. Проверьте настройку, чтобы убедиться, что записанные сигналы не перекрываются, а затем выберите все три канала во вкладке каналов и нажмите кнопку привязки.Прокрутите между каналами отображения в полученном изображении, нажав на синие выделенные коробки над каждым каналом во вкладке размеров и вручную проверьте перекрытие между каналами на экране. Если сигналы перекрываются, корректируете параметры до тех пор, пока они не будут отличаться друг от друга. Этот протокол был использован для обозначения хондроцитов в эпифизального хряща и визуализировать их клонального расширения с возрастом.Центральная секция была определена путем визуализации крестообразной связки и клонов в проксимальной плите роста трибия были изображены. Индивидуальные клетки, которые были Col2 положительные и стал помечены флуоресцентными белками Confetti при введения тамоксифена, подверглись клонального расширения и впоследствии остались в пластине роста. Флуоресцентный сигнал можно визуализировать после длительного хранения.Некоторые секции хранились более трех лет до подготовки и визуализации. Трехмерная реконструкция проводилась автоматически с помощью программного обеспечения для анализа изображений и экспортировалась в качестве видео. Один раздел, сломанный во время криозирования, содержит область с таким высоким уровнем рекомбинации, что предотвратит клональный анализ, демонстрируя одну из общих проблем, с которыми сталкивается этот протокол.В зависимости от вашего исследовательского вопроса, использование линии Cre, которая конкретно маркирует ваши клетки, представляющие интерес, может быть очень важным. Поэтому мы рекомендуем проверить флуоресценцию в этих клетках вскоре после рекомбинации. Использование неосуществимых линий Cre имеет важное значение, потому что продолжающаяся рекомбинация ДНК в неиспасимых линиях Cre может изменить флуоресцентный профиль растворимых клеток, тем самым исключая клональный анализ.Этот протокол можно сочетать с функциональными возмущениями, такими как генетически манипулируемые штаммы, фармакологические методы лечения, хирургические вмешательства, а также иммунофлуоресцентное окрашивание подготовленных секций.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Использование конфокальной Анализ<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; По расследованию модуляторы Wnt и Shh морфогена градиентов

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Метод Lineage Tracing из клетки роговицы, используя Multi-Color Люминесцентная Reporter Мышей

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

Одновременная оценка кардиомиоцитов синтеза ДНК и плоидности: метод для оказания помощи квантификации кардиомиоцитов регенерации и оборота

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Сочетая прижизненной флуоресцентной микроскопии (IVFM) с генетической модели для изучения динамики приживления кроветворных клеток костного мозга ниши

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

В пробирке Рост Preantral фолликулов мыши под искусственной микрогравитации

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Культура organotypic метод для изучения развития тканей эмбриона курицы

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Трассировка экспрессии генов путем обнаружения активности β-галактозидазы в целом мыши эмбрионов

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

В Vitro модель параллельно плита перфузии системы для изучения бактериальных приверженность графт тканей

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

В естественных условиях метод для изучения целостности барьер крови яички мыши

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...