Name: in vitro assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00
Duration: 8 min 19 s
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Les auteurs remercient la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT), l’Union européenne, Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) et Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) pour le financement de l’unité de recherche unic (UID/IC/00051/2013). Ce projet est soutenu par FEDER dans le cadre de COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), le projet DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), soutenu par le programme opérationnel régional Norte Portugal (NORTE 2020), dans le cadre de l’accord de partenariat Portugal 2020, par l’intermédiaire du Fonds européen de développement régional (FEDF), le projet NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), soutenu par les Fonds structurels et d’investissement européens, programme opérationnel régional de Lisbonne 2020. Patrícia Rodrigues a été financée par fct (SFRH/BD/96026/2013) et João Almeida-Coelho a été par Universidade do Porto/FMUP et FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

<ol>
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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

L’évaluation in vitro de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés représente une technique importante pour clarifier les modifications qui se produisent au niveau des cardiomyocytes dans le contexte physiologique (p. ex., étirement) et pathologique (p. ex., ischémie). Cette méthodologie présente plusieurs avantages tels que l’exigence d’une quantité minimale de myocarde pour évaluer la fonction dans les cardiomyocytes obtenus à partir d’échantillons décongelés; en utilisant des cardiomyocytes d’un large éventaild’espèces (souris 13, rat1,14,15, lapin16, porc17, chien18, cobaye19 et humain20) et différents endroits cardiaques, y compris les atria, ventricules gauche et droit ou une région spécifique du cœur infarctus. De plus, cette technique permet d’offrir des concentrations spécifiques de Ca2+ et d’énergie (ATP) tout en mesurant la fonction des structures réglementaires et contractiles dans leur configuration native.
Malgré la simplicité de cette technique, il y a quelques étapes critiques. Il est essentiel de garantir la qualité de chaque étape dès le début, y compris la collecte d’échantillons. Les protéines de myofilament sont sensibles aux protéases21. Il est donc obligatoire de stocker les échantillons dans de l’azote liquide immédiatement après sa collecte. Les échantillons frais, qui n’étaient pas congelés auparavant, développeront des forces significativement plus élevées, de sorte qu’il n’est pas conseillé de mélanger la mesure effectuée dans des échantillons frais et congelés dans le même protocole. La deuxième étape la plus critique est l’extraction des cardiomyocytes. Au cours de cette procédure, il est crucial de maintenir l’échantillon sur la glace la plupart du temps. Un cocktail inhibiteur de la protéase peut être utilisé pour réduire le risque de dégradation des protéines pendant l’extraction/perméabilisation22. Troisièmement, les échantillons devraient être coupés en petits morceaux à l’aide de mouvements précis du scalpel puisque nous avons noté des cardiomyocytes de qualité réduite lorsque cette étape a été ignorée. Une autre étape critique est de laver les cardiomyocytes car il est difficile d’avoir le bon équilibre entre laver Triton (perméabilize la cellule, mais favorise son déglutage) et de garder autant de cellules dans le supernatant que possible. Il est important d’essayer d’abord l’extraction et le nombre de lavages pour chaque échantillon, espèce ou protocole. Par exemple, dans nos mains, nous avons noté que les extractions obèses de tissu de rat de ZSF1 ont un aspect « gras », qui a rendu ces cellules plus glissantes pendant le collage mais pas plus difficiles à mesurer. La façon dont nous contournons ce problème était d’effectuer plus d’expériences pour avoir un nombre raisonnable de cellules par animal. En outre, il est crucial de choisir une bonne cellule à coller, à savoir avec une bonne striation et une longueur raisonnable. Si le cardiomyocyte n’a pas ces dispositifs, il se détachera la plupart du temps des bouts d’aiguille ou développera aucune/basse force. Il est également important d’utiliser la colle correcte pour l’attachement cardiomyocyte, compte tenu du temps de collage et de son efficacité pour coller la cellule à l’aiguille. Dans nos mains, la colle de silicone (Table of Materials) guérit rapidement (10-15 min) et assez fort. Enfin, la dernière étape critique est liée au levage soigneusement du cardiomyocyte 5 min après collage de la cellule (pour éviter de coller la cellule à la couverture) et avant de la déplacer vers les puits (pour éviter que la cellule ne soit traînée par l’étape du microscope). Le tableau 7 résume le dépannage associé à cette technique, ses causes sous-jacentes et les solutions possibles pour surmonter les problèmes fréquents.
La principale limitation de cette méthode est qu’elle ne peut pas répondre à toutes les questions liées à la contractilité du myofilament, telles que la vitesse à laquelle les myofilaments s’activent/se désactivent. Dans le cadre in vivo, la dépolarisation membranaire, l’augmentation intracellulaire ca2+ et sa diffusion aux myofilaments doivent se produire pour que les myocytes se contractent, tandis que dans les cardiomyocytes écorchés Ca2+ diffusion aux myofilaments se produit immédiatement lorsque la cellule est submergée dans la solution Ca2+. Ce taux plus rapide de diffusion Ca2+ biaisera l’analyse d’activation/désactivation des myofilaments23.
Ces expériences sont influencées par différents facteurs, y compris la température, le pH de solution, la perturbation mécanique (slack-re-stretch vs slack) et les procédures de fixation cellulaire (attache d’épingle vs colle), toutes ces variables tenant compte des écarts de littérature en termes de ktr et de l’augmentation dépendante de la longueur du sarcomere en force4,12.
Les progrès futurs de la technique incluent l’exécution d’études fonctionnelles dans des cardiomyocytes intacts plutôt que perméabilisés. Cette technique a l’inconvénient de s’appuyer sur des cardiomyocytes fraîchement isolés (non préalablement congelés). Une autre question importante qui n’est pas directement liée à cette méthodologie, mais qui pourrait avoir une incidence importante sur celle-ci, est liée à la période maximale d’entreposage congelé de l’échantillon. Plus précisément, il est obligatoire d’établir le degré de dégradation du myofilament tout au long du temps d’entreposage (c.-à-d. pendant combien de temps les échantillons congelés peuvent être stockés afin d’assurer des données fonctionnelles de bonne qualité provenant des cardiomyocytes extraits).

Traditionnellement, l’évaluation des propriétés mécaniques myocardiques a été essayée la plupart du temps dans les préparations multicellulaires, telles que les muscles papillaires et le trabeculae1,2. Les bandes multicellulaires de muscles cardiaques incluent une population hétérogène de cellules, y compris les cardiomyocytes contractiles avec un modèle inconnu d’orientation et de génération de force, l’activité électrique et les distributions de stress/tension aussi bien qu’une matrice environnante de tissu conjonctif3,4. Une préparation sans collagène et contenant un seul cardiomyocyte permettrait de mesurer la longueur du sarcomère et les propriétés contractiles croisées d’une manière très précise etcontrôlée 5,6. Par conséquent, au cours des quatre dernières décennies, plusieurs méthodologies ont été développées permettant d’étudier les propriétés mécaniques, contractiles et de relaxation d’un seul cardiomyocyte6,7. La fonction contractile de ces cellules dépend fortement de la longueur du sarcomère et de la cinétique du cycle transmanie3. Ainsi, il est souhaitable d’étudier la fonction musculaire directement dans les cellules cardiaques isolées simples, considérant qu’il permet d’évaluer la longueur et la performance du sarcome ainsi que la fonction transversale et les propriétés contractiles. Cependant, isoler et attacher des cardiomyocytes fonctionnels avec une résolution optique raisonnable de sarcomere tout en enregistrant la mesure de force au niveau de μN est toujoursprovocant et évoluant 3,6. D’autres défis sont la logistique qui doit être installée pour isoler les cardiomyocytes des biopsies fraîchement recueillies. L’imprévisibilité de la collecte de biopsies humaines, par exemple, peut compromettre la faisabilité des expériences.
En outre, les préoccupations éthiques concernant le remplacement, la réduction et le raffinement de l’expérimentation animale pour les procédures scientifiques (principes des 3R) ont favorisé les changements d’étude au niveau cellulaire et tissulaire, de préférence dans les biopsies humaines, ou dans les échantillons d’animaux plus petits. En effet, un raffinement progressif des méthodologies d’évaluation in vitro de la fonction cardiaque à un plus petit niveau de complexité permet une bonne intégration des résultats à l’ensemble du corps et de les traduire au scénario clinique7. Au total, l’utilisation d’échantillons stockés à -80 °C pour extraire les cardiomyocytes peut être une alternative attrayante.
Le tissu myocardique est coupé en petits morceaux et homogénéisé avec un mortier et un pilon. Le résultat de cette homogénéisation est une suspension des cellules empaquetées et isolées écorchées avec des degrés variables de dommages sarcolemmal, dans lequel le myoplasme est exposé au milieu de bain et tous les composants cellulaires sont lavés. Des structures telles que les myofibriles qui sont plus loin de la sarcolemma sont préservées. Ainsi, le raccourcissement sarcomere et les propriétés fonctionnelles associées à l’appareil myofibrillar sont maintenus intacts et peuvent êtreenregistrés 8,9.
Le système de mesure de la force cardiomyocyte se compose d’un moteur électromagnétique, utilisé pour ajuster la longueur des cardiomyocytes, et d’un transducteur de force, qui mesure la contraction cardiomyocyte isométrique. Un cardiomyocyte perméabilisé ou écorché est placé dans une chambre expérimentale contenant une solution relaxante ([Ca2+] < 10 nM) et collée au silicium à 2 aiguilles minces : l’une attachée au moteur et l’autre au transducteur de force. Un système optique est utilisé pour déterminer la morphologie des cardiomyocytes et la longueur du sarcome. Le protocole expérimental consiste souvent en une série d’enregistrements de force sur des solutions tampons contenant différentes concentrations de Ca2+, la détermination de la cinétique entre actine et myosine et la mesure de la tension passive des cardiomyocytes montés à des longueurs de sarcomere prédéfinies (figure 1). L’isolement des cardiomyocytes perméabilisés des échantillons myocardiques congelés dans de l’azote liquide (et ensuite stockés à -80 °C) est une technique qui utilise la mécanique cellulaire et la biochimie protéique pour mesurer la force maximale ca2+activée (active) par zone transversale (Tactive,kN◊m-2),Ca2+-indépendante tension (passive) (Tpassive,kN◊m-2),myofilaments Ca2+-sensibilité (pCa50),monofilaments cooperativity (nHill), taux de réaménagement de la force (ktr) ainsi que dépendances de longueur sarcomere de Tactive,Tpassive, pCa50, nHill et ktr.
Le but de ce protocole est d’illustrer et de résumer le potentiel du système de mesure de la force cardiomyocyte comme une procédure fiable pour évaluer les propriétés mécaniques fonctionnelles des cardiomyocytes à peau unique isolés d’échantillons congelés de différentes espèces.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate (CaCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02067.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24720.157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (MgCl2 1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.14353.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid (C3H6O2)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.00605.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Squeeze Tube</td>
			<td>Marineland</td>
			<td>31003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritiplex (EGTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08435.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control)</td>
			<td>Terre Haute Glas-col</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length Controller ( Model 315C-I)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer (Model 403 A)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ASI 600A</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sotware VSL (Model 900B)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope (IX51)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes

Dans cet article, nous décrivons les étapes nécessaires pour isoler un seul cardiomyocyte permeabilisé (« écorché ») et l’attacher à un appareil de mesure de la force et un moteur pour effectuer des études fonctionnelles. Ces études permettront de mesurer la rigidité cardiomyocyte (force passive) et son activation avec différentes solutions contenant du calcium (Ca2+) pour déterminer, entre autres: le développement maximal de la force, le myofilament Ca2+-sensibilité (pCa50),la cooperativité (nHill) et le taux de réaménagement de la force (ktr). Cette méthode permet également de déterminer les effets des médicaments agissant directement sur les myofilaments et de l’expression de protéines recombinantes exogènes sur les propriétés actives et passives des cardiomyocytes. Cliniquement, les études écorchées de cardiomyocyte mettent en évidence la pathophysiologie de beaucoup de maladies myocardiques et permettent l’évaluation in vitro de l’impact des interventions thérapeutiques ciblant les myofilaments. Au total, cette technique permet de clarifier la pathophysiologie cardiaque en étudiant les corrélations entre les paramètres in vitro et in vivo dans les modèles animaux et les tissus humains obtenus lors d’une chirurgie à cœur ouvert ou d’une greffe.

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Ce protocole vise à décrire étape par étape la technique d’extraction et d’évaluation de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés. Cette méthodologie permet la mesure et la modulation aiguë de la fonction myofilament à l’aide de petites biopsies congelées qui peuvent être recueillies à différents endroits cardiaques, des souris aux hommes.

Évaluation in vitro de la fonction cardiaque à l’aide de cardiomyocytes écorchés

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Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy Video (Video) | JoVE

Évaluation de la fonction microvasculaire tissu adipeux humain en utilisant la vidéomicroscopie

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism Video (Video) | JoVE

Normothermique Ex Situ coeur Perfusion en Mode de travail : évaluation de la fonction cardiaque et le métabolisme

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills

A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills Video (Video) | JoVE

Un programme informatisé d’évaluation et de formation des compétences fonctionnelles ciblant la technologie basée sur les compétences fonctionnelles quotidiennes

Today, many functional skills are technology-based, so development of a technology-based training program has broad importance. Here we present a ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats Video (Video) | JoVE

Évaluation échocardiographique de l'anatomie cardiaque et de la fonction chez les rats adultes

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment Video (Video) | JoVE

Utilisation d’une biopsie chimique pour l’évaluation de la qualité de la greffe

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...