Name: in vitro assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes Video at JoVE.com

Gli autori ringraziano la Fondazione portoghese per la scienza e la tecnologia (FCT), l'Unione europea, il Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), il Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e la Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE) per il finanziamento dell'unità di ricerca UnIC (UID/IC/00051/2013). Questo progetto è sostenuto da FEDER attraverso COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalização (POCI), il progetto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), sostenuto dal programma operativo regionale Norte Portugal (NORTE 2020), nell'ambito dell'accordo di partenariato Portogallo 2020, attraverso il Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR), il progetto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), sostenuto dai Fondi strutturali e di investimento europei, il programma operativo regionale di Lisbona 2020. Patrícia Rodrigues è stata finanziata da FCT (SFRH/BD/96026/2013) e João Almeida-Coelho è stata da Universidade do Porto/FMUP e FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programa Operacional Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Doutorais).

<ol>
	<li>Leite-Moreira, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+compliance:+a+novel+adaptive+biological+mechanism+following+acute+cardiac+load.">Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).</li><li>Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+myocardial+stiffness+by+&#946;-adrenergic+stimulation+-+its+role+in+normal+and+failing+heart.">Modulation of myocardial stiffness by &#946;-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart.</a> Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).</li><li>Cokkinos, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introduction to Translational Cardiovascular Research. , 371-387 (2015).</li><li>van der Velden, J., Stienen, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Disorders+and+Pathophysiology+of+Sarcomeric+Proteins.">Cardiac Disorders and Pathophysiology of Sarcomeric Proteins.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 381-426 (2019).</li><li>Garnier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+procedures+for+mechanical+manipulation+of+isolated+cardiac+myocytes:+a+challenge.">Attachment procedures for mechanical manipulation of isolated cardiac myocytes: a challenge.</a> Cardiovascular Research. 28 (12), 1758-1764 (1994).</li><li>Brady, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+isolated+cardiac+myocytes.">Mechanical properties of isolated cardiac myocytes.</a> Physiological Reviews. 71 (2), 413-428 (1991).</li><li>Falcao-Pires, I., Leite-Moreira, A. F., Cokkinos, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20.">Chapter 20.</a> Introduction to Translational Cardiovascular Research. 20, 371-387 (2015).</li><li>Liang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teaching+calcium-induced+calcium+release+in+cardiomyocytes+using+a+classic+paper+by+Fabiato.">Teaching calcium-induced calcium release in cardiomyocytes using a classic paper by Fabiato.</a> Advances Physiology Education. 32 (1), 1-10 (2008).</li><li>Roche, S. M., Gumucio, J. P., Brooks, S. V., Mendias, C. L., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Maximum+Isometric+Force+Generated+by+Permeabilized+Skeletal+Muscle+Fibers.">Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52695 (2015).</li><li>Huxley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+structure+and+theories+of+contraction.">Muscle structure and theories of contraction.</a> Progress Biophysics and Biophysical Chemistry. 7, 255-318 (1957).</li><li>Sequeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+role+of+ADP+and+Ca(2+)+in+diastolic+myocardial+stiffness.">Synergistic role of ADP and Ca(2+) in diastolic myocardial stiffness.</a> Journal Physiology. 593 (17), 3899-3916 (2015).</li><li>Edes, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+tension+redevelopment+is+not+modulated+by+sarcomere+length+in+permeabilized+human,+murine,+and+porcine+cardiomyocytes.">Rate of tension redevelopment is not modulated by sarcomere length in permeabilized human, murine, and porcine cardiomyocytes.</a> American Journal Physiology Regulatory Integrative Comparative Physiology. 293 (1), R20-R29 (2007).</li><li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics:+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells.">Mouse intact cardiac myocyte mechanics: cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> Journal General Physiology. 137 (1), 81-91 (2011).</li><li>Hamdani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+titin+hypophosphorylation+importantly+contributes+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction+in+a+rat+metabolic+risk+model.">Myocardial titin hypophosphorylation importantly contributes to heart failure with preserved ejection fraction in a rat metabolic risk model.</a> Circulation Heart Failure. 6 (6), 1239-1249 (2013).</li><li>Miranda-Silva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+biventricular+alterations+in+myocardial+(reverse)+remodelling+in+aortic+banding-induced+chronic+pressure+overload.">Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2956 (2019).</li><li>Rodrigues, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+myocardial+changes+induced+by+doxorubicin+in+the+nonfailing+dilated+ventricle.">Early myocardial changes induced by doxorubicin in the nonfailing dilated ventricle.</a> American Journal Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (3), H459-H475 (2019).</li><li>van der Velden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+myofilament+function+contribute+to+left+ventricular+dysfunction+in+pigs+early+after+myocardial+infarction.">Alterations in myofilament function contribute to left ventricular dysfunction in pigs early after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 95 (11), e85-e95 (2004).</li><li>Wakili, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+potential+molecular+contributors+to+atrial+hypocontractility+caused+by+atrial+tachycardia+remodeling+in+dogs.">Multiple potential molecular contributors to atrial hypocontractility caused by atrial tachycardia remodeling in dogs.</a> Circulation: Arrhythmia Electrophysiology. 3 (5), 530-541 (2010).</li><li>Ait Mou, Y., le Guennec, J. Y., Mosca, E., de Tombe, P. P., Cazorla, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+cardiac+sarcomeric+proteins+in+the+myofibrillar+force+response+to+stretch.">Differential contribution of cardiac sarcomeric proteins in the myofibrillar force response to stretch.</a> Pflugers Archiv. 457 (1), 25-36 (2008).</li><li>Falcao-Pires, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+mellitus+worsens+diastolic+left+ventricular+dysfunction+in+aortic+stenosis+through+altered+myocardial+structure+and+cardiomyocyte+stiffness.">Diabetes mellitus worsens diastolic left ventricular dysfunction in aortic stenosis through altered myocardial structure and cardiomyocyte stiffness.</a> Circulation. 124 (10), 1151-1159 (2011).</li><li>Lim, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthracyclines+induce+calpain-dependent+titin+proteolysis+and+necrosis+in+cardiomyocytes.">Anthracyclines induce calpain-dependent titin proteolysis and necrosis in cardiomyocytes.</a> Journal Biology Chemistry. 279 (9), 8290-8299 (2004).</li><li>Woulfe, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Method+of+Isolating+Myofibrils+From+Primary+Cardiomyocyte+Culture+Suitable+for+Myofibril+Mechanical+Study.">A Novel Method of Isolating Myofibrils From Primary Cardiomyocyte Culture Suitable for Myofibril Mechanical Study.</a> Frontiers Cardiovascular Medicine. 6, 12 (2019).</li><li>Ait Mou, Y., Bollensdorff, C., Cazorla, O., Magdi, Y., de Tombe, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+cardiac+biophysical+properties.">Exploring cardiac biophysical properties.</a> Global Cardiology Science Practice. 2015, 10 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

La valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati rappresenta una tecnica importante per chiarire le modifiche che si verificano a livello di cardiomiociti in contesto fisiologico (ad esempio, stretch) e patologico (ad esempio, ischemia). Questa metodologia ha diversi vantaggi come richiedere una quantità minima di miocardio per valutare la funzione nei cardiomiociti ottenuti da campioni scongelati; utilizzando cardiomiociti provenienti da una vasta gamma di specie(topi 13,ratti 1,14,15,coniglio 16,maiale17,cane18,cavia19 eumani 20)e diverse località cardiache, tra cui gli atri, ventricoli sinistro e destro o una regione specifica del cuore infarto. Inoltre, questa tecnica consente di fornire concentrazioni specifiche di Ca2+ ed energia (ATP) misurando al contempo la funzione delle strutture normative e contrattili nella loro configurazione nativa.
Nonostante la semplicità di questa tecnica, ci sono alcuni passaggi critici. È essenziale garantire la qualità di ogni fase fin dall'inizio, compresa la raccolta dei campioni. Le proteine del miofilamento sono suscettibili alle proteasi21. Pertanto è obbligatorio conservare campioni in azoto liquido immediatamente dopo la sua raccolta. I campioni freschi, che non erano precedentemente congelati, svilupperanno forze significativamente più elevate, quindi non è consigliabile mescolare la misurazione eseguita in campioni freschi e congelati nello stesso protocollo. Il secondo passo più critico è l'estrazione dei cardiomiociti. Durante questa procedura, è fondamentale mantenere il campione sul ghiaccio per la maggior parte del tempo. Un cocktail inibitore della proteasi può essere utilizzato per ridurre il rischio di degradazione proteica durante l'estrazione / permeabilizzazione22. In terzo luogo, i campioni dovrebbero essere tagliati in pezzi più piccoli utilizzando precisi movimenti del bisturi poiché abbiamo notato cardiomiociti di qualità ridotta quando questo passaggio è stato ignorato. Un altro passo critico è lavare i cardiomiociti poiché è difficile avere il giusto equilibrio tra lavare Tritone (permeabilizza la cellula ma ne favorisce lo scollatura) e mantenere il maggior numero possibile di cellule nel supernatante. È importante provare prima l'estrazione e il numero di lavaggi per ogni campione, specie o protocollo. Ad esempio, nelle nostre mani, abbiamo notato che le estrazioni di tessuti di ratto obesi ZSF1 hanno un aspetto "grasso", che ha reso queste cellule più scivolose durante l'incollaggio ma non più difficili da misurare. Il modo in cui eludiamo questo problema è stato eseguendo più esperimenti per avere un numero ragionevole di cellule per animale. Inoltre, è fondamentale selezionare una buona cella da incollare, vale a dire con una buona striatura e una lunghezza ragionevole. Se il cardiomiocita non ha queste caratteristiche, si stacca principalmente dalle punte dell'ago o non sviluppa alcuna / bassa forza. È anche importante utilizzare la colla corretta per l'attacco di cardiomiociti, considerando il tempo di incollaggio e la sua efficacia per incollare la cellula all'ago. Nelle nostre mani, la colla siliconica(Tavolo dei Materiali)si polimerizza velocemente (10-15 min) e abbastanza forte. Infine, l'ultimo passaggio critico è correlato al sollevamento attento del cardiomiocita 5 min dopo aver incollato la cellula (per evitare di incollare la cella al coverslip) e prima di spostarla nei pozzi (per evitare che la cellula venga trascinata dallo stadio del microscopio). La tabella 7 riassume la risoluzione dei problemi associati a questa tecnica, le sue cause di fondo e le possibili soluzioni per superare i problemi frequenti.
La principale limitazione di questo metodo è che non può rispondere a tutte le domande relative alla contrattilità del miofilamento, come la velocità di attivazione/disattivazione dei miofilamenti. Nell'ambiente in vivo, la depolarizzazione della membrana, l'aumento intracellulare ca2+ e la sua diffusione nei miofilamenti devono verificarsi affinché i miociti si contrarranno, mentre nei cardiomiociti scuoiati la diffusione ca2+ ai miofilamenti avviene immediatamente quando la cellula è immersa nella soluzione Ca2+. Questa velocità più veloce di diffusione di Ca2+ indirà l'analisi di attivazione/disattivazione dei miofilamenti23.
Questi esperimenti sono influenzati da diversi fattori, tra cui la temperatura, il pH della soluzione, la perturbazione meccanica (slack-re-stretch vs. slack) e le procedure di fissaggio cellulare (pin tie vs glue), tutte queste variabili che rappresentano discrepanze di letteratura in termini di ktr e l'aumento dipendente dalla lunghezza del sarcomero in forza4,12.
Il progresso futuro della tecnica include l'esecuzione di studi funzionali in cardiomiociti intatti piuttosto che permeabilizzati. Questa tecnica ha lo svantaggio di affidarsi a cardiomiociti appena isolati (non precedentemente congelati). Un'altra questione importante non direttamente correlata a questa metodologia, ma che può avere un impatto significativo, è correlata al periodo massimo di stoccaggio congelato del campione. Nello specifico, è obbligatorio stabilire il grado di degradazione del miofilamento per tutto il tempo di conservazione (cioè, per quanto tempo i campioni congelati possono essere conservati al fine di garantire dati funzionali di buona qualità derivati dai cardiomiociti estratti).

Tradizionalmente, la valutazione delle proprietà meccaniche del miocardio è stata tentata principalmente in preparati multicellulari, come i muscoli papillari e le trabecole1,2. Le strisce muscolari cardiache multicellulari includono una popolazione eterogenea di cellule, compresi i cardiomiociti contrattili con un modello sconosciuto di orientamento e generazione di forza, attività elettrica e distribuzioni di stress / ceppo, nonché una matrice di tessuto connettivocircostante 3,4. Una preparazione senza collagene e contenente un singolo cardiomiocita consentirebbe di misurare la lunghezza del sarcomero e le proprietà della contrattile a ponte trasversale in modo molto preciso econtrollato 5,6. Pertanto, negli ultimi quattro decenni, sono state sviluppate diverse metodologie che consentono di indagare le proprietà meccaniche, contrattili e di rilassamento di un singolo cardiomiocita6,7. La funzione contrattile di queste cellule dipende fortemente dalla lunghezza del sarcomero e dalla cinetica ciclistica a pontetrasversale 3. Pertanto, è auspicabile indagare la funzione muscolare direttamente in singole cellule cardiache isolate, considerando che consente di valutare la lunghezza e le prestazioni del sarcomero, nonché la funzione cross-bridge e le proprietà contrattili. Tuttavia, isolare e collegare cardiomiociti funzionali con una ragionevole risoluzione ottica del sarcomero durante la registrazione della misurazione della forza a livello μN è ancora impegnativo e inevoluzione 3,6. Altre sfide sono la logistica che deve essere installata per isolare i cardiomiociti dalle biopsie appena raccolte. L'imprevedibilità della raccolta di biopsie umane, ad esempio, può compromettere la fattibilità degli esperimenti.
Inoltre, le preoccupazioni etiche riguardanti la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento della sperimentazione animale per le procedure scientifiche (principi dei 3R) hanno promosso cambiamenti di studio a livello cellulare e tissutale, preferibilmente nelle biopsie umane o in campioni animali più piccoli. Infatti un progressivo perfezionamento delle metodologie per valutare la funzione cardiaca in vitro a un livello più ridotto di complessità consente una corretta integrazione dei risultati a tutto il corpo e tradurli nello scenarioclinico 7. Complessivamente, l'utilizzo di campioni conservati a -80 °C per estrarre i cardiomiociti può essere un'alternativa interessante.
Il tessuto miocardico viene tagliato a pezzetti e omogeneizzato con un mortaio e un pestello. Il risultato di questa omogeneizzazione è una sospensione di cellule scuoiate in bundle e isolate con vari gradi di danno sarcolemmale, in cui il mioplasma è esposto al mezzo di balneazione e tutti i componenti cellulari vengono lavati. Strutture come le miofibrille che sono più lontane dal sarcolemma sono conservate. Pertanto, l'accorciamento del sarcomero e le proprietà funzionali associate all'apparato miofibrillare sono mantenuti intatti e possono essereregistrati 8,9.
Il sistema di misurazione della forza cardiomiocita è costituito da un motore elettromagnetico, utilizzato per regolare la lunghezza dei cardiomiociti, e da un trasduttore di forza, che misura la contrazione cardiomiocitalica isometrica. Un cardiomiocita permeabilizzato, o scuoiato, viene posto in una camera sperimentale contenente una soluzione rilassante ([Ca2+] < 10 nM) e incollata al silicio a 2 aghi sottili: uno attaccato al motore e l'altro al trasduttore di forza. Un sistema ottico viene utilizzato per determinare la morfologia dei cardiomiociti e la lunghezza del sarcomero. Il protocollo sperimentale consiste spesso in una serie di registrazioni di forza su soluzioni tampone contenenti diverse concentrazioni di Ca2+, la determinazione della cinetica a ponte trasversale actina-miosina e la misurazione della tensione passiva dei cardiomiociti montati a lunghezze di sarcomere predefiniti (Figura 1). L'isolamento dei cardiomiociti permeabili da campioni miocardici congelati in azoto liquido (e successivamente conservati a -80 °C) è una tecnica che utilizza la meccanica cellulare e la biochimica proteica per misurare la forza massima attivata(attiva) ca 2+per area di sezione trasversale (Tattiva,kN-m-2), Ca2+-tensione indipendente (passiva) (Tpassivo, kN-m-2), miofilamenti Ca2+-sensibilità (pCa50),cooperatività dei miofilamenti (nHill), tasso di riqualificazione della forza (ktr) e dipendenze di lunghezza sarcomere di Tattivo,Tpassivo,pCa50, nHill e ktr.
L'obiettivo di questo protocollo è illustrare e riassumere il potenziale del sistema di misurazione della forza cardiomiocita come procedura affidabile per valutare le proprietà meccaniche funzionali dei cardiomiociti a pelle singola isolati da campioni congelati di diverse specie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate (CaCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02067.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24720.157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (MgCl2 1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.14353.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid (C3H6O2)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.00605.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Squeeze Tube</td>
			<td>Marineland</td>
			<td>31003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritiplex (EGTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08435.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control)</td>
			<td>Terre Haute Glas-col</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length Controller ( Model 315C-I)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer (Model 403 A)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ASI 600A</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sotware VSL (Model 900B)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope (IX51)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes

In questo articolo, descriviamo i passaggi necessari per isolare un singolo cardiomiocita permeabilizzato ("scuoiato") e attaccarlo a un apparato di misurazione della forza e a un motore per eseguire studi funzionali. Questi studi consentiranno di misurare la rigidità del cardiomiocita (forza passiva) e la sua attivazione con diverse soluzioni contenenti calcio (Ca2+) per determinare, tra gli altri: massimo sviluppo della forza, miofilamento Ca2+-sensibilità (pCa50),cooperatività (nHill) e tasso di riqualificazione della forza (ktr). Questo metodo consente anche di determinare gli effetti dei farmaci che agiscono direttamente sui miofilamenti e dell'espressione di proteine ricombinanti esogene sulle proprietà attive e passive dei cardiomiociti. Clinicamente, studi cardiomiociti scuoiati evidenziano la fisiopatologia di molte malattie del miocardio e consentono una valutazione in vitro dell'impatto degli interventi terapeutici mirati ai miofilamenti. Complessivamente, questa tecnica consente di chiarire la fisiopatologia cardiaca studiando correlazioni tra parametri in vitro e in vivo nei modelli animali e nel tessuto umano ottenuti durante la chirurgia a cuore aperto o trapianto.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes Video at JoVE.com

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes Video (Video) | JoVE

Questo protocollo mira a descrivere passo dopo passo la tecnica di estrazione e valutazione della funzione cardiaca utilizzando cardiomiociti scuoiati. Questa metodologia consente la misurazione e la modifica acuta della funzione di miofilamento utilizzando piccole biopsie congelate che possono essere raccolte da diverse posizioni cardiache, dai topi agli uomini.

Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy Video (Video) | JoVE

Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante 31 P spettroscopia NMR

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Ricerca

Medicina

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats Video (Video) | JoVE

Valutazione della funzione cardiaca e Morfologia miocardica Utilizzando Small Animal Look-Locker Inversion Recovery (SALLI) MRI nei ratti

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography Video (Video) | JoVE

Valutazione del ventricolo destro Struttura e funzione in modello murino di polmonare Arteria Costrizione da ecocardiografia transtoracica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice Video (Video) | JoVE

Valutazione Ecografia base di coronaropatia Flow e flusso coronarico Reserve Utilizzando la pressione Sovraccarico modello nei topi

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents Video (Video) | JoVE

La valutazione transcutanea della funzione renale nei roditori Conscious

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy Video (Video) | JoVE

Valutazione della funzione microvascolare di tessuto adiposo umano mediante videomicroscopia

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism Video (Video) | JoVE

Normotermica Ex Situ cuore aspersione in modalità di lavoro: valutazione della funzione cardiaca e il metabolismo

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills

A Computerized Functional Skills Assessment and Training Program Targeting Technology Based Everyday Functional Skills Video (Video) | JoVE

Un programma computerizzato di valutazione e formazione delle competenze funzionali, destinato alle competenze funzionali quotidiane basate sulla tecnologia

Today, many functional skills are technology-based, so development of a technology-based training program has broad importance. Here we present a ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats Video (Video) | JoVE

Valutazione ecocardiografica dell'anatomia e della funzione cardiaca nei ratti adulti

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment Video (Video) | JoVE

Utilizzo di una biopsia chimica per la valutazione della qualità dell'innesto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...