Name: in vitro assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes
Uploaded: 2020-06-22T13:00:00
Duration: 8 min 19 s
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Los autores agradecen a la Fundación Portuguesa para la Ciencia y la Tecnología (FCT), a la Unión Europea, al Quadro de Referencia Estratégico Nacional (QREN), a Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) y a la unidad de investigación Factores Operacionales de Competitividad (COMPETE) por financiar la unidad de investigación UnIC (UID/IC/00051/2013). Este proyecto cuenta con el apoyo de FEDER a través de COMPETE 2020 - Programa Operacional Competitividade E Internacionalizao (POCI), el proyecto DOCNET (NORTE-01-0145-FEDER-000003), apoyado por el programa operativo regional Norte Portugal (NORTE 2020), en el marco del acuerdo de colaboración Portugal 2020, a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), el proyecto NETDIAMOND (POCI-01-0145-FEDER-016385), apoyado por los Fondos Estructurales y de Inversión Europeos, el programa operativo regional de Lisboa 2020. Patrícia Rodrigues fue financiada por FCT (SFRH/BD/96026/2013) y Joao Almeida-Coelho fue de la Universidade do Porto/FMUP y FSE-Fundo Social Europeu, NORTE 2020-Programación Operacional Operación Regional do Norte, (NORTE-08-5369-FSE-000024-Programas Dorais).

<ol>
	<li>Leite-Moreira, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+compliance:+a+novel+adaptive+biological+mechanism+following+acute+cardiac+load.">Stretch-induced compliance: a novel adaptive biological mechanism following acute cardiac load.</a> Cardiovascular Research. 114 (5), 656-667 (2018).</li><li>Falcao-Pires, I., Fontes-Sousa, A. P., Lopes-Conceicao, L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+myocardial+stiffness+by+&#946;-adrenergic+stimulation+-+its+role+in+normal+and+failing+heart.">Modulation of myocardial stiffness by &#946;-adrenergic stimulation - its role in normal and failing heart.</a> Physiological Research. 60 (4), 599-609 (2011).</li><li>Cokkinos, D. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+cardiac+biophysical+properties.">Exploring cardiac biophysical properties.</a> Global Cardiology Science Practice. 2015, 10 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen conflicto de intereses.

La evaluación in vitro de la función cardíaca utilizando cardiomiocitos despellejados representa una técnica importante para aclarar las modificaciones que se producen a nivel de cardiomiocitos en contextos fisiológicos (por ejemplo, estiramiento) y patológicos (por ejemplo, isquemia). Esta metodología tiene varias ventajas como exigir una cantidad mínima de miocardio para evaluar la función en cardiomiocitos obtenidos a partir de muestras descongeladas; utilizando cardiomiocitos de una amplia gama de especies (ratones13, rata1,14,15, conejo16, cerdo17, perro18, conejillo de indias19 y humano20) y diferentes lugares cardíacos, incluyendo las aurículas, ventrículos izquierdo y derecho o una región específica del corazón infarto. Además, esta técnica permite la entrega de concentraciones específicas de Ca2+ y energía (ATP) mientras mide la función de las estructuras regulatorias y contráctiles en su configuración nativa.
A pesar de la simplicidad de esta técnica, hay algunos pasos críticos. Es esencial garantizar la calidad de cada paso desde el principio, incluida la recogida de muestras. Las proteínas de miofilación son susceptibles a las proteasas21. Por lo tanto, es obligatorio almacenar las muestras en nitrógeno líquido inmediatamente después de su recogida. Las muestras frescas, que no estaban previamente congeladas, desarrollarán fuerzas significativamente más altas, por lo que no es aconsejable mezclar la medición realizada en muestras frescas y congeladas en el mismo protocolo. El segundo paso más crítico es la extracción de los cardiomiocitos. Durante este procedimiento, es crucial mantener la muestra sobre hielo la mayor parte del tiempo. Se puede utilizar un cóctel inhibidor de la proteasa para reducir el riesgo de degradación de proteínas durante la extracción/permeabilización22. En tercer lugar, las muestras deben cortarse en trozos más pequeños utilizando movimientos precisos del bisturí, ya que observamos cardiomiocitos de calidad reducida cuando se descartó este paso. Otro paso crítico es lavar los cardiomiocitos ya que es difícil tener el equilibrio adecuado entre lavar Tritón (permeabiliza la célula pero promueve su desencolado) y mantener tantas células en el sobrenadante como sea posible. Es importante probar primero la extracción y el número de lavados para cada muestra, especie o protocolo. Por ejemplo, en nuestras manos, observamos que las extracciones de tejido de rata obesos ZSF1 tienen un aspecto "graso", lo que hizo que estas células fueran más resbaladizas durante el encolado, pero no más difíciles de medir. La forma en que eludimos este problema fue realizando más experimentos para tener un número razonable de células por animal. Además, es crucial seleccionar una buena celda para pegar, a saber, con buena estrías y longitud razonable. Si el cardiomiocitos no tiene estas características, en su mayoría se desprenderá de las puntas de la aguja o desarrollará una fuerza baja o nula. También es importante utilizar el pegamento correcto para la fijación de cardiomiocitos, teniendo en cuenta el tiempo de encolado y su eficacia para pegar la célula a la aguja. En nuestras manos, el pegamento de silicona (Tabla de Materiales) cura rápido (10-15 min) y lo suficientemente fuerte. Finalmente, el último paso crítico está relacionado con levantar cuidadosamente el cardiomiocitos 5 min después de pegar la célula (para evitar pegar la célula al cubreobjetos) y antes de moverla a los pozos (para evitar que la célula sea arrastrada por la etapa del microscopio). La Tabla 7 resume la solución de problemas asociada con esta técnica, sus causas subyacentes y las posibles soluciones para superar problemas frecuentes.
La principal limitación de este método es que no puede responder a todas las preguntas relacionadas con la contractilidad de miofilament, como la rapidez con la que se activan/desactivan los miofilamentos. En el entorno in vivo, la despolarización de membrana, el aumento intracelular de Ca2+ y su difusión a misofilamentos deben ocurrir para que los miocitos se contraigan, mientras que en cardiomiocitos despellejados Ca2+ difusión a misofilamentos se produce inmediatamente cuando la célula está sumergida en la solución Ca2+. Esta velocidad más rápida de difusión de Ca2+ sesgará miofilamentos de activación / desactivación23.
Estos experimentos están influenciados por diferentes factores, incluyendo la temperatura, el pH de la solución, la perturbación mecánica (slack-re-stretch vs. slack) y los procedimientos de fijación de celdas (pin tie vs. glue), todas estas variables que tienen en cuenta las discrepancias de la literatura en términos de ktr y el aumento dependiente de la longitud de los sarcomere en la fuerza4,12.
El progreso futuro de la técnica incluye la realización de estudios funcionales en intacto en lugar de cardiomiocitos permeabilizados. Esta técnica tiene la desventaja de depender de cardiomiocitos recién aislados (no previamente congelados). Otra cuestión importante que no está directamente relacionada con esta metodología, pero que puede afectar significativamente a ella está relacionada con el período máximo de almacenamiento congelado de muestras. Específicamente, es obligatorio establecer el grado de degradación del miofilamento a lo largo del tiempo de almacenamiento (es decir, durante cuánto tiempo se pueden almacenar muestras congeladas con el fin de asegurar datos funcionales de buena calidad derivados de los cardiomiocitos extraídos).

Tradicionalmente, la evaluación de las propiedades mecánicas del miocardio se ha intentado principalmente en preparaciones multicelulares, tales como músculos papilares y trabeculae1,2. Las tiras de músculos cardíacos multicelulares incluyen una población heterogénea de células, incluyendo cardiomiocitos contráctiles con un patrón desconocido de orientación y generación de fuerza, actividad eléctrica y distribuciones de estrés/deformación, así como una matriz de tejido conectivo circundante3,4. Una preparación sin colágeno y que contenga un solo cardiomiocitos permitiría medir la longitud de los sarcomos y las propiedades contráctiles de puente cruzado de una manera muy precisa y controlada5,6. Por lo tanto, en las últimas cuatro décadas, se desarrollaron varias metodologías que permitieron investigar las propiedades mecánicas, contráctiles y de relajación de un solo cardiomiocitos6,7. La función contráctil de estas células depende en gran medida de la longitud de los sarcomos y de la cinética ciclista de puente cruzado3. Por lo tanto, es deseable investigar la función muscular directamente en células cardíacas aisladas individuales, teniendo en cuenta que permite evaluar la longitud y el rendimiento de los sarcomos, así como la función de puente cruzado y las propiedades contráctiles. Sin embargo, aislar y conectar cardiomiocitos funcionales con una resolución de sarcomere óptico razonable, mientras que la medición de la fuerza de grabación a nivel de N sigue siendo difícil y evoluciona3,6. Otros desafíos son la logística que debe instalarse para aislar los cardiomiocitos de las biopsias recién recolectadas. La imprevisibilidad de la recolección de biopsias humanas, por ejemplo, puede poner en peligro la viabilidad de los experimentos.
Además, las preocupaciones éticas relativas a la sustitución, reducción y refinamiento de la experimentación animal para procedimientos científicos (principios de los 3R) han promovido cambios de estudio a nivel celular y tisular, preferiblemente en biopsias humanas, o en muestras de animales más pequeños. De hecho, un refinamiento progresivo de las metodologías para evaluar la función cardíaca in vitro en un nivel más pequeño de complejidad permite una adecuada integración de los resultados a todo el cuerpo y traducirlos al escenario clínico7. En conjunto, el uso de muestras almacenadas a -80 oC para extraer cardiomiocitos puede ser una alternativa atractiva.
El tejido miocárdico se corta en trozos pequeños y se homogeneiza con un mortero y un pestillo. El resultado de esta homogeneización es una suspensión de células agrupadas y aisladas con diferentes grados de daño sarcolemmal, en la que el mioplasmo se expone al medio de baño y se lavan todos los componentes celulares. Se conservan estructuras como las miofibrils que están más lejos del sarcolemma. Así, el acortamiento de los sarcomos y las propiedades funcionales asociadas con el aparato miofibrilar se mantienen intactas y se pueden registrar8,9.
El sistema de medición de la fuerza del cardiomiocitos consiste en un motor electromagnético, utilizado para ajustar la longitud de los cardiomiocitos, y un transductor de fuerza, que mide la contracción isométrica del cardiomiocitos. Un cardiomiocitos permeabilizado o despellejado se coloca en una cámara experimental que contiene una solución relajante ([Ca2+] < 10 nM) y está pegado al silicio a 2 agujas delgadas: una unida al motor y la otra al transductor de fuerza. Un sistema óptico se utiliza para determinar la morfología de los cardiomiocitos y la longitud de los sarcomeres. El protocolo experimental a menudo consiste en una serie de grabaciones de fuerza sobre soluciones tampón que contienen diferentes concentraciones de Ca2+, la determinación de la cinética de puente cruzado de actina-miosina y la medición de la tensión pasiva de los cardiomiocitos montados a longitudes de sarcomer predefinidas (Figura 1). El aislamiento de cardiomiocitos permeabilizados a partir de muestras miocárdicas congeladas en nitrógeno líquido (y almacenadas posteriormente a -80 oC) es una técnica que utiliza mecánica celular y bioquímica de proteínas para medir la fuerza máxima de Ca2+activada (activa) por área transversal (Tactivo,kN-m-2),Ca2 +Tensión independiente (pasiva) (Tpasiva,kN-m-2), miofilamentos Ca2+-sensibilidad (pCa50),miofilamentos cooperatividad (nHill), la tasa de reurbanización de fuerza (ktr) así como las dependencias de longitud de sarcomere de Tactivo, Tpasivo,pCa50, nHill y ktr.
El objetivo de este protocolo es ilustrar y resumir el potencial del sistema de medición de la fuerza cardiomiocitos como un procedimiento fiable para evaluar las propiedades mecánicas funcionales de los cardiomiocitos de una sola piel aislados de muestras congeladas de diferentes especies.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate disodium salt hydrate (Na2ATP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate (CaCO3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02067.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24720.157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05833.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution (MgCl2 1M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine (BES)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine dissodium salt hydrate (Na2PCr)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.14353.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid (C3H6O2)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.00605.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Squeeze Tube</td>
			<td>Marineland</td>
			<td>31003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tritiplex (EGTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08435.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100 10%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>648463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogeneizer (GKH GT Motor Control)</td>
			<td>Terre Haute Glas-col</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length Controller ( Model 315C-I)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force Transducer (Model 403 A)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ASI 600A</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sotware VSL (Model 900B)</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope (IX51)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes

En este artículo, describimos los pasos necesarios para aislar un solo cardiomiocito permeabilizado ("piel") y conectarlo a un aparato de medición de fuerza y un motor para realizar estudios funcionales. Estos estudios permitirán medir la rigidez cardiomiocitos (fuerza pasiva) y su activación con diferentes soluciones que contienen calcio (Ca2+)para determinar, entre otros: desarrollo de fuerza máxima, sensibilidad a miofilamento Ca2+(pCa50),cooperatividad (nHill) y la tasa de reurbanización de fuerza (ktr). Este método también permite determinar los efectos de los fármacos que actúan directamente sobre los miofilamentos y de la expresión de proteínas recombinantes exógenas en las propiedades activas y pasivas de los cardiomiocitos. Clínicamente, los estudios de cardiomiocitos despellejados ponen de relieve la fisiopatología de muchas enfermedades miocárdicas y permiten la evaluación in vitro del impacto de las intervenciones terapéuticas dirigidas a los miofilamentos. En conjunto, esta técnica permite la clarificación de la fisiopatología cardíaca mediante la investigación de correlaciones entre parámetros in vitro e in vivo en modelos animales y tejido humano obtenido durante la cirugía de corazón abierto o trasplante.

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Este protocolo tiene como objetivo describir paso a paso la técnica de extracción y evaluación de la función cardíaca utilizando cardiomiocitos despellejados. Esta metodología permite la medición y la agudomodulación de la función de miofilamento utilizando pequeñas biopsias congeladas que se pueden recoger de diferentes lugares cardíacos, desde ratones hasta hombres.

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Evaluación ecocardiográfica de la anatomía cardíaca y la función en ratas adultas

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

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Uso de una biopsia química para la evaluación de la calidad del injerto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...