Name: label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

وكان هذا العمل مدعوما بمنحه التحدي الكبير لW.M.O. من معهد ليندا كرانك لمتلازمة داون وببموجب اتفاقيه تعاونيه في داربا 13-34-RTA-FP-007. نود ان نشكر جيسي كورلاند وكيرا كوتزيينو علي مساهماتهم في القراءة والتعليق علي المخطوطة.

<ol>
	<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group.">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li><li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification.">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li><li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+'nonspecific'+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1.">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52 (2015).</li><li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+the+ends:+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7.">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10, 715-721 (2013).</li><li>Bronicki, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+new+cases+further+delineate+the+syndromic+intellectual+disability+phenotype+caused+by+mutations+in+DYRK1A.">Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A.</a> European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).</li><li>Antonarakis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+syndrome+and+the+complexity+of+genome+dosage+imbalance.">Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance.</a> Nature Reviews Genetics. , (2016).</li><li>Dowjat, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy-driven+overexpression+of+DYRK1A+kinase+in+the+brain+of+subjects+with+Down+syndrome.">Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome.</a> Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).</li><li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice.">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li><li>H&#228;mmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb/Dyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development.">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li><li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+MNB/DYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome.">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).</li><li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis.">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAINT:+Probabilistic+scoring+of+affinity+purificationg-mass+spectrometry+data.">SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 8, 70-73 (2011).</li><li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape:+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks.">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li><li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair.">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539 (2019).</li><li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iRefIndex:+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance.">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li><li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance.">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).</li></ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

يوفر سير العمل البروتيني الموضح هنا طريقه فعاله للتعرف علي العوامل البروتينية ذات الثقة العالية للحصول علي بروتين من الفائدة. هذا النهج يقلل من تعقيد العينة من خلال كسر الخلايا الخلوية ويركز علي زيادة الشركاء التفاعل التعرف من خلال اعداد عينه قويه ، دون اتصال عينه تنظيف ، ومراقبه الجودة الصارمة لنظام LC-MS. تحليل البيانات المصب الموصوف هنا يسمح للتقييم الإحصائي البسيط للبروتينات التي تم تحديدها علي انها الطعم. ومع ذلك ، ونظرا للعدد الكبير من المتغيرات التجريبية (المقياس ، وخط الخلية ، واختيار الأجسام المضادة) ، فان كل تجربه تتطلب عمليات قطع مختلفه واعتبارات تتعلق بتصور البيانات وإثراءها.
أول اعتبار للتصميم في تجربه الملكية الفكرية-MS هو اختيار الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها لتجسيد البروتين المثير للاهتمام مع شركائها المتفاعلين. في حين ان توافر الأجسام المضادة التجارية قد اتسع لتغطيه أجزاء أكبر من بروتينيه البشرية علي مدي العقود القليلة الماضية ، لا يزال هناك العديد من البروتينات التي الكواشف محدوده. وعلاوة علي ذلك ، قد تكون الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها للتطبيقات مثل الكشف عن لطخه الغربية غير قادره علي إثراء انتقائي للبروتين المستهدف في تجربه ايمونوبريسيبيتيشن. قبل اجراء تجربه التفاعل البروتيني علي نطاق واسع ، ويقترح لاستكمال الملكية الفكرية من 90 ٪ متموج 10 سم طبق ، أو ما يعادلها رقم الخلية ، والتحقيق للبروتين الهدف من الفائدة الغربية التنقيط. إذا كان أكثر من الأجسام المضادة واحده متاحه لايمونوبريسيبيتيشن, ويقترح بالاضافه إلى ذلك لتحديد الأجسام المضادة المتعددة الاعتراف مرتوب داخل أجزاء مختلفه من البروتين. يمكن ان اوككلودي ربط الأجسام المضادة ببروتين الطعم واجهه الربط اللازمة للشركاء المتفاعلين المفترضين. سيؤدي اختيار الكمية الثانوية للبروتين الطعم إلى زيادة تغطيه التفاعل الذي حددته التجربة المستندة إلى الطيف الكتلي.
ويكمن الاعتبار الرئيسي الثاني في اختيار السيطرة المناسبة للتمييز بين التفاعلات ذات الثقة العالية والتفاعلات المنخفضة الثقة أو غير المحددة من تلك التي تم تحديدها علي انها الطعم. التحكم الأكثر صرامة لتجربه الملكية الفكرية-MS هو لإكمال الايمونوبريسيبيتيشن من خط خليه CRISPR KO من الطعم. مثل هذا التحكم يتيح تحديد وتصفيه من البروتينات غير المحددة التي ترتبط مباشره إلى الأجسام المضادة بدلا من البروتين الطعم. في الحالات التي يكون فيها توليد خط الخلية CRISPR KO من كل البروتين الطعم غير ممكن ، ويمكن استخدام السيطرة مفتش الخرزة من نفس النمط من الأجسام المضادة الطعم. في التجارب التي تستخدم لوحه من الأجسام المضادة التي تمثل أنواع متعددة ، يمكن ان يكون استخدام التحكم بالخرز فقط مناسبا ولكنه سيزيد من معدل الإيجابيات الزائفة التي تم تحديدها كاطراف ذات ثقة عاليه.
يعتمد اختيار خط الخلية المستخدم في تجربه IP-MS علي عده عوامل رئيسيه. يعتمد تعبير البروتين والتعريب إلى حد كبير علي نوع الخلية. بينما [رنا] تعبير تقديرات يستطيع كنت أسست لمعظم مورثات في كثير يشيع يستعمل خليه خطوط, بروتين ارتبطت تعبير بضعف مع [رنا] تعبير وينبغي كنت حددت تجريبيا25. وينبغي تجنب الخطوط الخلوية التي يتم فيها التعبير عن البروتين الطعم في عدد منخفض جدا من النسخ للالتفاف علي المشاكل المرتبطة بالزيادات الحاده في نطاق ثقافة الخلية التي قد تكون مطلوبه. وتجدر الاشاره ، مع ذلك ، ان اعداد العينة يمكن ان يكون الأمثل للكشف عن البروتينات وفره منخفضه جدا. بمساعده فلتر عينه الاعداديه (FASP) الأسلوب ، في حين قويه ، يمكن ان يسبب فقدان أكثر من 50 ٪ من الببتيد في عينه. وتعد عمليه اعداد العينات ذات المرحلة الصلبة المعززة بالطور الواحد (SP3) طريقه فعاله لتوليد العينات لتحليل قياس الطيف الكتلي الذي يقلل من فقدان العينات26. يمكن ان يكون الاسترداد المتزايد الذي تم تمكينه بواسطة أسلوب SP3 لاعداد العينات بديلا مفيدا في سير العمل هذا للقياس الكمي للبروتينات التي تقع بالقرب من حد الكشف.
وقد تم تطبيق هذا العمل بروتينيه عبر العديد من الطعوم النووية, بما في ذلك كيناسيس, E3 اوبيكويتين ligases, والسقالات أعضاء المجمعات متعددة الوحدات الفرعية. علي افتراض التحقق السليم من الكواشف الأجسام المضادة ، فان التنفيذ الناجح لسير العمل هذا سيؤدي إلى الكشف عن شركاء التفاعل النووي البروتين عاليه الثقة للبروتين من الفائدة.

البروتينية البشرية المعارض التنوع الهيكلي والبيوكيميائية واسعه من خلال تشكيل المجمعات المتعددة الوحدات مستقره والتفاعلات البروتين والبروتين عابره. ووفقا لذلك ، فان تحديد الشركاء التفاعل للبروتين من الفائدة مطلوب عاده في التحقيقات لكشف اليه الجزيئية. وقد مكنت التطورات الاخيره في بروتوكولات تنقيه التقارب وظهور أجهزه قياس الطيف الكتلي عاليه الاستبانة من المسح السهل للمناظر الطبيعية للتفاعل البروتيني في تجربه واحده غير متحيزة.
بروتوكولات تفاعل البروتين تستخدم عاده أنظمه التعبير عن الرحم مع ثوابت الانصهار الموسومة التقارب لتحديد التفاعلات البروتين دون الحاجة إلى الأجسام المضادة عاليه الجودة الاعتراف بروتين من الفائدة1,2. ومع ذلك ، فان الأساليب القائمة علي علامات المرمه لها عيوب عديده. التفاعلات الفيزيائية مع المرقد يؤدي إلى الكشف عن البروتينات النحاسية غير المحددة3. بالاضافه إلى ذلك ، فان انصهار هذه العلامات المرطيه إلى N-أو C-الطرفية للبروتين قد يمنع تفاعلات بروتين البروتين الاصليه ، أو يعطل طي البروتين لتعزيز التشكيلات غير الفسيولوجية4. وعلاوة علي ذلك, نظم التعبير عن الرحم عاده overexpress البروتين الطعم في تركيزات سوبرافيسيولوجيكال, التي يمكن ان تؤدي إلى تحديد التفاعلات البروتين المادي, لا سيما بالنسبة للجينات الحساسة للجرعة5. للالتفاف علي هذه القضايا ، يمكن ان إيمونوبريسيبيتاتيد البروتين الطعم الذاتية مع المرتبطة البروتينات فريسه التفاعل ، علي افتراض توافر الأجسام المضادة عاليه الجودة التي تعترف البروتين الأصلي.
المقدمة هنا هو التفاعل البروتينية سير العمل للكشف عن interactome النووية من البروتين الذاتي باستخدام البروتين CMGC كيناز DYRK1A كمثال. تعطيل رقم النسخة الDYRK1Aه ، مستوي النشاط ، أو التعبير يمكن ان يسبب أعاقه ذهنيه شديده في البشر ، والفتك الجنيني في الفئران6،7،8،9. DYRK1A يسلك التنظيم المكاني الديناميكي10، والتفاعلات البروتينية مجزاه11،12، تتطلب نهج قادره علي الكشف عن الشركاء التفاعل منخفضه الوفرة محدده لمقصورات فرعيه مختلفه.
يستخدم هذا البروتوكول التجزئة الخلوية للخلايا البشرية هيلا في الكسور السيتوزول والنيوتوبلاسما ، والايمونوبريسيبيتيشن ، واعداد العينة لقياس الطيف الكتلي ، ونظره عامه علي خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتقييم جوده البيانات وتصور النتائج ، مع نصوص R المقدمة للتحليل والتصور (الشكل 1). حزم البرامج البروتينية المستخدمة في سير العمل هذه كلها متاحه بحريه للتحميل أو يمكن الوصول اليها من خلال واجهه ويب. للحصول علي معلومات اضافيه حول البرامج والأساليب الحسابية ، والدروس المتعمقة والتعليمات المتاحة في الروابط المقدمة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 0.1% EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone (HPLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closure</td>
			<td>Caroline Biological Supply Company</td>
			<td>684239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>887845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa QC tryptic digest</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce homogenizer 7 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885301-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl endopeptidase C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>enzo life sciences</td>
			<td>ALX-350-012-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p84 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88341</td>
			<td>LCMS QC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 spin columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>For mass spectrometry sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0780-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica emitter tip</td>
			<td>Pico TIP</td>
			<td>FS360-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885302-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3787K17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 150, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>Tissue culture dish for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7&#181;m Spherical Hybrid (1.7 &#181;m, 75 &#181;m x 250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007484</td>
			<td>nanoflow C18 column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling

وقد برز مقياس الطيف الكتلي لتنقيه المناعة (IP-MS) كطريقه كميه قويه للتعرف علي تفاعلات البروتين والبروتين. يقدم هذا المنشور التفاعل الكامل بروميكس سير العمل المصممة لتحديد التفاعلات البروتينية البروتين منخفضه الوفرة من النواة التي يمكن أيضا ان تطبق علي مقصورات فرعيه أخرى. يتضمن سير العمل هذا تجزئه الخلايا الفرعية ، والايمونوبريسيبيتيشن ، واعداد العينات ، والتنظيف دون اتصال ، وقياس الطيف الكتلي الخالي من التسمية ، والتحليل الحسابي المصب والتصور المرئي للبيانات. تم تحسين بروتوكولنا للكشف عن التفاعلات المجزاه والمنخفضة الوفرة التي يصعب التعرف عليها من الخلايا الكاملة (علي سبيل المثال ، تفاعلات عامل النسخ في النواة) عن طريق ايمونوبريسيبيتيشن البروتينات الذاتية من مقصورات الخلايا الفرعية مجزاه. خط أنابيب اعداد عينه المبينة هنا يوفر تعليمات مفصله لاعداد استخراج النووية الخلية هيلا ، وتنقيه المناعة من البروتين الطعم الذاتي ، وتحليل الطيف الكتلي الكمي. ونحن نناقش أيضا الاعتبارات المنهجية لأداء الايمونوبريسيبيتيشن واسعه النطاق في التفاعل القائم علي الطيف الطيفي التجارب وتوفير المبادئ التوجيهية لتقييم جوده البيانات لتمييز البروتين الإيجابي الحقيقي تفاعلات من تفاعلات غير محدده. ويتجلى هذا النهج هنا من خلال التحقيق في التفاعل النووي لل CMGC كيناز, DYRK1A, بروتين كيناز منخفضه الوفرة مع التعاملات المحددة بشكل سيئ داخل النواة.

معظم كتله البروتين المحددة في تجربه الملكية الفكرية-MS يتكون من البروتينات غير محدده. التالي ، فان أحد التحديات الرئيسية لتجربه الملكية الفكرية-MS هو تفسير البروتينات التي هي الجهات الفاعلة ذات الثقة العالية مقابل الجهات المشتركة غير المحددة. لإظهار المعلمات الحاسمة المستخدمة في تقييم جوده البيانات حللت الدراسة ثلاثية الإيمونوبريسيبيتيشنز من 5 ملغ من الاستخراج النووي هيلا باستخدام حبه السيطرة فقط. الاختيار الداخلي الأول للتاكد من ان تجربه الملكية الفكرية-MS هو موثوق به هو ما إذا كان البروتين الطعم باعتبارها واحده من اعلي البروتينات المخصب التي حددتها كل من اضعاف التغيير علي السيطرة واحتمال سانت. في هذه الحالة ، صنفت DYRK1A الطعم بين البروتينات الثلاثة الأكثر ثراء علي التحكم (الشكل 2 ا،ب). في دراسة التفاعلات النووية DYRK1A استخدام أربعه أجسام مضاده مستقله ، وقطع FC-A من > 3.00 و SAINT احتمال قطع > 0.7 قدمت قطع صارمة لتحديد كل من الجهات الفاعلة الرواية والمصادق عليها سابقا22. وعند تطبيقها علي هذه التجربة ، يمكن النظر إلى فصل واضح بين الجهات الفاعلة ذات الثقة العالية وال> 95 في المائة من البروتينات التي تعرف بأنها غير محدده (الشكل 2 ا،ب). تطبيق كل من الإثراء تغيير اضعاف وعتبه الاحتمال يزيد التقشف من خلال المطالبة بإثراء عاليه باستمرار من معرفات البروتين عبر البيولوجية ونسخ متماثلة.
الاضافه إلى التهديف الإحصائي ، فان سير عمل تحليل الكراسوم أيضا يرسم التفاعلات المبلغ عنها سابقا علي بيانات الطعم الجارح23. بالنسبة لDYRK1A المثال لمجموعه البيانات ، كانت قيم iREF البينية FC-A منخفضه مثل 0.45 ، مما يمثل إثراء منخفضا جدا فوق التحكم (الشكل 2C). ولتجنب التضخم في الإيجابيات الزائفة ، ينبغي اجراء الدرس الإحصائي بطريقه تعطي الاولويه للحد من السلبيات الزائفة. وتجدر الاشاره إلى ان الكشف عن هذه التفاعلات كان مستقلا عن وفره البروتين (الشكل 2 ج). اظهر رقم النسخة المطلقة المحسوب لكل تفاعل iREF داخل خلايا هيلا عدم وجود ارتباط لمستويات الكشف عن شريك التفاعل بواسطة IP-MS24.
Cytoscape بمثابه أداه فعاله لتصور طبقات متعددة من البيانات التفاعل19. في DYRK1A ايمونوبريسيبيتيشن التجربة الموصوفة هنا ، والجمع بين استخدام FC-A > 3.0 و SAINT > 0.9 خفضت قائمه الجهات الفاعلة عاليه الثقة إلى سته بروتينات (الشكل 2D). ومع ذلك ، عند تطبيق قطع FC-A من > 3.0 في عزله ، أضيفت ثمانيه بروتينات اضافيه إلى الشبكة. ولهذه العوامل البروتينية الاضافيه اتصالات عاليه مع الجهات المشتركة بالفعل في الشبكة ، مما يوحي بأنها مرتبطة بالمجمعات المتشابهة أو الأدوار الوظيفية. وتحقيقا لهذه الغاية ، أدمجت الادله المستمدة من سلسله ديسيبل من تفاعلات البروتين والبروتين في هذه الشبكة بالخطوط الزرقاء المتقطعة20. في حين ان هذا الطعم الواحد ، تجربه ثلاثية النسخ يوفر عينه محدوده من شبكه التفاعل DYRK1A الكاملة ، واستخدام الطعوم اضافيه ، وتكرارات ، ودمج مجموعات البيانات العامة الكبيرة يمكن استخدامها لتوسيع شبكه التفاعلات عاليه الثقة. التالي فان التخفيضات الاحصائيه ستكون محدده لكل تجربه علي حده ، سيتعين تقييمها بدقه.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg"> الشكل 1: سير العمل البروتيني التمثيلي لخليه الملكية الفكرية الفرعية-MS. تزرع الخلايا اما في قوارير القاع المستديرة 4 لتر أو في الاطباق المزروعة بالانسجه بطول 15 سم وتحصد في نفس الوقت لتفتيتها تحت الخلوي. يتم تجزئه الخلايا إلى الخلوية ، والنووية ، وبيليه النووية ، ويتم إيمونوبريسيبيتيشنز من 1 − 10 ملغ من محلله النووية باستخدام واحد أو الأجسام المضادة المتعددة الاعتراف بنفس الطعم. يتم تنفيذ الاعداديه عينه بمساعده تصفيه (FASP) وتنظيف العينة دون اتصال قبل القياس الطيفي الكتلة طلقه واحده. يتم استخدام خط أنابيب الحوسبة المتلقيين للمعلومات لمعالجه البيانات في بيانات تفاعل التفسير. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg"> الشكل 2: البيانات التمثيلية لتجربه الأجسام المضادة للأجسام أحاديه الطعم الوحيدة. (ا) الناتج FC-a و st احتمال من سير العمل تحليل كرابمي لتجربه مثلي باستخدام الأجسام المضادة واحده لDYRK1A كيناز (ن = 3). واستخدمت وحدات التحكم الخرز فقط للمقارنة. خطوط الصلبة الحمراء تمثل القطع التي تم تعيينها في FC-A > 3.00 والقديس > 0.7. (ب) وتقديرات وفره البروتين maxquant (iBAQ) الناتج مقابل log2 نسبه وفره البروتين في DYRK1A IP للسيطرة ، والملونة من قبل مجموعه القيمة p المعدلة من تحليل bayes التجريبية لكثافة خاليه من التسمية. (ج) عدد البروتينات المدرجة كبروتينات متفاعلة في قاعده بيانات iref23،24. (د) التصور شبكه Cytoscape من الجهات المشتركة DYRK1A. العقد الأزرق = FC-A > 3.00 ، > SAINT 0.7. العقد البرتقالي = FC-A > 3.00. الحواف السوداء = البروتينات التي تم تحديدها كعناصر بينيه في تجربه IPMS. الأزرق حافه متقطعه = سانت التفاعل بين البروتين فريسه (الثقة > 150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">المثبط البروتياز (PI) الخليط</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>الصوديوم Metabisulfite</td>
			<td>1 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>بنزاميدين</td>
			<td>1 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>ديثيوثريتول (DTT)</td>
			<td>1 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>فلوريد فينيلميثانسيولفونيل (PMSF)</td>
			<td>0.25 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">الفوسفاتيز مثبط (PhI) الخليط</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>ميكروسيستن LR</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>الصوديوم اورمونوفاتي</td>
			<td>0.1 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>فلوريد الصوديوم</td>
			<td>5 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">المخازن المؤقتة لتجزئه الخلايا الفرعية:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">العازلة درجه الحموضة 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>حبيس</td>
			<td>10 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>بوكل</td>
			<td>10 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">العازلة B pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>حبيس</td>
			<td>20 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>كلوريد</td>
			<td>420 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>حمض ايثيلنديدياتيتاياستيك (أدتا)</td>
			<td>0.4 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>الجلسرين</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">العازلة C pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>حبيس</td>
			<td>20 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>بوكل</td>
			<td>100 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>حمض ايثيلنديدياتيتاياستيك (أدتا)</td>
			<td>0.4 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>الجلسرين</td>
			<td>20 في المائة (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ايمونوبريسيبيتيشن المخازن المؤقتة:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">المخزن المؤقت IP 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>حبيس</td>
			<td>20 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>بوكل</td>
			<td>150 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0.1 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>الجلسرين</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">المخزن المؤقت IP 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>حبيس</td>
			<td>20 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>بوكل</td>
			<td>500 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0.1 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>الجلسرين</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS العازلة pH 8.5 الدرجة الحموضة</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحزب الديمقراطي الصربي</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>كلورواسيتاميد</td>
			<td>40 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>TCEP</td>
			<td>10 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td>تريس</td>
			<td>100 مم</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>كاشف</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>اليوريا</td>
			<td>8 م</td>
		</tr>
<tr>
<td>تريس</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* استخدام HPLC الصف H2O</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: تركيبات عازله
ملفات الترميز الاضافيه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

وصف هو سير العمل البروتيني لتحديد الشركاء تفاعل البروتين من كسر الخلوية النووية باستخدام التخصيب المناعي للبروتين معين من الفائدة والطيف الكتلة خاليه من التسمية. يتضمن سير العمل التجزئة الخلوية ، والايمونوبريسيبيتيشن ، واعداد العينة بمساعده الفلتر ، والتنظيف دون اتصال ، وقياس الطيف الكتلي ، وخط أنابيب المعلوماتية الحيوية المصب.

التسمية خاليه ايمونوبريسيبيتيشن الطيف الطيفي سير العمل لتحديد المواقع النووية علي نطاق واسع التنميط

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

هذا سير عمل البروتيوميكس تمكن من تحديد غير متحيز ورسم خرائط لتفاعلات البروتين البروتينية الذاتية مع الدقة دون الخلوية. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عند التحقيق في بروتينات الطعم التي هي الجرعة الحساسة, وفرة منخفضة, أو يكون لها تعريبات متعددة دون الخلوية. يمكن تطبيق هذه الطريقة لرسم خرائط تفاعلات البروتين الذاتية على افتراض وجود كاشف تقارب مناسب متاح.وهذا أمر مهم بشكل خاص بالنسبة للعديد من الآلاف من البروتينات التي لها وظيفة غير معروفة ، وكثير منها مرتبط بمرض بشري. يمكن تكييف هذه الطريقة مع أي خط الخلية أو الأنسجة القابلة للكسر تحت الخلية. يمكن استهداف أي بروتين مع كاشف تقارب مناسب.والنتيجة الشائعة لتجارب تنقية التقارب هي في كثير من الأحيان لا توجد نتيجة. الكواشف جيدة حقا، وجمع بيانات مراقبة الجودة في جميع أنحاء، والحد من التعامل مع العينة كلها مهمة حقا. اعلم أن لديك عينة.للبدء، ذوبان الكريات الخلية المعدة لمدة 15 دقيقة في 1X حجم بيليه من المخزن المؤقت البارد A مع مثبطات البروتياز أو مثبطات الفوسفاتاز. وضع أنبوب يحتوي على بيليه الخلية على nutator في أربع درجات مئوية للمساعدة في إعادة النيوسيون لمدة 30 دقيقة. ثم ضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي عند 2000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق إلى بيليه.decant فائقة و resuspend الخلايا مع 5X حجم الخلية معبأة مع العازلة A.Incubate على الجليد لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، بيليه مرة أخرى في 2،000 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. Decant العازلة و resuspend مع 2X الأصلي تخزين الخلية المخزن المؤقت A مع مثبطات البروتياز أو مثبطات فوسفاتاز.Dounce حوالي سبع مرات مع الآفة فضفاضة A.Centrifuge لlysate لمدة 10 دقيقة في 2، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية. نقل بعناية فائقة إلى أنبوب جديد وفلاش تجميده مع النيتروجين السائل. تخزين ال ليسات في ناقص 80 درجة مئوية.Resuspend بيليه مع 0.9X حجم بيليه من العازلة B مع مثبطات البروتياز أو مثبطات الفوسفاتاز ومزيج على nutator لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. لlyslyse النوى ، dounce 20 مرة مع titer pestle B.Mix الليسات النووية على nutator لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية بحيث يكون متجانسا. ثم الطرد المركزي النووي لمدة 30 دقيقة في 21،000 مرة ز في أربع درجات مئوية.الماصات قبالة مُندفع ويُحفظ كمستخرج بروتين نووي قابل للذوبان. لـ dialyze استخراج النووية القابلة للذوبان، قطع أولا طول مناسب من 24 ملليمتر عرض أنابيب غسيل الكلى مع قطع الوزن الجزيئي 8 كيلودالتون. المشبك جانب واحد من الأنابيب وتحميل النوى في الأنابيب.بعد تحميل lysate، المشبك الطرف الآخر وغمر في وعاء زجاجي نظيف يحتوي على العازلة C مع مثبطات البروتياز. دياليزي لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية. بعد ذلك، نقل النووي استخراج النووية dialyzed استخراج nucleoplasm في أنبوب والطرد المركزي في 21،000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.نقل ثلاثة 20 ميكرولتر aliquots من استخراج النووية إلى أنابيب جديدة microcentrifuge للتحقق من تجزئة بواسطة لطخة الغربية. باستخدام نصائح الماصات التي تم قطعها في الطرف، وإعداد بروتين A / G خليط حبة لكل تكرار من خلال الجمع بين 12.5 حجم حبة ميكرولتر من البروتين A Sepharose مع 12.5 ميكرولترات من البروتين G Sepharose في أنابيب microcentrifuge. غسل البروتين A / G خليط حبة مرتين مع 300 ميكرولترات من IP العازلة I.Spin الخرز في 1، 500 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة وdedeant العازلة.المقبل، وإعداد البروتين المضادة A / G الخرز. لربط الأجسام المضادة إلى الخرز، إضافة إلى أنبوب 300 ميكرولترات من IP العازلة I و 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة المطلوبة. السماح لخليط الايضاح حبة الصخور على nutator في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.الآن aliquot وحدات التخزين المناسبة من lysates النووية في انخفاض الاحتفاظ أنابيب microcentrifuge لميغرام واحد من البروتين المدخلات لكل تكرار. تدور في lysate 16، 000 مرات ز لمدة 30 دقيقة ونقل sunatant إلى أنبوب جديد. إضافة ميكرولتر واحد من Benzonase في 250 وحدة لكل ميكرولتر لكل ملليغرام من lysate النووية والصخور على nutator في أربع درجات مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة.لإعداد الخرز لتطهير ما قبل lysate، إضافة 12.5 ميكرولترات من كل بروتين A والبروتين G الخرز إلى 1.5 ملليلتر أنابيب الاحتفاظ منخفضة. غسل مرتين مع IP غسل العازلة الأول مع مثبطات البروتياز. Decant العازلة وإضافة ملليغرام واحد من lysate النووية المعدة إلى الخرز.احتضان بينما هزاز على nutator لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي مسح مسبقا في 1، 500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. ثم غسل بروتين الأجسام المضادة A أو G الخرز مرتين مع IP العازلة أنا مع مثبطات البروتياز.بعد الطرد المركزي في 1، 500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة، decant العازلة. الآن نقل lysate النووية تطهيرها مسبقا على بروتين الأجسام المضادة A أو G الخرز. احتضان بينما هزاز على nutator في أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات.وبعد الحضانة، أجهزة الطرد المركزي في 1،500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. نقل المابير إلى أنابيب المسمى كتدفق من خلال لكل تكرار. غسل البروتين المضادة أ أو G الخرز أربع مرات مع ملليلتر واحد من IP العازلة الثاني مع مثبطات البروتياز.ثم غسل الخرز مرتين مع ملليلتر واحد من IP العازلة أنا مع مثبطات البروتياز. تأكد من إزالة كل العازلة بعد الغسيل الماضي. بروتين Elute قبالة الخرز عن طريق احتضان مع 20 ميكرولترات من 0.1 جليسين المول في 2.75 pH لكل لمدة 30 دقيقة على nutator.ثم تدور في 750 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة والماصة قبالة supernatant. كرر هذه الحضانة مع عازلة elution للمرة الثانية. بعد إعداد بيليه البروتين، resuspend مع 30 ميكرولترات من المخزن المؤقت alkylation SDS.احتضان العينة على كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم ندعه يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. إضافة 300 ملليلتر من حل UA و 30 ميكرولترات من TCEP 100 ملليمولار لكل عينة.قم بتحميل الحل على فلتر الطرد المركزي 30K. بعد الغزل فلتر الطرد المركزي في 21، 000 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، والحفاظ على تدفق من خلال في حالة وجود مشكلة مع مرشح. بعد غسل المرشح وفقا للمخطوطة، إضافة ثلاثة ميكرولترات من ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر lyse C resuspended في 0.1 المول تريس pH 8.5.ملء المرشحات تصل إلى علامة 100 ميكرولتر مع 0.1 مُلَسِسِس 8.5. السماح له الهضم لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية في حين هزاز على nutator. المقبل، إضافة ميكرولتر واحد من ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر MS الصف التربسين.مزيج بلطف والسماح للتريبسين لاحتضان مع عينة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حين هزاز على nutator. في الصباح، الطرد المركزي عدة مرات في 21،000 مرات ز لمدة 20 دقيقة لlute الببتيدات من المرشح إلى أنبوب الاستبقاء المنخفضة نظيفة microcentrifuge. بعد إزالة الببتيدات باستخدام الأعمدة تدور C18، resuspend الببتيدات الlyophilized في سبع ميكروليترات من 0.1٪ TFA في 5٪ الأسيتونتريل.سونيكات العينة لمدة ثلاث دقائق لضمان أن الببتيدات قد تم إعادة تعليق، ثم تدور أسفل في 14، 000 مرات ز لمدة 10 دقائق. تحميل 15 إلى 30٪ من العينة على نظام قياس الطيف الكتلي اللوني السائل للتحليل. في هذه الدراسة، تم تحليل التحلل المناعي ثلاثية التخصصات من خمسة ملليغرام من استخراج HeLa النووي باستخدام عنصر تحكم حبة فقط.الطعم DYRK1A في المرتبة بين البروتينات الثلاثة العليا المخصب على السيطرة مما يدل على إجراء IP-MS التجربة كان موثوقا بها. وقد تبين فصل واضح بين التفاعلات الثقة العالية وأكبر من 95٪ من البروتينات المشتركة تم تحديدها على أنها غير محددة. على سبيل المثال DYRK1A مجموعة البيانات، قدم شركاء التفاعل IREF قيم FC-A منخفضة كـ 0.45 تمثل إثراء منخفض جداً على التحكم.وبناء على ذلك، فإن العديد من هذه التفاعلات التي تم الإبلاغ عنها سابقاً هي سلبيات زائفة داخل مجموعة البيانات هذه من خلال الانخفاض تحت عتبة FC-A وهي ثلاثة. لم يظهر عدد النسخ المطلق المحسوب لكل تفاعل IREF أي ارتباط بمستويات الكشف عن أحد شركاء التفاعل بواسطة IP-MS. الاستخدام المشترك لـ FC-A أكبر من ثلاثة والقديس أكبر من 0.9 قلل من قائمة المتفاعلين عالية الثقة إلى ستة بروتينات.ومع ذلك، عند تطبيق قطع FC-A من أكبر من ثلاثة في عزلة، تمت إضافة ثمانية بروتينات إضافية إلى الشبكة. الجزء الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو اختيار كاشف الأجسام المضادة للمناعة. ويوصى لطخة الغربية أو Coomassie التحقق من الانتقائية قبل الانتهاء من هذا العمل.يمكن أن يكون الدليل الداعم للتفاعلات البروتينية والبروتينية من النشاف الغربي المشترك للملكية الفكرية من المتفاعلين المحددين. البروتين الكيميائية عبر الربط ، على الرغم من أكثر تعقيدا ، يمكن أن تكشف عن مجالات التفاعل من interactors. باستخدام هذه الطريقة ، كشفت مجموعتي البحثية وظائف جديدة لDYRK1A ، وهو كيناز بروتيني مطلوب لتنمية الدماغ الثدييات ويرتبط بالأمراض العصبية لمرض الزهايمر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

بروتوكول الدوس خطوة بخطوة لزيادة الإنتاجية في مقالات GPCR المستندة إلى المعاوقة الخالية من التسميات

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...