Name: label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af en stor udfordring Grant til W.M.O. fra Linda Crnic Institute for down Syndrome og af en DARPA samarbejdsaftale 13-34-RTA-FP-007. Vi vil gerne takke Jesse Kurland og Kira Cozzolino for deres bidrag i læsning og kommentering på manuskriptet.

<ol>
	<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group.">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li><li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification.">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li><li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+'nonspecific'+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1.">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52 (2015).</li><li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+the+ends:+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7.">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10, 715-721 (2013).</li><li>Bronicki, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+new+cases+further+delineate+the+syndromic+intellectual+disability+phenotype+caused+by+mutations+in+DYRK1A.">Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A.</a> European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).</li><li>Antonarakis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+syndrome+and+the+complexity+of+genome+dosage+imbalance.">Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance.</a> Nature Reviews Genetics. , (2016).</li><li>Dowjat, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy-driven+overexpression+of+DYRK1A+kinase+in+the+brain+of+subjects+with+Down+syndrome.">Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome.</a> Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).</li><li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice.">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li><li>H&#228;mmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb/Dyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development.">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li><li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+MNB/DYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome.">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).</li><li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis.">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAINT:+Probabilistic+scoring+of+affinity+purificationg-mass+spectrometry+data.">SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 8, 70-73 (2011).</li><li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape:+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks.">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li><li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair.">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539 (2019).</li><li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iRefIndex:+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance.">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li><li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance.">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den proteomics workflow skitseret her giver en effektiv metode til at identificere høj-tillid protein eksterne for et protein af interesse. Denne fremgangsmåde mindsker kompleksiteten af eksemplet gennem subcellulære brøk og fokuserer på at øge identifikations interaktions partnerne gennem robust prøveforberedelse, offline prøve oprydning og streng kvalitetskontrol af LC-MS-systemet. Den analyse af downstream-data, der beskrives her, giver mulighed for en simpel statistisk vurdering af de proteiner, der identificeres som kopurificerende med agn. Men på grund af et stort antal eksperimentelle variabler (skala, cellelinje, antistof valg), hvert eksperiment kræver forskellige cutoffs og overvejelser vedrørende datavisualisering og berigelse.
Det første design overvejelse i et IP-MS eksperiment er udvælgelsen af antistoffer, der vil blive anvendt til copurifikation af det protein af interesse sammen med sine interagerende partnere. Mens tilgængeligheden af kommercielle antistoffer er udvidet til at dække større dele af den menneskelige proteom i løbet af de sidste mange årtier, er der stadig mange proteiner, for hvilke reagenser er begrænset. Desuden kan antistoffer, der er blevet valideret til applikationer såsom Western blot detektion, være ude af stand til selektiv berigelse af målproteinet i et immunopcipitation eksperiment. Forud for gennemførelsen af en storstilet interaktion proteomics eksperiment, foreslås det at fuldføre en IP fra en 90% flydende 10 cm parabol, eller tilsvarende celle nummer, og sonde for målet protein af interesse ved vestlige blotting. Hvis der er mere end et enkelt antistof til rådighed for immunopræcipitation, foreslås det desuden at vælge flere antistoffer, der genkender epitoper inden for forskellige dele af proteinet. Binding af et antistof til et lokkemad kan indbinde den nødvendige bindende grænseflade for formodede interagerende partnere. Udvælgelse af en sekundær epitop for agn protein vil øge dækningen af interaktionsprofilen identificeret ved en massespektrometri-baseret eksperiment.
En anden større overvejelse ligger i udvælgelsen af passende kontrol for at skelne høj-tillid interaktioner fra lav-tillid eller uspecifikke interaktioner fra dem, der identificeres som copurificerende med agn. Den strengeste kontrol for et IP-MS-eksperiment er at fuldføre chromatinimmunpræcipitation fra en crispr ko cellelinje af agn. En sådan kontrol muliggør identifikation og filtrering af ikke-specifikke proteiner, der binder direkte til antistoffet i stedet for agn proteinet. I tilfælde, hvor det ikke er muligt at generere en CRISPR KO-cellelinje af hvert lokkemad, kan der anvendes en IgG-perle kontrol af samme isotype af agn-antistoffet. I eksperimenter med et panel af antistoffer, der repræsenterer flere arter, kan brugen af en perler kun kontrol være passende, men vil øge antallet af falske positiver identificeret som høj-tillid Interactors.
Udvælgelsen af den cellelinje, der anvendes i et IP-MS-eksperiment, afhænger af flere nøglefaktorer. Protein ekspression og lokalisering er i høj grad afhængig af celletype. Mens RNA-udtryks estimater kan findes for de fleste gener i mange almindeligt anvendte cellelinjer, er protein ekspression dårligt korreleret med RNA-udtryk og skal bestemmes eksperimentelt25. Cellelinjer, hvor en agn protein udtrykkes i meget lav kopi nummer bør undgås at omgå problemer i forbindelse med drastiske stigninger i cellekultur skala, der kan være påkrævet. Det skal dog bemærkes, at prøveforberedelse kan optimeres til påvisning af meget lave forekomst proteiner. Den filter Aided prøve prep (FASP) metode, mens robust, kan forårsage en mere end 50% tab af peptid i en prøve. Single-pot solid-fase-forstærket Prøveforberedelse (SP3) er en effektiv metode til at generere prøver til massespektrometri analyse, der minimerer Sample tab26. Den forøgede opsving aktiveret af den SP3 metode i prøveforberedelse kan en nyttig alternativ i indeværende arbejdsgang nemlig kvantificering i proteiner at falde i nærheden af den grænse i opdagelse.
Denne proteomics workflow er blevet anvendt på tværs af mange nukleare lokturer, herunder kinaser, E3 ubiquitin ligaser, og stilladser medlemmer af multisubunit komplekser. Forudsat korrekt validering af antistof reagenser, vellykket udførelse af denne arbejdsgang vil resultere i påvisning af høj-tillid protein nukleare interaktion partnere for et protein af interesse.

Den menneskelige proteom udviser stor strukturel og biokemisk diversitet gennem dannelsen af stabile multisubunit komplekser og forbigående protein-protein interaktioner. Derfor er det almindeligt nødvendigt at identificere interaktions partnere for et protein af interesse i undersøgelser for at afdække molekyl mekanismen. Nylige fremskridt inden for affinitets rensning protokoller og fremkomsten af høj opløsning hurtig scanning massespektrometri instrumentering har gjort det muligt let kortlægning af protein interaktion landskaber i en enkelt upartisk eksperiment.
Protein interaktions protokoller anvender almindeligvis ektopiske udtryks systemer med affinitets mærkede fusions konstruktioner til at identificere protein interaktioner uden at kræve antistoffer af høj kvalitet, der genkender et protein af interesse1,2. Men, epitop tag-baserede metoder har flere ulemper. Fysiske interaktioner med epitop kan føre til påvisning af ikke-specifikke copurificerende proteiner3. Desuden kan fusion af disse epitop Tags til N-eller C-terminalen af et protein blokere indfødte protein-protein interaktioner, eller forstyrre proteinfoldning at fremme ikke-fysiologiske konstellationer4. Desuden overudtrykker ektopisk-udtryks systemer typisk agn-proteinet ved suprafysiologiske koncentrationer, hvilket kan resultere i identifikation af kunstige protein interaktioner, især for doserings følsomme gener5. For at omgå disse problemer, kan den endogene agn protein være immunoprecipitated sammen med tilhørende interagerende bytte proteiner, forudsat tilgængeligheden af en høj kvalitet antistof, der genkender den indfødte protein.
Forudsat her er en interaktion proteomics workflow for påvisning af nukleare interactome af et endogene protein ved hjælp af CMGC protein kinase DYRK1A som et eksempel. Afbrydelse af DYRK1A kopi nummer, aktivitetsniveau, eller udtryk kan forårsage alvorlige intellektuelle handicap hos mennesker, og embryonale dødelighed i mus6,7,8,9. DYRK1A udstiller dynamisk spatiotemporale regel10, og opdelte protein interaktioner11,12, der kræver tilgange i stand til at detektere lav overflod interaktions partnere specifikke for forskellige subcellulære rum.
Denne protokol anvender cellulær fraktionering af humane HeLa-celler til cytosol og nucleoplasma fraktioner, immunopræcipitation, prøveforberedelse til massespektrometri og en oversigt over en bioinformatisk pipeline til evaluering af datakvalitet og visualisering af resultater, med R-scripts til analyse og visualisering (figur 1). Proteomics softwarepakker, der anvendes i dette workflow er alle frit tilgængelige for download eller kan tilgås via en web-grænseflade. For yderligere information om software og beregningsmæssige metoder, dybdegående tutorials og instruktion er tilgængelige på de medfølgende links.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 0.1% EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone (HPLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closure</td>
			<td>Caroline Biological Supply Company</td>
			<td>684239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>887845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa QC tryptic digest</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce homogenizer 7 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885301-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl endopeptidase C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>enzo life sciences</td>
			<td>ALX-350-012-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p84 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88341</td>
			<td>LCMS QC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 spin columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>For mass spectrometry sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0780-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica emitter tip</td>
			<td>Pico TIP</td>
			<td>FS360-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885302-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3787K17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 150, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>Tissue culture dish for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7&#181;m Spherical Hybrid (1.7 &#181;m, 75 &#181;m x 250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007484</td>
			<td>nanoflow C18 column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling

Immun affinitet rensning massespektrometri (IP-MS) er dukket op som en robust kvantitativ metode til at identificere protein-protein interaktioner. Denne publikation præsenterer en komplet interaktion proteomics workflow designet til at identificere lav overflod protein-protein interaktioner fra kernen, der også kunne anvendes til andre subcellulære rum. Denne arbejdsgang omfatter subcellulære fraktionering, immunoprecipitation, prøveforberedelse, offline oprydning, enkelt skudt label-fri massespektrometri, og downstream beregningsmæssige analyse og datavisualisering. Vores protokol er optimeret til påvisning af opdelte, lave overflod interaktioner, der er svære at identificere fra hele celle lysater (f. eks. transkriptionsfaktor interaktioner i kernen) ved immunopræcipitation af endogene proteiner fra fraktionerede subcellulære rum. Prøve forberedelses rørledningen skitseret her giver detaljerede instruktioner til fremstilling af HeLa celle nukleare ekstrakt, immun affinitet rensning af endogene agn protein, og kvantitativ massespektrometri analyse. Vi diskuterer også metodologiske overvejelser for at udføre storstilet immunopræcipitation i massespektrometri-baserede interaktions profilerings eksperimenter og giver retningslinjer for evaluering af datakvaliteten for at skelne ægte positivt protein interaktioner fra ikke-specifikke interaktioner. Denne fremgangsmåde er påvist her ved at undersøge den nukleare interactome af CMGC kinase, DYRK1A, en lav forekomst protein kinase med dårligt definerede interaktioner i kernen.

Størstedelen af den proteinmasse, der identificeres i et IP-MS-eksperiment, består af ikke-specifikke proteiner. En af de vigtigste udfordringer i et IP-MS-eksperiment er således fortolkningen af, hvilke proteiner der er højt tillidsskabende mellem aktører og ikke-specifikke interaktører. For at demonstrere de afgørende parametre, der anvendes i evalueringen af datakvalitet undersøgelsen analyserede tre eksemplarer immunoprecipitationer fra 5 mg Hela nukleare ekstrakt udnytter en perle kun kontrol. Den første interne kontrol for at sikre, at et IP-MS-eksperiment er pålideligt, er, om agn proteinet rangerer som et af de højest berigede proteiner, der identificeres ved begge fold-Skift over kontrol og HELGEN sandsynlighed. I dette tilfælde, agn DYRK1A rangeret blandt de tre bedste beriget proteiner over kontrol (figur 2a,B). I en nuklear interactome undersøgelse af DYRK1A udnytter fire uafhængige antistoffer, en FC-en cutoff af > 3.00 og Saint sandsynlighed cutoff > 0,7 leverede en streng cutoff til identifikation af både roman og tidligere validerede eksterne22. Ved anvendelse af dette eksperiment kunne der ses en klar adskillelse mellem de højt tillidsskabende interaktører og > 95% af de kopurificerede proteiner, som er identificeret som uspecifikke (figur 2a,B). Anvendelse af både en fold ændring berigelse og sandsynlighed tærskel øger strenghed ved at kræve en konsekvent høj berigelse af protein IDs på tværs af biologiske replikater.
Ud over statistisk scoring knytter CRAPome-analyse arbejdsgangen også tidligere rapporterede interaktioner til Bait-Prey-data23. Mens denne kortlægning kan være nyttig for tærskel høj og lav-tillid interaktioner, tidligere rapporterede interaktioner kan score dårligt af FC-A og Saint sandsynligheder, potentielt indikerer, at mange kendte interaktioner af en given agn kan eksistere kun i specifikke celletyper, sammenhænge, eller organelles. For eksempel DYRK1A DataSet var iREF interactor FC-A-værdierne så lave som 0,45, hvilket repræsenterer en meget lav berigelse over kontrol (figur 2c). For at undgå inflation af falske positiver bør statistisk tærskel udføres på en måde, der prioriterer strenghed over reduktion af falske negativer. Det skal bemærkes, at påvisning af disse interaktioner var uafhængig af protein overflod (figur 2c). Det beregnede absolutte kopi nummer for hver iREF-interaktion i HeLa-cellerne viste ingen korrelation til detekterings niveauerne for en interaktions partner af IP-MS24.
Cytoscape fungerer som et effektivt værktøj til visualisering af flere lag af interaktionsdata19. I det DYRK1A-eksperiment, der er beskrevet her, reducerede den kombinerede anvendelse af FC-A > 3,0 og Saint > 0,9 listen over eksterne med høj sikkerhed til seks proteiner (figur 2D). Men ved anvendelse af en FC-en cutoff af > 3,0 isoleret, blev yderligere otte proteiner føjet til netværket. Disse yderligere protein eksterne har høj konnektivitet med de eksterne allerede i netværket, hvilket tyder på de er forbundet i lignende komplekser eller funktionelle roller. Til dette formål blev dokumentation fra STRENGEN-DB af protein-protein interaktioner integreret i dette netværk som blå stiplede linjer20. Mens denne single-agn, tre eksemplarer eksperiment giver en begrænset stikprøve af den fulde DYRK1A interaktion netværk, brug af yderligere lokkemad, replikater, og integration af store offentlige datasæt kan bruges til at udvide netværket af høj-tillid interaktioner. De statistiske nedskæringer vil således være specifikke for hvert enkelt eksperiment og skal evalueres grundigt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg"> Figur 1: repræsentative proteomics workflow for subcellulære IP-MS. Celler dyrkes i enten 4 L runde nederste kolber eller 15 cm væv kultur retter og høstes på samme tid for subcellulære fraktionering. Celler er fraktioneret til en cytosolic, nuklear, og en nuklear pellet, og immunopræcipitationer er udført fra 1 − 10 mg af nukleare lysat ved hjælp af en eller flere antistoffer genkende den samme agn. Filter Aided Sample prep (FASP) og offline prøve oprydning udføres før Single Shot massespektrometri. En downstream-beregnings pipeline bruges til at behandle data i interaktionsdata, der kan fortolkes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg"> Figur 2: repræsentative data for et enkelt-antistof-IP-MS-eksperiment med én agn. A) FC-A-og Saint-Sandsynligheds udgang fra arbejdsgangen for CRAPome-analyse for et optimalt eksperiment med et enkelt antistof for KINASE DYRK1A (n = 3). Perler-kun kontrol blev brugt til sammenligning. Red solid Lines repræsenterer cutoffs sat i FC-A > 3,00 og SAINT > 0,7. B) estimater for maxquant protein tæthed (iBAQ)-output vs. LOG2 forholdet mellem protein tæthed i DYRK1A IP til kontrol, farvet af den justerede p-værdi spænder fra empirisk Bayes-analyse af de etiket frie intensiteter. C) FC-A og anslået kopiantal af proteiner, der er opført som interagerende proteiner i iref-databasen23,24. (D) Cytoscape netværks visualisering af DYRK1A Interactors. Blue nodes = FC-A > 3,00, Sankt > 0,7. Orange noder = FC-A > 3,00. Sorte kanter = proteiner identificeret som eksterne i ipms eksperiment. Blå stiplet kant = SAINT interaktion mellem Prey protein (tillid >. 150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Blanding af proteasehæmmer (PI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriummetabisulfit</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Benzamidin</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF)</td>
			<td>0,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Blanding af fosfatasehæmmer (PhI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microcystin LR</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumorthovanadat</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfluorid</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Subcellulære fraktionerings buffere:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffer A pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffer B pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffer C pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffere med immunopræcipitation:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP-buffer 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP-buffer 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS Alkylerings buffer pH 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sds</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chloracetamid</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>TCEP</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Urinstof</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>0,1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* Brug HPLC grade H2O</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: buffer sammensætninger
Supplerende kodnings filer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Beskrevet er en proteomics workflow for at identificere protein interaktion partnere fra en nuklear subcellulære fraktion ved hjælp af immun affinitet berigelse af et givet protein af interesse og label-fri massespektrometri. Arbejdsprocessen omfatter subcellulære fraktionering, immunopræcipitation, filter Aided prøveforberedelse, offline oprydning, massespektrometri, og en downstream Bioinformatik pipeline.

Label-fri Immunoprecipitation massespektrometri workflow for storstilet nuklear Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Denne proteomics arbejdsgang muliggør upartisk identifikation og kortlægning af endogene proteinproteininteraktioner med subcellulær opløsning. Denne teknik er især fordelagtig, når man undersøger agn proteiner, der doserer følsomme, lav overflod, eller har flere subcellulære lokaliseringer. Denne metode kan anvendes til kortlægning endogene protein interaktioner forudsat at der er en passende affinitet reagens til rådighed.Dette er især vigtigt for mange af de tusindvis af proteiner, der har ukendt funktion, hvoraf mange har været forbundet med sygdomme hos mennesker. Denne metode kan tilpasses enhver cellelinje eller væv, der kan anvendes til subcellulær fraktionering. Ethvert protein med et egnet affinitetsrenser kan målrettes.Et fælles resultat for affinitetsrensningsforsøg er ofte ikke noget resultat. Virkelig gode reagenser, indsamling QC data hele vejen igennem, og begrænse prøve håndtering er alle virkelig vigtigt. Vid, at du har en prøve.Til at begynde, optø de forberedte celle pellets i 15 minutter i 1X pellet volumen af kold buffer A med proteasehæmmere eller fosfatase hæmmere. Rør, der indeholder cellepellet, anbringes på en nøddemaskine ved fire grader Celsius for at hjælpe i resuspension i 30 minutter. Derefter placere røret i en centrifuge på 2, 000 gange g og fire grader Celsius i 10 minutter til pellet.Dekanter supernatanten, og opslæm cellerne med 5X den pakkede cellevolumen med buffer A.Incubate på is i 20 minutter. Dernæst pellet igen på 2, 000 gange g og fire grader Celsius i 10 minutter. Dekanter bufferen og resuspenderet med 2X original pakket celle volumen buffer A med proteasehæmmere eller fosfatasehæmmere.Dounce omkring syv gange med løs støder A.Centrifuge lysatet i 10 minutter ved 2, 000 gange g og fire grader Celsius. Overfør forsigtigt supernatanten til et nyt rør, og flashfryser det med flydende nitrogen. Opbevar lysatet på minus 80 grader Celsius.Pelleten skal resuspendere pellet med 0,9 X pelletvolumen af buffer B med proteasehæmmere eller fosfatasehæmmere, og der blandes på en nutator i fem minutter ved fire grader Celsius. At lyse kernerne, dounce 20 gange med titer støder B.Bland den nukleare lysate på en møtrikker i 30 minutter ved fire grader Celsius, så det er homogent. Derefter centrifuge atomlys i 30 minutter ved 21, 000 gange g ved fire grader Celsius.Pipette off supernatant og gemme som en opløselig nuklearprotein ekstrakt. For at dialysere det opløselige nukleare ekstrakt, først skæres en passende længde på 24 millimeter bredde dialyse slanger med en otte kilodalton molekylvægt cutoff. Klem den ene side af slangen og læg nukleoplasmen ind i slangen.Efter iladning af lysatet klemmes den anden ende og nedsænkes i en ren glasbeholder indeholdende buffer C med proteasehæmmere. Dialyze i tre timer ved fire grader Celsius. Derefter overføres det dialyserede atomekstrakt nucleoplasm til et rør og centrifugeres ved 21.000 gange g ved fire grader Celsius i 30 minutter.Overfør tre 20 mikroliter aliquots af det nukleare ekstrakt til nye mikrocentrifugerør til fraktionering validering af vestlige blot. Ved hjælp af pipettespidser, der er blevet skåret ved spidsen, klargøres en protein-A/G perleblanding for hver replikat ved at kombinere 12,5 mikroliterperler af Protein A Sepharose med 12,5 mikroliter protein G Sepharose i mikrocentrifugerør. Protein A/G perleblandingen vaskes to gange med 300 mikroliter IP-buffer I.Spin perlerne ved 1, 500 gange g ved fire grader Celsius i et minut og dekantere bufferen.Derefter forberedes antistofproteinet A/G perler. For at binde antistoffet til perlerne, tilsættes til røret 300 mikroliter af IP buffer I og 10 mikrogram af det ønskede antistof. Lad perle-antistof blandingen til rock på en nutator ved fire grader Celsius natten over.Nu aliquot passende mængder af de nukleare lysater i lav fastholdelse mikrocentrifuge rør for en milligram protein input pr replikat. Drej lysatet ved 16,000 gange g i 30 minutter og overfør supernatanten til et nyt rør. Tilsæt en mikroliter af Benzonase på 250 enheder pr mikroliter for hver milligram af det nukleare lysat og rock på en nutator ved fire grader Celsius i 10 til 15 minutter.For at forberede perler til forrydning af lysatet, tilsættes 12,5 mikroliter af hvert protein A og protein G perler til 1,5 milliliter lav retention rør. Vask to gange med IP vask buffer I med proteasehæmmere. Dekanter bufferen og tilsæt et milligram af det forberedte nukleare lysat til perlerne.Inkubere mens rokkende på en nutator i en time ved fire grader Celsius. Centrifuge den præ-ryddet lysater på 1, 500 gange g og fire grader Celsius i et minut. Derefter vaskes antistofproteinet A- eller G perler to gange med IP buffer I med proteasehæmmere.Efter centrifugering ved 1, 500 gange g og fire grader Celsius i et minut, dekantere bufferen. Overfør nu det fordjættede nukleare lysat på antistofproteinet A- eller G-perler. Inkubere mens rokkende på en nutator ved fire grader Celsius i fire timer.Efter inkubationen, centrifuge ved 1, 500 gange g og fire grader Celsius i et minut. Overfør supernatanten i rør mærket som flowet igennem for hver replikat. Antistofproteinet A- eller G-perlerne vaskes fire gange med en milliliter IP-buffer II med proteasehæmmere.Vask derefter perlerne to gange med en milliliter IP buffer I med proteasehæmmere. Sørg for, at al buffer fjernes efter den sidste vask. Eluterprotein fra perlerne ved at inkubere med 20 mikroliter på 0,1 molarglycin ved pH 2,75 hver i 30 minutter på en nutator.Så spin på 750 gange g og fire grader Celsius i et minut og pipette off supernatant. Gentag denne inkubation med elution buffer en anden gang. Efter klargøring af proteinpellet skal det opslæmmes med 30 mikroliter SDS-alkyleringsbuffer.Inkuber prøven på en 95 grader Celsius varmeblok i fem minutter. Så lad det køle af ved stuetemperatur i 15 minutter. Der tilsættes 300 milliliter UA-opløsning og 30 mikroliter på 100 millimolar TCEP til hver prøve.Indlæs opløsningen på et 30.000 centrifugalfilter. Når centrifugalfilteret drejes ved 21.000 gange g ved stuetemperatur i 10 minutter, skal strømmen følges igennem, hvis der opstår problemer med filteret. Efter vask af filteret i henhold til manuskriptet tilsættes tre mikroliter af et mikrogram pr. mikroliter lyse C resuspenderet i 0,1 molar Tris pH 8.5.Fyld filtrene op til 100 mikrolitermærket med 0,1 molar Tris pH 8.5. Lad det fordøje i en time ved 37 grader Celsius, mens rokkende på en nutator. Dernæst tilsættes en mikroliter af et mikrogram pr. mikroliter MS-grade trypsin.Bland forsigtigt og lad trypsinen inkubere med prøven natten over ved 37 grader Celsius, mens du rokker på en nutator. Om morgenen centrifugeres flere gange ved 21.000 gange g i 20 minutter for at fremkalde peptiderne fra filteret til et rent mikrocentrifugerør med lav fastholdelse. Efter afsaltning af peptider ved hjælp af C18 spin kolonner, resuspend de frysetørrede peptider i syv mikroliter af 0,1% TFA i 5%acetonitrile.Sonikere prøven i tre minutter for at sikre, at peptiderne er blevet resuspenderet, drej derefter ned ved 14.000 gange g i 10 minutter. 15-30 % af prøven indlæst på massespektrometrisystemet for væskekromatografi til analyse. I denne undersøgelse, tre eksemplarer immunoprecipitations blev analyseret fra fem milligram HeLa nukleare ekstrakt udnytte en perle-only kontrol.Lokkemaden DYRK1A rangeret blandt de tre største berigede proteiner over kontrollen, hvilket indikerer, at det udførte IP-MS-eksperiment var pålideligt. Der blev udvist en klar adskillelse mellem de højtillids interactorer, og mere end 95 % af de kopurificerede proteiner blev identificeret som uspecifikke. For eksempel DYRK1A-datasættet præsenterede IREF's interaktionspartnere FC-A-værdier helt ned til 0,45, hvilket repræsenterer en meget lav berigelse af kontrollen.Derfor er mange af disse tidligere rapporterede interaktioner falske negativer i dette datasæt ved at falde under FC-A-tærsklen på tre. Det beregnede absolutte kopinummer for hver IREF-interaktion viste ingen korrelation med påvisningsniveauerne for en interaktionspartner foretaget af IP-MS. Den kombinerede brug af FC-A større end tre og helgen større end 0,9 reduceret listen over høj tillid interactors til seks proteiner.Men når du anvender en FC-A cutoff på mere end tre i isolation, otte yderligere proteiner blev tilføjet til netværket. Den mest afgørende del af denne protokol er valget af antistof reagens til immunoprecipation. Western blot eller Coomassie validering af selektivitet anbefales, før du fuldfører denne arbejdsgang.Understøttende dokumentation for protein-protein interaktioner kan havde fra co-IP vestlige blotting af identificerede interactors. Protein kemiske krydsbinding, men mere kompleks, kan afsløre interaktion domæner af interactors. Ved hjælp af denne metode har min forskningsgruppe afdækket nye funktioner for DYRK1A, en proteinkinase, der kræves til udvikling af pattedyrs hjerner og forbundet med Alzheimers sygdoms neuropatologi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless kapillarelektroforese-massespektrometri for Metabolic profilering biologiske prøver

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation for Kvantitativ massespektrometri Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal forberedelse af Formalin fast prøver for peptid baseret Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation massespektrometri Imaging arbejdsprocesser

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Trinvis doseringprotokol for øget overførselstid i label-free impedansbaserede GPCR-analyser

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...