Name: label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een Grand Challenge Grant to W.M.O. van het Linda Crnic Institute for Down Syndrome en door een samenwerkingsovereenkomst tussen DARPA 13-34-RTA-FP-007. We willen Jesse Kurland en Kira Cozzolino bedanken voor hun bijdragen in het lezen en becommentariëren van het manuscript.

<ol>
	<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group.">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li><li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification.">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li><li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+'nonspecific'+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1.">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52 (2015).</li><li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+the+ends:+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7.">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10, 715-721 (2013).</li><li>Bronicki, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+new+cases+further+delineate+the+syndromic+intellectual+disability+phenotype+caused+by+mutations+in+DYRK1A.">Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A.</a> European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).</li><li>Antonarakis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+syndrome+and+the+complexity+of+genome+dosage+imbalance.">Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance.</a> Nature Reviews Genetics. , (2016).</li><li>Dowjat, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy-driven+overexpression+of+DYRK1A+kinase+in+the+brain+of+subjects+with+Down+syndrome.">Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome.</a> Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).</li><li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice.">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li><li>H&#228;mmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb/Dyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development.">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li><li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+MNB/DYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome.">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).</li><li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis.">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAINT:+Probabilistic+scoring+of+affinity+purificationg-mass+spectrometry+data.">SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 8, 70-73 (2011).</li><li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape:+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks.">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li><li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair.">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539 (2019).</li><li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iRefIndex:+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance.">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li><li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance.">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hier geschetste proteomica-workflow biedt een effectieve methode voor het identificeren van eiwit-interactoren met een hoog betrouwbaarheids gehalte voor een belangrijk eiwit. Deze aanpak vermindert de complexiteit van het monster via subcellulaire Fractie en richt zich op het verhogen van de identificatie interactie partners door middel van robuuste monstervoorbereiding, offline monster opruimen en strenge kwaliteitscontrole van het LC-MS-systeem. De downstreamgegevens analyse die hier wordt beschreven, maakt een eenvoudige statistische evaluatie mogelijk van de eiwitten die zijn geïdentificeerd als copurifying met het aas. Echter, vanwege een groot aantal experimentele variabelen (schaal, cellijn, antilichaam keuze), elk experiment vereist verschillende afgeknipte en overwegingen met betrekking tot gegevensvisualisatie en verrijking.
De eerste ontwerpoverweging in een IP-MS-experiment is de selectie van antilichamen die zullen worden gebruikt voor de copurificatie van het eiwit dat van belang is, samen met zijn interactie partners. Hoewel de beschikbaarheid van commerciële antilichamen is toegenomen om grotere delen van het menselijke Proteoom gedurende de afgelopen decennia te bedekken, zijn er nog steeds veel eiwitten waarvoor de reagentia beperkt zijn. Bovendien kunnen antilichamen die zijn gevalideerd voor toepassingen zoals de detectie van Western Blot, niet in staat zijn om de doel proteïne selectief te verrijken in een immunoprecipitatie-experiment. Voorafgaand aan het uitvoeren van een grootschalige interactie proteomica experiment, wordt voorgesteld om een IP te voltooien van een 90% Confluent Health 10 cm schotel, of gelijkwaardige cel nummer, en sonde voor het doelwit eiwit van belang door Western blotting. Als er meer dan één antilichaam beschikbaar is voor immunoprecipitatie, wordt er bovendien voorgesteld om meerdere antilichamen te selecteren die epitopen in verschillende delen van het eiwit herkennen. De binding van een antilichaam aan een aas-eiwit kan de noodzakelijke binding-interface voor putatieve interactie partners occlude. Selectie van een secundaire epitoop voor het aas eiwit zal de dekking van het interactie profiel dat wordt geïdentificeerd door een op massaspectrometrie gebaseerd experiment te verhogen.
Een tweede belangrijke overweging ligt in de selectie van de juiste controle voor het onderscheiden van interacties met hoge betrouwbaarheid, van lage-betrouwbaarheid of niet-specifieke interacties van die welke als copurifying met het aas worden aangemerkt. De strengste controle voor een IP-MS-experiment is het voltooien van de immunoprecipitatie van een CRISPR KO-cellijn van het aas. Een dergelijke controle maakt identificatie en filtering van niet-specifieke eiwitten mogelijk die rechtstreeks aan het antilichaam binden in plaats van aan het aas-eiwit. In gevallen waar het genereren van een CRISPR KO cellijn van elk aas eiwit niet haalbaar is, kan een IgG-kraal controle van hetzelfde Isotype van het aas antilichaam worden gebruikt. In experimenten met een panel van antilichamen die meerdere soorten vertegenwoordigen, kan het gebruik van een kralen alleen controle geschikt zijn, maar zal het de snelheid van valse positieven die zijn geïdentificeerd als interactoren met hoge betrouwbaarheid verhogen.
Selectie van de cellijn die wordt gebruikt in een IP-MS-experiment is afhankelijk van verschillende belangrijke factoren. Eiwit expressie en lokalisatie zijn grotendeels afhankelijk van het celtype. Hoewel RNA-expressie schattingen voor de meeste genen in veel veelgebruikte cellijnen kunnen worden gevonden, is eiwit expressie slecht gecorreleerd met RNA-expressie en moet experimenteel worden bepaald25. Cellijnen waarin een aas-eiwit wordt uitgedrukt in een zeer laag kopie nummer moeten worden vermeden om problemen te omzeilen die gepaard gaan met drastische verhogingen van de celkweek schaal die nodig kunnen zijn. Opgemerkt moet worden, echter, dat monstervoorbereiding kan worden geoptimaliseerd voor de detectie van zeer lage overvloed eiwitten. De filter aided sample prep (FASP) methode, terwijl robuust, kan leiden tot een meer dan 50% verlies van peptide in een monster. De Eenpotvaste-fase-Enhanced monstervoorbereiding (SP3) is een efficiënte methode voor het genereren van monsters voor massaspectrometrie analyse die monsterverlies minimaliseert26. Het verhoogde herstel mogelijk gemaakt door de SP3-methode van monstervoorbereiding kan een nuttig alternatief in deze workflow voor de kwantificering van eiwitten die in de buurt van de aantoonbaarheidsgrens vallen.
Deze proteomica workflow is toegepast in vele kern loten, waaronder kinases, E3 ubiquitine ligases en steigers leden van multi subunit complexen. Uitgaande van de juiste validatie van antilichaam reagentia, zal een succesvolle uitvoering van deze workflow resulteren in het opsporen van eiwit nucleaire interactie partners met hoge betrouwbaarheid voor een eiwit van belang.

Het menselijk proteoom vertoont enorme structurele en biochemische diversiteit door de vorming van stabiele multisubunit complexen en voorbijgaande eiwit-eiwit interacties. Daarom is de identificatie van interactie partners voor een eiwit van belang vaak nodig in onderzoeken om moleculaire mechanismen te ontrafelen. Recente vooruitgang in de affiniteits zuivering protocollen en de opkomst van hoge-resolutie Fast-Scanning massaspectrometrie instrumentatie hebben gezorgd voor eenvoudige mapping van eiwit interactie landschappen in een enkele onbevooroordeelde experiment.
Eiwit interactie protocollen gebruiken vaak ectopische expressie systemen met affiniteit-gelabelde fusie constructies om eiwit interacties te identificeren zonder hoogwaardige antilichamen die een eiwit van belang1,2herkennen. Echter, epitoop tag-gebaseerde methoden hebben verschillende nadelen. Fysieke interacties met de epitoop kunnen leiden tot de opsporing van niet-specifieke copurifying eiwitten3. Bovendien, fusie van deze epitoop Tags aan de N-of C-terminal van een eiwit kan inheemse eiwit-eiwit interacties blokkeren, of verstoren van eiwit vouwen ter bevordering van niet-fysiologische conformaties4. Bovendien worden in ectopische uitdrukkings systemen doorgaans het aas-eiwit in supraphysiologische concentraties overbelast, wat kan resulteren in de identificatie van artifeitelijke eiwit interacties, met name voor doserings gevoelige genen5. Om deze problemen te omzeilen, kan de endogene Bait proteïne worden immunoprecipitated samen met de bijbehorende interactie prooi eiwitten, uitgaande van de beschikbaarheid van een kwalitatief hoogwaardig antilichaam dat het inheemse eiwit herkent.
Hier is een interactie proteomica workflow voor het opsporen van de nucleaire interactome van een endogene eiwit met behulp van de cmgc proteïne kinase DYRK1A als voorbeeld. Verstoring van DYRK1A Kopieer nummer, activiteitsniveau of expressie kan ernstige verstandelijke handicap bij de mens veroorzaken, en embryonale letaliteit bij muizen6,7,8,9. DYRK1A vertoont dynamische spatiotemporele regulering10, en gecompartimengd eiwit interacties11,12, vereisen benaderingen die kunnen detecteren van lage abundantie interactie partners specifiek voor verschillende subcellulaire compartimenten.
Dit protocol maakt gebruik van cellulaire fractionering van menselijke HeLa-cellen in cytosol-en nucleoplasm-fracties, immunoprecipitatie, monstervoorbereiding voor massaspectrometrie en een overzicht van een bioinformatische pijpleiding voor het evalueren van de gegevenskwaliteit en het visualiseren van resultaten, met R-scripts voor analyse en visualisatie (Figuur 1). Proteomics-softwarepakketten die in deze workflow worden gebruikt, zijn allemaal vrij beschikbaar om te downloaden of kunnen worden benaderd via een webinterface. Voor aanvullende informatie over software en computer methoden zijn diepgaande tutorials en instructies beschikbaar op de aangeboden links.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 0.1% EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone (HPLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closure</td>
			<td>Caroline Biological Supply Company</td>
			<td>684239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>887845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa QC tryptic digest</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce homogenizer 7 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885301-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl endopeptidase C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>enzo life sciences</td>
			<td>ALX-350-012-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p84 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88341</td>
			<td>LCMS QC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 spin columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>For mass spectrometry sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0780-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica emitter tip</td>
			<td>Pico TIP</td>
			<td>FS360-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885302-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3787K17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 150, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>Tissue culture dish for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7&#181;m Spherical Hybrid (1.7 &#181;m, 75 &#181;m x 250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007484</td>
			<td>nanoflow C18 column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling

Immunoaffinity zuivering massaspectrometrie (IP-MS) is ontstaan als een robuuste kwantitatieve methode voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties. Deze publicatie presenteert een volledige interactie proteomica workflow ontworpen voor het identificeren van lage overvloed eiwit-eiwit interacties van de Nucleus die ook kunnen worden toegepast op andere subcellulaire compartimenten. Deze workflow omvat subcellulaire fractionering, Immunoprecipitation, monstervoorbereiding, offline opruimen, single-shot label-vrije massaspectrometrie, en downstream computationele analyse en data visualisatie. Ons protocol is geoptimaliseerd voor het opsporen van gecompartimengd, lage abundantie interacties die moeilijk te herkennen zijn aan hele celllysaten (bijv. transcriptiefactor interacties in de Nucleus) door immunoprecipatie van endogene eiwitten uit gefractioneerde subcellulaire compartimenten. De voorbeeld voorbereiding pijpleiding hier beschreven biedt gedetailleerde instructies voor de bereiding van HeLa Cell nucleair extract, immunoaffinity zuivering van endogene Bait Protein, en kwantitatieve massaspectrometrie analyse. We bespreken ook methodologische overwegingen voor het uitvoeren van grootschalige immunoprecipitatie in massaspectrometrie gebaseerde interactie profilerings experimenten en bieden richtlijnen voor het evalueren van de kwaliteit van de gegevens om te onderscheiden van echte positieve eiwitten interacties van niet-specifieke interacties. Deze aanpak wordt hier gedemonstreerd door het onderzoeken van de nucleaire interactome van de CMGC kinase, DYRK1A, een laag abundantie proteïne kinase met slecht gedefinieerde interacties binnen de Nucleus.

De meerderheid van de eiwit massa geïdentificeerd in een IP-MS-experiment bestaat uit niet-specifieke eiwitten. Een van de belangrijkste uitdagingen van een IP-MS-experiment is dus de interpretatie van de eiwitrijke interactoren versus niet-specifieke interactoren. Om de cruciale parameters te demonstreren die worden gebruikt bij de evaluatie van de kwaliteit van de gegevens, analyseerde de studie drievoud immunoprecipitaties van 5 mg Hela nucleair extract met behulp van een kraal alleen controle. De eerste interne controle om ervoor te zorgen dat een IP-MS-experiment betrouwbaar is, is of het aas-eiwit behoort tot een van de hoogste verrijkte eiwitten die worden geïdentificeerd door zowel de fold-Change over de controle als de waarschijnlijkheid van de Heilige. In dit geval wordt het aas DYRK1A gerangschikt onder de bovenste drie verrijkte eiwitten over de controle (Figuur 2a,B). In een nucleaire interactome-studie van DYRK1A, gebruikmakend van vier onafhankelijke antilichamen, voorzag een FC-A-cutoff van > 3.00 en de SAINT-kanscutoff > 0,7 in een strenge cutoff voor de identificatie van zowel nieuwe als eerder gevalideerde interactoren22. Bij toepassing op dit experiment zou een duidelijke scheiding kunnen worden waargenomen tussen de interactoren met een hoog betrouwbaarheids percentage en > 95% van de als niet-specifieke geïdentificeerde eiwitten (Figuur 2a,B). Het toepassen van zowel een fold-Change verrijking als een waarschijnlijkheids drempel verhoogt de striktheid door een consistent hoge verrijking van eiwit-Id's in biologische replicaten te vereisen.
Naast statistische scoring, wijst de CRAPome Analysis workflow ook eerder gerapporteerde interacties toe aan aas-prooi gegevens23. Hoewel deze toewijzing nuttig kan zijn voor drempelmethode-interacties met hoge en lage betrouwbaarheid, kunnen eerder gerapporteerde interacties slecht scoren door FC-A en de kansen van de Heilige, wat mogelijk aangeeft dat veel bekende interacties van een bepaald aas alleen kunnen bestaan in specifieke celtypen, contexten of organellen. Voor het voorbeeld DYRK1A DataSet, iref interactie FC-A waarden waren zo laag als 0,45, wat neerkomt op een zeer lage verrijking over controle (figuur 2c). Om de inflatie van valse positieven te voorkomen, moet statistische drempelwaarde worden uitgevoerd op een manier die de striktheid boven de reductie van valse negatieven prioriteert. Opgemerkt moet worden dat de detectie van deze interacties onafhankelijk van eiwit overvloed was (figuur 2c). Het berekende absolute Kopieer nummer van elke iREF-interactie binnen HeLa-cellen toonde geen correlatie met de detectieniveaus van een interactie partner door IP-MS24.
Cytoscape fungeert als een effectief hulpmiddel voor het visualiseren van meerdere lagen van interactiegegevens19. In het DYRK1A immunoprecipitatie-experiment dat hier wordt beschreven, heeft het gecombineerde gebruik van FC-A-> 3,0 en Saint > 0,9 de lijst met zeer betrouwbare interactoren teruggebracht tot zes eiwitten (figuur 2D). Echter, bij het toepassen van een FC-een cutoff van > 3,0 op zichzelf, acht extra eiwitten werden toegevoegd aan het netwerk. Deze extra eiwit interactoren hebben een hoge connectiviteit met de interactoren die al in het netwerk zijn, wat suggereert dat ze worden geassocieerd in vergelijkbare complexen of functionele rollen. Om dit te doen, werd bewijs van de reeks-DB van eiwit-eiwit interacties geïntegreerd in dit netwerk als blauwe onderbroken lijnen20. Terwijl deze single-Bait, drievoud experiment biedt een beperkte steekproef van de volledige DYRK1A interactie netwerk, het gebruik van extra Aas, replicaten, en integratie van grote openbare gegevenssets kan worden gebruikt om het netwerk van High-Confidence interacties uit te breiden. De statistische afgeknipte zullen dus specifiek zijn voor elk individueel experiment en zullen grondig moeten worden geëvalueerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg"> Figuur 1: representatieve proteomica-workflow voor subcellulaire IP-MS. Cellen worden geteeld in 4 L ronde bodem kolven of 15 cm weefselcultuur gerechten en geoogst op hetzelfde moment voor subcellulaire fractionering. Cellen worden gefractioneerd in een cytosolische, nucleaire en een nucleaire pellet, en immunoprecipitaties worden gedaan van 1 − 10 mg nucleair lysaat met behulp van een of meerdere antilichamen die hetzelfde aas herkennen. Filter aided sample prep (FASP) en offline monster Cleanup worden uitgevoerd voorafgaand aan single-shot massaspectrometrie. Een downstream computationele pijplijn wordt gebruikt om gegevens te verwerken in interpretabel interactiegegevens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg"> Figuur 2: representatieve gegevens voor een single-BAIT IP-MS-experiment met enkelvoudige antilichamen. A) FC-A en Saint-kansoutput van CRAPome Analysis workflow voor een optimaal experiment met behulp van één antilichaam voor het kinase DYRK1A (n = 3). Voor de vergelijking werden alleen kralen gebruikt. Rode ononderbroken lijnen vertegenwoordigen afgeknipte ingesteld op FC-A > 3,00 en Saint > 0,7. (B) maxquant eiwit abundantie schattingen (iBAQ)-output versus LOG2 ratio van eiwit abundantie in DYRK1A IP to Control, gekleurd door het aangepaste p-waarde bereik van empirische Bayes-analyse van de label vrije intensiteiten. C) FC-A en het geschatte afschrift aantal eiwitten die in de iref-database23,24als interacties met eiwitten worden vermeld. (D) Cytoscape netwerk visualisatie van DYRK1A interactors. Blauwe knooppunten = FC-A > 3,00, SAINT > 0,7. Oranje knooppunten = FC-A > 3,00. Zwarte randen = eiwitten geïdentificeerd als interactoren in IPMS-experiment. Blauwe onderbroken rand = Sint-interactie tussen prooi eiwit (vertrouwen >. 150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Mengsel van proteaseremmers (PI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriummetabisulfiet</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Benzamidine</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)</td>
			<td>0,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mengsel van fosfatase remmers (PhI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Microcystin LR</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium Orthovanadaat</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfluoride</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Subcellulaire fractionering buffers:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffer A pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffer B pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Buffer C pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Immunoprecipitation-buffers:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP-buffer 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP-buffer 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerol</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS alkylatie buffer pH 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sds</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chlooracetamide</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>TCEP</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagens</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ureum</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>0,1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* gebruik HPLC-kwaliteit H2O</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: buffer composities
Aanvullende Codeer bestanden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Deze proteomics workflow maakt het mogelijk om endogene eiwit-eiwitinteracties met subcellulaire resolutie te identificeren en in kaart te brengen. Deze techniek is bijzonder voordelig bij het onderzoeken van aas eiwitten die dosering gevoelig, lage overvloed, of hebben meerdere subcellulaire lokalisaties. Deze methode kan worden toegepast op het in kaart brengen van endogene eiwit interacties ervan uitgaande dat er een geschikte affiniteit reagens beschikbaar.Dit is vooral belangrijk voor veel van de duizenden eiwitten die een onbekende functie hebben, waarvan vele in verband zijn gebracht met de menselijke ziekte. Deze methode kan worden aangepast aan elke cellijn of weefsel vatbaar voor subcellulaire fractionatie. Elk eiwit met een geschikt affiniteitsreagens kan worden gericht.Een gemeenschappelijk resultaat voor affiniteitszuiveringsexperimenten is vaak geen resultaat. Echt goede reagentia, het verzamelen van QC-gegevens in de hele, en het beperken van monster behandeling zijn allemaal echt belangrijk. Weet dat je een monster hebt.Ontdooi om te beginnen de bereide celpellets gedurende 15 minuten in 1X pelletvolume koude buffer A met proteaseremmers of fosfataseremmers. Plaats de buis met de celpellet op een nutator op vier graden Celsius om 30 minuten te helpen bij de resuspensie. Plaats de buis vervolgens 10 minuten lang in een centrifuge op 2.000 g en vier graden Celsius om te pelleteren.Decanteer de supernatant en resuspend de cellen met 5X het verpakte celvolume met buffer A.Incubate op ijs gedurende 20 minuten. Vervolgens pellet weer op 2,000 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Decanteer de buffer en resuspend met 2x originele verpakte celvolumebuffer A met proteaseremmers of fosfataseremmers.Dounce ongeveer zeven keer met de losse stamper A.Centrifuge het lysaat gedurende 10 minuten op 2,000 keer g en vier graden Celsius. Breng de supernatant voorzichtig over naar een nieuwe buis en bevries het met vloeibare stikstof. Bewaar het lysaat op min 80 graden Celsius.Resuspend de pellet met 0.9X pellet volume van buffer B met protease remmers of fosfatase remmers en meng op een nutator gedurende vijf minuten op vier graden Celsius. Om de kernen lyse, dounce 20 keer met de titer stamper B.Meng de nucleaire lysate op een nutator gedurende 30 minuten op vier graden Celsius, zodat het homogeen is. Dan centrifugeren het nucleaire lysaat gedurende 30 minuten op 21.000 keer g bij vier graden Celsius.Pipette uit de supernatant en op te slaan als een oplosbaar nucleair eiwit extract. Om het oplosbare kernextract te dialyseren, knipt u eerst een geschikte lengte van dialyseslang van 24 millimeter met een acht kilodalton moleculair gewichtsafsnede. Klem één kant van de slang en laad het nucleoplasma in de slang.Na het laden van het lysaat klem je het andere uiteinde en dompel je onder in een schone glazen container met buffer C met proteaseremmers. Dialyze voor drie uur op vier graden Celsius. Breng daarna het gedialyseerde kernextract nucleoplasma in een buis en centrifuge op 21,000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten.Breng drie 20 microliter aliquots van het nucleaire extract over naar nieuwe microcentrifugebuizen voor fractioneringvalidatie door westelijke vlek. Met behulp van pipette tips die zijn gesneden op de tip, bereiden een eiwit A / G kraal mengsel voor elke repliceren door het combineren van 12,5 microliter kraal volume van Protein A Sepharose met 12,5 microliter eiwit G Sepharose in microcentrifuge buizen. Was het eiwit A/G kraalmengsel twee keer met 300 microliter IP-buffer I.Spin de kralen op 1, 500 keer g bij vier graden Celsius gedurende een minuut en decanteer de buffer.Bereid vervolgens het antilichaameiwit A/G-kralen voor. Om het antilichaam aan de kralen te binden, voeg dan aan de buis 300 microliters van IP buffer I en 10 microgram van het gewenste antilichaam toe. Laat het kraal-antilichaam mengsel te rocken op een nutator op vier graden Celsius 's nachts.Nu aliquot geschikte volumes van de nucleaire lysates in lage retentie microcentrifuge buizen voor een milligram eiwit input per replicaat. Draai het lysaat 30 minuten op 16.000 g en breng de supernatant over naar een nieuwe buis. Voeg een microliter Benzonase toe aan 250 eenheden per microliter voor elke milligram van het kernlysaat en rock gedurende 10 tot 15 minuten op een nutator bij vier graden Celsius.Om kralen voor te bereiden voor het voorruimen van het lysaat, voeg 12,5 microliter van elk eiwit A en eiwit G kralen aan 1,5 milliliter lage retentie buizen. Was twee keer met IP wasbuffer I met protease remmers. Decanteer de buffer en voeg een milligram van de voorbereide nucleaire lysaat aan de kralen.Incubeer tijdens het schommelen op een nutator voor een uur op vier graden Celsius. Centrifuge de voorgeklaarde lysates op 1, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende een minuut. Was vervolgens het antilichaam eiwit A of G kralen twee keer met IP buffer I met protease remmers.Na het centrifugeren op 1, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende een minuut, decanteren de buffer. Breng nu het voorgezuiverde kernlysaat over op het antilichaameiwit A of G kralen. Incubeer tijdens het schommelen op een nutator op vier graden Celsius voor vier uur.Na de incubatie, centrifugeren op 1, 500 keer g en vier graden Celsius gedurende een minuut. Breng de supernatant in buizen gelabeld als de stroom door voor elke repliceren. Was het antilichaameiwit A- of G-kralen vier keer met één milliliter IP-buffer II met proteaseremmers.Dan was de kralen twee keer met een milliliter IP buffer I met protease remmers. Zorg ervoor dat alle buffer na de laatste wasbeurt wordt verwijderd. Elute eiwit uit de kralen door te broeden met 20 microliters van 0,1 molaire glycine bij pH 2,75 elk gedurende 30 minuten op een nutator.Draai dan op 750 keer g en vier graden Celsius gedurende een minuut en pipet uit de supernatant. Herhaal deze incubatie met elutiebuffer een tweede keer. Na het bereiden van de eiwitpellet, resuspend het met 30 microliters van SDS alkylation buffer.Incubeer het monster op een 95 graden Celsius warmteblok gedurende vijf minuten. Laat het dan 15 minuten afkoelen op kamertemperatuur. Voeg 300 milliliter UA-oplossing en 30 microliter van 100 millimolar TCEP toe aan elk monster.Laad de oplossing op een 30K centrifugaalfilter. Na het draaien van het centrifugaalfilter op 21.000 keer g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, houd de stroom door in het geval er een probleem is met het filter. Voeg na het wassen van het filter volgens het manuscript drie microliter van één microgram per microliter lyse C toe die opnieuw is opgetrokken in 0,1 molaire Tris pH 8.5.Vul de filters tot de 100 microliter merk met 0,1 molaire Tris pH 8.5. Laat het een uur verteren bij 37 graden Celsius terwijl het schommelen op een nutator. Voeg vervolgens een microliter van een microgram per microliter MS-grade trypsine toe.Meng zachtjes en laat de trypsine te broeden met het monster 's nachts op 37 graden Celsius tijdens het schommelen op een nutator. In de ochtend, centrifuge meerdere keren op 21.000 keer g gedurende 20 minuten om de peptiden uit het filter elute in een schone lage retentie microcentrifuge buis. Na het ontzilten van de peptiden met behulp van C18 spin kolommen, resuspend de lyophilized peptiden in zeven microliters van 0,1%TFA in 5%acetonitril.Sonicate het monster gedurende drie minuten om ervoor te zorgen dat de peptiden zijn opnieuw opgetrokken, dan spin naar beneden op 14,000 keer g gedurende 10 minuten. Laad 15 tot 30% van het monster op het vloeibare chromatografie massaspectrometriesysteem voor analyse. In deze studie, drievoudige immunoprecipitaties werden geanalyseerd uit vijf milligram HeLa nucleaire extract gebruik te maken van een kraal-only controle.Het aas DYRK1A gerangschikt in de top drie verrijkte eiwitten over de controle die aangeeft dat de uitgevoerde IP-MS experiment betrouwbaar was. Een duidelijke scheiding werd aangetoond tussen de hoge vertrouwen interactors en meer dan 95% van copurified eiwitten werden geïdentificeerd als niet-specifiek. Voor het voorbeeld DYRK1A dataset presenteerden IREF-interactiepartners FC-A-waarden van slechts 0,45, wat neerkomt op een zeer lage verrijking over de controle.Daarom zijn veel van deze eerder gemelde interacties valse negatieven binnen deze gegevensset door onder de FC-A-drempel van drie te zakken. Het berekende absolute kopienummer van elke IREF-interactie vertoonde geen correlatie met de detectieniveaus van een interactiepartner door IP-MS. Het gecombineerde gebruik van FC-A groter dan drie en heilige groter dan 0,9 verminderde de lijst van hoog vertrouwen interactors tot zes eiwitten.Echter, bij het aanbrengen van een FC-A cutoff van meer dan drie in isolatie, werden acht extra eiwitten toegevoegd aan het netwerk. Het meest cruciale deel van dit protocol is de selectie van antilichaamreagens voor immunoprecipitatie. Western blot of Coomassie validatie van selectiviteit wordt aanbevolen voorafgaand aan het voltooien van deze workflow.Ondersteunend bewijs van eiwit-eiwit interacties kan worden gehouden van co-IP westerse blotting van geïdentificeerde interactors. Eiwit chemische cross-linking, hoewel complexer, kan onthullen interactie domeinen van interactors. Met behulp van deze methode, heeft mijn onderzoeksgroep ontdekt nieuwe functies voor DYRK1A, een eiwit kinase die nodig is voor zoogdier hersenontwikkeling en gekoppeld aan de ziekte van Alzheimer neuropathologie.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale voorbereiding van formaline vaste monsters voor Peptide Matrix gebaseerde bijgestaan Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Monster voorbereiding voor Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kwantitatieve analyse van de cellulaire lipidoom van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeibare chromatografie in combinatie met tandem massaspectrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Stepwise Dosing Protocol voor verhoogde doorvoer in label-vrije impedance-based GPCR-tests

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...