Name: label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Grand Challenge-Stipendium an W.M.O. vom Linda Crnic Institute for Down-Syndrom und durch eine DARPA-Kooperationsvereinbarung 13-34-RTA-FP-007 unterstützt. Wir danken Jesse Kurland und Kira Cozzolino für ihre Beiträge zur Lektüre und Kommentierung des Manuskripts.

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der hier skizzierte Proteomik-Workflow bietet eine effektive Methode zur Identifizierung von proteinreichen Proteininteraktoren für ein Protein von Interesse. Dieser Ansatz verringert die Probenkomplexität durch subzelluläre Fraktion und konzentriert sich auf die Erhöhung der Identifikationsinteraktionspartner durch robuste Probenvorbereitung, Offline-Probenbereinigung und strenge Qualitätskontrolle des LC-MS-Systems. Die hier beschriebene nachgelagerte Datenanalyse ermöglicht eine einfache statistische Auswertung der Proteine, die als mit dem Köder koreinigend identifiziert wurden. Aufgrund einer hohen Anzahl experimenteller Variablen (Skala, Zelllinie, Antikörperwahl) erfordert jedes Experiment jedoch unterschiedliche Cutoffs und Überlegungen zur Datenvisualisierung und -anreicherung.
Die erste Design-Überlegung in einem IP-MS-Experiment ist die Auswahl von Antikörpern, die zusammen mit ihren interagierenden Partnern zur Koreinigung des von Interesse interessierten Proteins verwendet werden. Während die Verfügbarkeit kommerzieller Antikörper in den letzten Jahrzehnten auf größere Teile des menschlichen Proteoms ausgeweitet wurde, gibt es immer noch viele Proteine, für die Reagenzien begrenzt sind. Darüber hinaus können Antikörper, die für Anwendungen wie den Western-Blot-Nachweis validiert wurden, in einem Immunpräzipationsexperiment nicht in der Lage sein, das Zielprotein selektiv anzureichern. Vor der Durchführung eines groß angelegten Interaktionsproteomik-Experiments wird vorgeschlagen, eine IP von einer 90% konfluenten 10 cm Schale oder einer gleichwertigen Zellnummer abzuschließen und das Zielprotein von Interesse durch Western Blotting zu untersuchen. Wenn mehr als ein einziger Antikörper für Immunpräzipitation verfügbar ist, wird zusätzlich vorgeschlagen, mehrere Antikörper auszuwählen, die Epitope in verschiedenen Teilen des Proteins erkennen. Die Bindung eines Antikörpers an ein Köderprotein kann die notwendige Bindungsschnittstelle für vermeintlich eimierende Partner ausblenden. Die Auswahl eines sekundären Epitops für das Köderprotein erhöht die Abdeckung des Interaktionsprofils, das durch ein Experiment auf Derspektrometrie identifiziert wird.
Eine zweite wichtige Überlegung liegt in der Auswahl der geeigneten Kontrolle, um vertrauensbesonnene Wechselwirkungen von vertrauensarmen oder unspezifischen Wechselwirkungen von solchen zu unterscheiden, die als mit dem Köder koeiniger identifiziert wurden. Die strengste Kontrolle für ein IP-MS-Experiment besteht darin, die Immunpräzipitation aus einer CRISPR KO-Zelllinie des Köders abzuschließen. Eine solche Kontrolle ermöglicht die Identifizierung und Filterung von unspezifischen Proteinen, die direkt an den Antikörper und nicht an das Köderprotein binden. In Fällen, in denen die Erzeugung einer CRISPR KO-Zelllinie jedes Köderproteins nicht möglich ist, kann eine IgG-Perlenkontrolle desselben Isotyps des Köderantikörpers verwendet werden. In Experimenten, die ein Panel von Antikörpern verwenden, die mehrere Arten darstellen, kann die Verwendung einer Perlen-Only-Kontrolle angemessen sein, erhöht aber die Rate der falsch positiven Ergebnisse, die als hochvertrauensgefährdete Interaktoren identifiziert wurden.
Die Auswahl der in einem IP-MS-Experiment verwendeten Zelllinie hängt von mehreren Schlüsselfaktoren ab. Proteinexpression und Lokalisation sind weitgehend vom Zelltyp abhängig. Während für die meisten Gene in vielen häufig verwendeten Zelllinien RNA-Expressionsschätzungen gefunden werden können, ist die Proteinexpression schlecht mit der RNA-Expression korreliert und muss experimentell bestimmt werden25. Zelllinien, in denen ein Köderprotein in sehr geringer Kopierzahl exprimiert wird, sollten vermieden werden, um Probleme zu umgehen, die mit drastischen Erhöhungen der Zellkulturskala verbunden sind, die erforderlich sein können. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Probenvorbereitung für den Nachweis von Proteinen mit sehr geringer Häufigkeit optimiert werden kann. Die FASP-Methode (Filter Aided Sample Prep) ist robust, kann aber zu einem Peptidverlust von mehr als 50 % in einer Probe führen. Die Single-Pot Solid-Phase-Enhanced Sample Preparation (SP3) ist eine effiziente Methode zur Generierung von Proben für die Massenspektrometrieanalyse, die den Probenverlust minimiert26. Die erhöhte Rückgewinnung, die durch die SP3-Methode der Probenvorbereitung ermöglicht wird, kann eine nützliche Alternative in diesem Workflow für die Quantifizierung von Proteinen sein, die in die Nähe der Nachweisgrenze fallen.
Dieser Proteomik-Workflow wurde in vielen Kernködern angewendet, einschließlich Kiinasen, E3-Ubiquitin-Ligasen und Gerüstbestandteilen von Multisubunit-Komplexen. Unter der Annahme einer ordnungsgemäßen Validierung von Antikörperreagenzien führt die erfolgreiche Ausführung dieses Workflows zum Nachweis von proteinreichen Partnern für kernkraft für ein Protein von Interesse.

Das menschliche Proteom weist durch die Bildung stabiler Multisubunit-Komplexe und transienter Protein-Protein-Wechselwirkungen eine enorme strukturelle und biochemische Vielfalt auf. Dementsprechend ist die Identifizierung von Interaktionspartnern für ein Protein von Interesse in Untersuchungen häufig erforderlich, um molekulare Mechanismen zu entwirren. Jüngste Fortschritte bei Affinitätsreinigungsprotokollen und das Aufkommen hochauflösender Schnellscan-Massenspektrometrie-Instrumente haben eine einfache Kartierung von Proteininteraktionslandschaften in einem einzigen unvoreingenommenen Experiment ermöglicht.
Protein-Interaktionsprotokolle verwenden häufig ektopische Expressionssysteme mit Affinitäts-getaggten Fusionskonstrukten, um Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren, ohne dass hochwertige Antikörper benötigt werden, die ein Protein von Interesse erkennen1,2. Epitop-Tag-basierte Methoden haben jedoch mehrere Nachteile. Physikalische Wechselwirkungen mit dem Epitop können zum Nachweis unspezifischer koreinigender Proteine führen3. Zusätzlich kann die Fusion dieser Epitop-Tags zum N- oder C-Terminal eines Proteins native Protein-Protein-Wechselwirkungen blockieren oder die Proteinfaltung stören, um nicht-physiologische Konformationen zu fördern4. Darüber hinaus überprimieren ektopische Expressionssysteme das Köderprotein in der Regel in supraphysiologischen Konzentrationen, was zur Identifizierung von artefaktischen Proteinwechselwirkungen führen kann, insbesondere bei dosisempfindlichen Genen5. Um diese Probleme zu umgehen, kann das endogene Köderprotein zusammen mit den damit verbundenen interagierenden Beuteproteinen immunpräzipiert werden, vorausgesetzt, es steht ein hochwertiger Antikörper zur Verfügung, der das native Protein erkennt.
Hier ist ein Interaktionsproteomik-Workflow zum Nachweis des nuklearen Interkolonms eines endogene Proteins am Beispiel der CMGC-Proteinkinase DYRK1A vorgesehen. Störung der DYRK1A Kopiernummer, Aktivitätsniveau oder Ausdruck kann schwere geistige Behinderung beim Menschen verursachen, und embryonale Letalität bei Mäusen6,7,8,9. DYRK1A weist eine dynamische raumzeitliche Regulation10und kompartalisierte Proteinwechselwirkungen11,12auf, die Ansätze erfordern, die in der Lage sind, Interaktionspartner mit geringer Häufigkeit zu erkennen, die für verschiedene subzelluläre Kompartimente spezifisch sind.
Dieses Protokoll verwendet die zelluläre Fraktionierung menschlicher HeLa-Zellen in Zytosol- und Nukleoplasmafraktionen, Immunpräzipitation, Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie und einen Überblick über eine bioinformatische Pipeline zur Auswertung der Datenqualität und zur Visualisierung von Ergebnissen, wobei R-Skripte für die Analyse und Visualisierung bereitgestellt werden (Abbildung 1). Proteomics-Softwarepakete, die in diesem Workflow verwendet werden, stehen alle frei zum Download zur Verfügung oder können über eine Web-Oberfläche aufgerufen werden. Weitere Informationen zu Software und Rechenmethoden finden Sie unter den bereitgestellten Links.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 0.1% EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone (HPLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closure</td>
			<td>Caroline Biological Supply Company</td>
			<td>684239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>887845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa QC tryptic digest</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce homogenizer 7 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885301-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl endopeptidase C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>enzo life sciences</td>
			<td>ALX-350-012-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p84 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88341</td>
			<td>LCMS QC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 spin columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>For mass spectrometry sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0780-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica emitter tip</td>
			<td>Pico TIP</td>
			<td>FS360-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885302-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3787K17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 150, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>Tissue culture dish for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7&#181;m Spherical Hybrid (1.7 &#181;m, 75 &#181;m x 250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007484</td>
			<td>nanoflow C18 column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling

Die Immunaffinitätsreinigungsmassenspektrometrie (IP-MS) hat sich als robuste quantitative Methode zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen herausgebildet. Diese Publikation stellt einen vollständigen Workflow für Interaktionsproteomik dar, der entwickelt wurde, um proteinarme Protein-Protein-Wechselwirkungen aus dem Zellkern zu identifizieren, die auch auf andere subzelluläre Kompartimente angewendet werden könnten. Dieser Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, einschussfreie Massenspektrometrie sowie nachgeschaltete Rechenanalyse und Datenvisualisierung. Unser Protokoll ist für die Detektion von kompartifalisierten Wechselwirkungen mit geringer Häufigkeit optimiert, die von ganzen Zelllysaten (z. B. Transkriptionsfaktor-Wechselwirkungen im Zellkern) durch Immunpräzipation endogenes Proteine aus fraktionierte subzelluläre Fächer. Die hier skizzierte Probenvorbereitungspipeline enthält detaillierte Anweisungen für die Herstellung von HeLa-Zellkernextrakt, die Immunaffinitätsreinigung von endogenem Köderprotein und die quantitative Massenspektrometrieanalyse. Wir diskutieren auch methodische Überlegungen zur Durchführung großangelegter Immunpräzipitation in Massenspektrometrie-basierten Interaktionsprofilierungsexperimenten und geben Richtlinien für die Bewertung der Datenqualität, um echtes positives Protein zu unterscheiden. Wechselwirkungen aus unspezifischen Interaktionen. Dieser Ansatz wird hier demonstriert, indem das nukleare Interaktivom der CMGC-Kinase DYRK1A untersucht wird, eine Proteinkinase mit geringer Häufigkeit mit schlecht definierten Wechselwirkungen innerhalb des Kerns.

Der Großteil der in einem IP-MS-Experiment identifizierten Proteinmasse besteht aus unspezifischen Proteinen. Eine der wichtigsten Herausforderungen eines IP-MS-Experiments ist daher die Interpretation, welche Proteine vertrauensvolle Interaktoren im Vergleich zu unspezifischen Interaktoren sind. Um die entscheidenden Parameter zu demonstrieren, die bei der Bewertung der Datenqualität verwendet werden, analysierte die Studie dreifache Immunpräzipitationen aus 5 mg HeLa-Kernextrakt unter Verwendung einer reinen Perlenkontrolle. Die erste interne Überprüfung, um sicherzustellen, dass ein IP-MS-Experiment zuverlässig ist, ist, ob das Köderprotein zu den am höchsten angereicherten Proteinen zählt, die sowohl durch Faltenwechsel als auch durch SAINT-Wahrscheinlichkeit identifiziert werden. In diesem Fall rangierte der Köder DYRK1A unter den drei topierierten Proteinen über die Kontrolle (Abbildung 2A,B). In einer nuklearen Interactome-Studie mit DYRK1A unter Verwendung von vier unabhängigen Antikörpern bot ein FC-A-Cutoff von >3,00 und SAINT-Wahrscheinlichkeitsschnitt >0,7 einen strengen Cutoff zur Identifizierung sowohl neuartiger als auch zuvor validierter Interaktoren22. Bei anwendung auf dieses Experiment konnte eine klare Trennung zwischen den hochkonfidenkigen Interaktoren und >95% der als unspezifisch identifizierten korifizierten Proteine gesehen werden (Abbildung 2A,B). Die Anwendung sowohl einer Faltenänderungsanreicherung als auch der Wahrscheinlichkeitsschwelle erhöht die Stringenz, da eine gleichbleibend hohe Anreicherung von Protein-IDs über biologische Replikationen hinweg erforderlich ist.
Neben der statistischen Bewertung bildet der CRAPome-Analyse-Workflow auch zuvor gemeldete Interaktionen auf Köder-Beute-Datenab 23. Während diese Zuordnung für die Schwelle von Interaktionen mit hohem und niedrigem Vertrauen nützlich sein kann, können zuvor gemeldete Interaktionen durch FC-A- und SAINT-Wahrscheinlichkeiten schlecht bewertet werden, was möglicherweise darauf hindeutet, dass viele bekannte Wechselwirkungen eines bestimmten Köders nur in bestimmten Zelltypen, Kontexten oder Organellen vorhanden sein können. Für das Beispiel-DYRK1A-Dataset waren die FC-A-Werte des iREF-Interagierenden nur 0,45, was eine sehr geringe Anreicherung über die Steuerung darstellt (Abbildung 2C). Um eine Inflation falscher Positivmeldungen zu vermeiden, sollten statistische Schwellenwerte in einer Weise durchgeführt werden, die die Strenge vorrang vor der Reduzierung falscher Negatives priorisiert. Es sei darauf hingewiesen, dass der Nachweis dieser Wechselwirkungen unabhängig von Proteinüberfluss war (Abbildung 2C). Die berechnete absolute Kopiernummer jeder iREF-Interaktion innerhalb von HeLa-Zellen zeigte keine Korrelation mit den Nachweisstufen eines Interaktionspartners durch IP-MS24.
Cytoscape dient als effektives Werkzeug zur Visualisierung mehrerer Ebenen von Interaktionsdaten19. Im hier beschriebenen DYRK1A-Immunpräzipitationsexperiment reduzierte die kombinierte Verwendung von FC-A > 3.0 und SAINT > 0,9 die Liste der hochkonfidenzvertrauten Interaktoren auf sechs Proteine (Abbildung 2D). Bei der isolierten Anwendung eines FC-A-Cutoffs von > 3.0 wurden dem Netzwerk jedoch acht zusätzliche Proteine zugesetzt. Diese zusätzlichen Proteininteraktoren verfügen über eine hohe Konnektivität mit den Interaktoren, die sich bereits im Netzwerk befinden, was darauf hindeutet, dass sie in ähnlichen Komplexen oder funktionalen Rollen assoziiert sind. Zu diesem Zweck wurden Beweise aus dem STRING-DB von Protein-Protein-Wechselwirkungen als blaue gestrichelte Linien20in dieses Netzwerk integriert. Während dieses dreifache Einzelbait-Experiment eine begrenzte Stichprobe des vollständigen DYRK1A-Interaktionsnetzwerks bietet, kann die Verwendung zusätzlicher Köder, Replikationen und integrationen großer öffentlicher Datensätze verwendet werden, um das Netzwerk hochvertrauensstarker Interaktionen zu erweitern. Die statistischen Abschnitte sind daher für jedes einzelne Experiment spezifisch und müssen gründlich bewertet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentativer Proteomik-Workflow für subzelluläre suläre IP-MS. Die Zellen werden entweder in 4 L runden Bodenkolben oder 15 cm Gewebekulturschalen angebaut und gleichzeitig zur subzellulären Fraktionierung geerntet. Die Zellen werden in ein zytosolisches, nukleares und ein nukleares Pellet fraktioniert, und Immunpräzipitationen werden aus 1bis 10 mg Kernlysat mit einem oder mehreren Antikörpern durchgeführt, die denselben Köder erkennen. Filtergestützte Probenvorbereitung (FASP) und Offline-Probenbereinigung werden vor der Einzelaufnahme-Massenspektrometrie durchgeführt. Eine nachgelagerte Berechnungspipeline wird verwendet, um Daten in interpretierbare Interaktionsdaten zu verarbeiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Daten für ein IP-MS-Experiment mit einem Einzigen-Köder-Antikörper. (A) FC-A und SAINT Wahrscheinlichkeitsausgabe aus dem CRAPome-Analyse-Workflow für ein optimales Experiment mit einem einzigen Antikörper für die Kinase DYRK1A (n = 3). Für den Vergleich wurden nur Beads-Kontrollen verwendet. Rote durchgezogene Linien stellen Trennlinien dar, die auf FC-A > 3.00 und SAINT > 0.7 gesetzt sind. (B) MaxQuant Proteinabundance estimates (iBAQ) output vs. log2 ratio of protein abundance in DYRK1A IP to control, colored by the adjusted p value range from empirical Bayes analysis of the label-free intensities. (C) FC-A und geschätzte Kopierzahl der Proteine, die in der iRef-Datenbank als interagierende Proteine aufgeführt sind23,24. (D) Visualisierung des Cytoscape-Netzwerks von DYRK1A-Interaktoren. Blaue Knoten = FC-A > 3.00, SAINT > 0.7. Orange Knoten = FC-A > 3.00. Schwarze Kanten = Proteine, die im IPMS-Experiment als Interaktoren identifiziert wurden. Blau gestrichelte Kante = SAINT-Interaktion zwischen Beuteprotein (Vertrauen > .150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Protease-Inhibitor (PI)-Mischung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriummetabisulfit</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Benzamidin</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)</td>
			<td>0,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Phosphatase-Inhibitor (PhI)-Mischung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mikrocystin LR</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium-Orthovanadate</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natriumfluorid</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Subzelluläre Fraktionierungspuffer:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Puffer A pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Puffer B pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerin</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Puffer C pH 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td>
			<td>0,4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerin</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Immunpräzipitationspuffer:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP-Puffer 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerin</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP-Puffer 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0,1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glycerin</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS Alkylierungspuffer pH 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sds</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Chloracetamid</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>TCEP</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reagenz</td>
			<td>Endgültige Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Harnstoff</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>0,1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* HPLC-Grade H2O verwenden</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Pufferzusammensetzungen
Ergänzende Codierungsdateien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Described ist ein Proteomik-Workflow zur Identifizierung von Proteininteraktionspartnern aus einer nuklearen subzellulären Fraktion mithilfe der Immunaffinitätsanreicherung eines bestimmten Proteins von Interesse und der etikettenfreien Massenspektrometrie. Der Workflow umfasst subzelluläre Fraktionierung, Immunpräzipitation, filtergestützte Probenvorbereitung, Offline-Bereinigung, Massenspektrometrie und eine nachgelagerte Bioinformatik-Pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Dieser Proteomik-Workflow ermöglicht die unvoreingenommene Identifizierung und Kartierung endogener Protein-Protein-Wechselwirkungen mit subzellulärer Auflösung. Diese Technik ist besonders vorteilhaft bei der Untersuchung von Köderproteinen, die dosierempfindlich sind, geringe Häufigkeit, oder mehrere subzelluläre Lokalisationen haben. Diese Methode könnte auf die Kartierung endogenes Proteinwechselwirkungen angewendet werden, vorausgesetzt, es ist ein geeignetes Affinitätsreagenz verfügbar.Dies ist besonders wichtig für viele der Tausenden von Proteinen, die unbekannte Funktion haben, von denen viele mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurden. Diese Methode kann an jede Zelllinie oder jedes Gewebe angepasst werden, das für eine subzelluläre Fraktionierung geeignet ist. Jedes Protein mit einem geeigneten Affinitätsreagenz könnte gezielt eingesetzt werden.Ein gemeinsames Ergebnis für Affinitätsreinigungsexperimente ist oft kein Ergebnis. Wirklich gute Reagenzien, das Sammeln von QC-Daten durchgängig und die Begrenzung der Probenhandhabung sind wirklich wichtig. Wissen Sie, dass Sie ein Beispiel haben.Zunächst die vorbereiteten Zellpellets 15 Minuten lang im 1X Pelletvolumen des Kaltpuffers A mit Proteasehemmern oder Phosphataseinhibitoren auftauen. Legen Sie das Rohr mit dem Zellpellet auf einen Nutator bei vier Grad Celsius, um bei der Resuspension für 30 Minuten zu helfen. Dann legen Sie das Rohr in einer Zentrifuge bei 2 000 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten zu Pellet.Dekantieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit dem 5-fachen der gepackten Zellvolumen mit Puffer A.Incubate auf Eis für 20 Minuten wieder auf. Als nächstes pellet wieder bei 2.000 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Den Puffer dekantieren und mit dem 2X original verpackten Zellvolumenpuffer A mit Protease-Inhibitoren oder Phosphatase-Inhibitoren wieder aufsetzen.Etwa sieben Mal mit dem lockeren Stößel A.Zentrifuge das Lysat für 10 Minuten bei 2 000 mal g und vier Grad Celsius abprallen. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig auf ein neues Rohr und blitzen Sie ihn mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie das Lysat bei minus 80 Grad Celsius auf.Das Pellet mit 0,9-fachem Pelletvolumen des Puffers B mit Proteasehemmern oder Phosphatase-Inhibitoren aussetzen und fünf Minuten bei vier Grad Celsius auf einem Nutator mischen. Um die Kerne zu lysieren, 20 Mal mit dem Titerpestle B.Mix das Kernlysat auf einem Nutator für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, so dass es homogen ist. Dann zentrifugieren Sie das Kernlysat für 30 Minuten bei 21.000 mal g bei vier Grad Celsius.Pipette aus dem Überstand und speichern als löslicher Kernproteinextrakt. Um den löslichen Kernextrakt zu dialysieren, schneiden Sie zunächst eine entsprechende Länge von 24 Millimeter breite Dialyseschläuche mit einem acht Kilodalton Molekulargewicht Cutoff. Klemmen Sie eine Seite des Schlauches und laden Sie das Nukleoplasma in den Schlauch.Nach dem Laden des Lysats das andere Ende einklemmen und in einen sauberen Glasbehälter mit Puffer C mit Proteaseinhibitoren eintauchen. Dialyze für drei Stunden bei vier Grad Celsius. Danach den dialysierten Kernextrakt Nukleoplasma in ein Rohr und zentrifugieren bei 21.000 mal g bei vier Grad Celsius für 30 Minuten.Übertragen Sie drei 20 Mikroliter Aliquots des Kernextrakts auf neue Mikrozentrifugenrohre zur Fraktionierungsvalidierung durch Western Blot. Mit Pipettenspitzen, die an der Spitze geschnitten wurden, bereiten Sie eine Protein-A/G-Perlenmischung für jede Replikation vor, indem Sie 12,5 Mikroliter Perlenvolumen von Protein A Sepharose mit 12,5 Mikroliter Protein G Sepharose in Mikrozentrifugenröhren kombinieren. Waschen Sie das Protein A/G Perlengemisch zweimal mit 300 Mikroliter IP-Puffer I.Spin die Perlen bei 1, 500 mal g bei vier Grad Celsius für eine Minute und dekantieren Sie den Puffer.Als nächstes bereiten Sie das Antikörperprotein A/G Perlen vor. Um den Antikörper an die Perlen zu binden, fügen Sie dem Rohr 300 Mikroliter IP-Puffer I und 10 Mikrogramm des gewünschten Antikörpers hinzu. Lassen Sie die Perlen-Antikörper-Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Nutator schaukeln.Jetzt aliquot entsprechende Volumen der kernnuklearen Lysate in niedrig retentionsarme Mikrozentrifugenröhren für ein Milligramm Proteineinsatz pro Replikation. Drehen Sie das Lysat 30 Minuten lang bei 16.000 mal g und übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr. Fügen Sie einen Mikroliter Benzonase bei 250 Einheiten pro Mikroliter für jedes Milligramm des Kernlysats und Gesteins auf einem Nutator bei vier Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten hinzu.Um Perlen für die Vorklärung des Lysats vorzubereiten, fügen Sie 12,5 Mikroliter jedes Proteins A und Protein G Perlen zu 1,5 Milliliter Niedrigretentionsröhrchen hinzu. Waschen Sie zwei Mal mit IP-Waschpuffer I mit Proteasehemmern. Dekantieren Sie den Puffer und fügen Sie ein Milligramm des vorbereiteten Kernlysats zu den Perlen hinzu.Eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem Nutator schaukeln. Zentrifuge die vorgeklärten Lysate bei 1, 500 mal g und vier Grad Celsius für eine Minute. Dann waschen Sie das Antikörperprotein A oder G Perlen zweimal mit IP-Puffer I mit Proteasehemmern.Nach zentrifugieren bei 1, 500 mal g und vier Grad Celsius für eine Minute, dekantieren Sie den Puffer. Übertragen Sie nun das vorab gereinigte Kernlysat auf das Antikörperprotein A oder G Perlen. Vier Stunden lang beim Schaukeln auf einem Nutator bei vier Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1, 500 mal g und vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand in Rohre, die als Durchfluss für jede Replikation gekennzeichnet sind. Waschen Sie das Antikörperprotein A oder G mit einem Milliliter IP-Puffer II mit Proteaseinhibitoren viermal.Dann waschen Sie die Perlen zwei Mal mit einem Milliliter IP-Puffer I mit Proteasehemmern. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Puffer nach der letzten Wäsche entfernt wird. Elute Protein aus den Perlen durch Inkubation mit 20 Mikroliter 0,1 Molarenglycin bei pH 2,75 jeweils für 30 Minuten auf einem Nutator.Dann drehen Sie bei 750 mal g und vier Grad Celsius für eine Minute und Pipette aus dem Überstand. Wiederholen Sie diese Inkubation mit Elutionspuffer ein zweites Mal. Nach der Zubereitung des Proteinpellets mit 30 Mikroliters SDS-Alkylierungspuffer wieder aufsetzen.Inkubieren Sie die Probe auf einem 95 Grad Celsius Hitzeblock für fünf Minuten. Dann bei Raumtemperatur 15 Minuten abkühlen lassen. Fügen Sie 300 Milliliter UA-Lösung und 30 Mikroliter 100 Millimolar TCEP zu jeder Probe hinzu.Laden Sie die Lösung auf einen 30K-Zentrifugalfilter. Nach dem Spinnen des Zentrifugalfilters bei 21.000 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten, halten Sie den Durchfluss durch, falls es ein Problem mit dem Filter gibt. Nach dem Waschen des Filters nach dem Manuskript, fügen Sie drei Mikroliter eines Mikrogramms pro Mikroliter Lyse C resuspended in 0,1 Molar Tris pH 8,5.Füllen Sie die Filter bis zur 100-Mikroliter-Marke mit 0,1 Molaren Tris pH 8,5. Lassen Sie es für eine Stunde bei 37 Grad Celsius verdauen, während auf einem Nutator schaukeln. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter von einem Mikrogramm pro Mikroliter MS-Grade Trypsin hinzu.Mischen Sie sanft und lassen Sie das Trypsin mit der Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius beim Schaukeln auf einem Nutator inkubieren. Am Morgen zentrifugieren Sie mehrmals bei 21.000 mal g für 20 Minuten, um die Peptide aus dem Filter in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr mit geringer Retention zu löschen. Nach der Entsalzung der Peptide mit C18-Spin-Säulen, setzen Sie die lyophilisierten Peptide in sieben Mikrolitern von 0,1%TFA in 5%Acetonitril aus.Beschallen Sie die Probe für drei Minuten, um sicherzustellen, dass die Peptide resuspendiert wurden, und drehen Sie dann bei 14.000 mal g für 10 Minuten. 15 bis 30 % der Probe zur Analyse auf das Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometriesystem laden. In dieser Studie, Dreifach-Immunpräzipitationen wurden aus fünf Milligramm HeLa Kernextrakt unter Verwendung einer Perle-nur-Kontrolle analysiert.Der Köder DYRK1A zählte zu den drei topierierten Proteinen über die Kontrolle, was darauf hindeutet, dass das durchgeführte IP-MS-Experiment zuverlässig war. Es wurde eine klare Trennung zwischen den interinierten Interaktoren mit hohem Vertrauen gezeigt, und mehr als 95 % der korifizierten Proteine wurden als unspezifisch identifiziert. Für das Beispiel-DYRK1A-Dataset haben IREF-Interaktionspartner FC-A-Werte von nur 0,45 angezeigt, was eine sehr geringe Anreicherung über die Steuerung darstellt.Dementsprechend sind viele dieser zuvor gemeldeten Interaktionen falsche Negative innerhalb dieses Datensatzes, indem sie unter den FC-A-Schwellenwert von drei fallen. Die berechnete absolute Kopiernummer jeder IREF-Interaktion zeigte keine Korrelation zu den Erkennungsstufen eines Interaktionspartners durch IP-MS. Die kombinierte Verwendung von FC-A größer als drei und Heiliger größer als 0,9 reduzierte die Liste der hochvertrauensigen Interaktoren auf sechs Proteine.Bei der Anwendung eines FC-A-Cutoffs von mehr als drei isolierten Dateien wurden dem Netzwerk jedoch acht zusätzliche Proteine zugesetzt. Der wichtigste Teil dieses Protokolls ist die Auswahl von Antikörperreagenz gegen Immunpräzipation. Vor Abschluss dieses Workflows wird die Validierung der Selektivität durch Western Blot oder Coomassie empfohlen.Belege für Protein-Protein-Wechselwirkungen können durch Co-IP-Western-Blotting identifizierter Interaktoren gefunden werden. Proteinchemische Vernetzung, obwohl komplexer, kann Interaktionsbereiche von Interaktoren offenbaren. Mit dieser Methode hat meine Forschungsgruppe neue Funktionen für DYRK1A entdeckt, eine Proteinkinase, die für die Entwicklung des Gehirns von Säugetieren erforderlich ist und mit der Neuropathologie der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht wird.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impeddance-Based GPCR Assays

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...