Name: label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק האתגר W.M.O. ממכון לינדה Crnic עבור תסמונת דאון ועל ידי הסכם שיתופי DARPA 13-34-RTA-FP-007. אנו רוצים להודות לג קורלנד ולקירה קואזלינו על תרומתם בקריאה והערות על כתב היד.

<ol>
	<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group.">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li><li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification.">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li><li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+'nonspecific'+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1.">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52 (2015).</li><li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+the+ends:+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7.">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10, 715-721 (2013).</li><li>Bronicki, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+new+cases+further+delineate+the+syndromic+intellectual+disability+phenotype+caused+by+mutations+in+DYRK1A.">Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A.</a> European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).</li><li>Antonarakis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+syndrome+and+the+complexity+of+genome+dosage+imbalance.">Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance.</a> Nature Reviews Genetics. , (2016).</li><li>Dowjat, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy-driven+overexpression+of+DYRK1A+kinase+in+the+brain+of+subjects+with+Down+syndrome.">Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome.</a> Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).</li><li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice.">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li><li>H&#228;mmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb/Dyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development.">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li><li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+MNB/DYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome.">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).</li><li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis.">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAINT:+Probabilistic+scoring+of+affinity+purificationg-mass+spectrometry+data.">SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 8, 70-73 (2011).</li><li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape:+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks.">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li><li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair.">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539 (2019).</li><li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iRefIndex:+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance.">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li><li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance.">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).</li></ol>

. למחברים אין מה לגלות

זרימת העבודה של פרוטאומניקס המתוארים כאן מספקת שיטה יעילה לזיהוי מערכות חלבונים בעלי ביטחון גבוה לחלבון מעניין. גישה זו מקטינה את המורכבות לדוגמה באמצעות שבריר subcellular ומתמקדת להגדיל את האינטראקציה ההזדהות שותפים באמצעות הכנה לדוגמה חזקה, לדוגמה מנותק לנקות, ובקרת איכות מחמירים של מערכת LC-MS. ניתוח הנתונים במורד הזרם המתואר כאן מאפשר הערכה סטטיסטית פשוטה של החלבונים המזוהים באמצעות הפיתיון. עם זאת, בשל מספר גבוה של משתנים ניסיוניים (קנה מידה, קו תא, בחירת נוגדנים), כל ניסוי דורש תפשטחשבתי שונים ושיקולים לגבי הדמיית נתונים והעשרה.
שיקול העיצוב הראשון בניסוי ה-IP-MS הוא הבחירה של נוגדנים שישמשו לשימוש בחלבון של הריבית יחד עם השותפים האינטראקציה שלה. בעוד הזמינות של נוגדנים מסחריים התרחב כדי לכסות חלקים גדולים יותר של האדם במהלך העשורים האחרונים, יש עדיין חלבונים רבים שבהם ריאגנטים מוגבלים. יתר על כן, נוגדנים שאומתו עבור יישומים כגון גילוי כתמי מערביות לא יכול להיות מסוגל העשרה סלקטיבית של חלבון היעד בניסוי immunoprecipitation. לפני ביצוע הניסוי בקנה מידה גדול אינטראקציה פרוטרומאנים, הוא הציע להשלים IP מ 90% confluent 10 ס מ הצלחת, או מספר סלולרי שווה ערך, ולבדוק את חלבון היעד של עניין על ידי בלוק המערבי. אם יותר מאשר נוגדן אחד זמין עבור immunoprecipitation, זה הציע בנוסף לבחור מספר רב של נוגדנים לזהות בתוך חלקים שונים של החלבון. הכריכה של נוגדן לחלבון פיתיון יכולה לבטל את ממשק הכריכה הדרוש לשותפים באינטראקציה. בחירת אפירופה משנית לחלבון הפיתיון תגדיל את הכיסוי של פרופיל האינטראקציה המזוהה על-ידי ניסוי מבוסס ספקטרומטריה מאסיבית.
שיקול מרכזי נוסף נמצא בבחירה של השליטה המתאימה להבחנה בין אינטראקציות ביטחון גבוה לבין האינטראקציות בעלי ביטחון נמוך או יחסי גומלין לא ספציפיים מאלה המזוהים באמצעות הפיתיון. השליטה המחמירים ביותר עבור ניסוי ה-IP-MS היא להשלים את הimmunoprecipitation מתוך קו תא CRISPR KO של הפיתיון. שליטה כזו מאפשרת זיהוי וסינון של חלבונים שאינם ספציפיים הקושרים ישירות לנוגדן ולא לחלבון פיתיון. במקרים שבהם הפקת קו תא CRISPR KO של כל חלבון פיתיון אינו אפשרי, בקרת IgG-חרוז של אותו סוג איזוזה של נוגדן פיתיון ניתן להשתמש. בניסויים המעסיקים פאנל של נוגדנים המייצגים מינים מרובים, השימוש בחרוזים רק שליטה יכול להיות מתאים, אבל יגדל את הקצב של תוצאות חיוביות שווא שזוהו כמו שחקנים ביטחון גבוה.
בחירת קו התא המשמש בניסוי IP-MS תלויה במספר גורמים מרכזיים. ביטוי ולוקליזציה של חלבון תלויים במידה רבה בסוג התא. בעוד הערכות ביטוי RNA ניתן למצוא עבור רוב הגנים בקווים רבים בשימוש נפוץ, חלבון הביטוי הוא מתואם לגרוע עם ביטוי RNA וחייב להיות נחוש25. קווי תא בהם חלבון פיתיון מבוטא במספר העתק נמוך מאוד יש להימנע כדי לעקוף בעיות הקשורות לעלייה דרסטית בקנה מידה של תרבות התא שעשוי להידרש. יש לציין, עם זאת, כי הכנה לדוגמה יכולה להיות ממוטבת לאיתור חלבונים שפע נמוך מאוד. המסנן באמצעות מסנן בסיוע לדוגמה (FASP) שיטה, בעוד חסון, יכול לגרום יותר מ 50% אובדן של פפטיד במדגם. ההכנה לדוגמה המשופרת (SP3) היא שיטה יעילה ליצירת דגימות עבור ניתוח ספקטרומטר המסה הממזער את ההפסד לדוגמה26. ההתאוששות מוגברת מופעלת על-ידי שיטת SP3 של הכנה לדוגמה יכולה להיות חלופה שימושית בזרימת עבודה זו עבור כימות של חלבונים הנופלים קרוב למגבלת הזיהוי.
זו זרימת העבודה פרוטאומניקס הוחל על הרבה baits גרעיני, כולל הקינסים, E3 אוביקוויב ליגטיות, והפיגומים חברים של מתחמים multisubunit. בהנחה אימות נאות של ריאגנטים נוגדן, ביצוע מוצלח של זרימת עבודה זו תגרום לזיהוי של שותפים בעלי ביטחון גבוה לאינטראקציה גרעינית חלבון עבור חלבון של עניין.

הפרוטדום האנושי מציג גיוון מבניים וביוכימיים רחב באמצעות היווצרות של מתחמי מולטיתת יציבים ואינטראקציות של חלבונים בחלבון ארעי. לכן, הזיהוי של שותפים אינטראקציה עבור חלבון של עניין נדרש בדרך כלל בחקירות כדי לפענח מנגנון מולקולרי. ההתקדמות האחרונה בפרוטוקולי טיהור הזיקה והופעתו של מכשור מהיר לסריקה מהירה ברזולוציה גבוהה הפעילה מיפוי קל של נופים של החלבון בניסוי חד משוחדת.
הפרוטוקולים לאינטראקציה עם חלבונים מעסיקים בדרך כלל מערכות ביטוי חוץ רחמי עם בונה היתוך מתויג באמצעות זיקה לזיהוי אינטראקציות חלבונים מבלי לדרוש נוגדנים באיכות גבוהה הכרת חלבון של ריבית1,2. עם זאת, בשיטות המבוססות על תגים בעלי מספר חסרונות. אינטראקציות פיזיות עם האפירופה עלולות לגרום לגילוי חלבונים שאינם ספציפיים לגוף3. בנוסף, היתוך של אלה התגים האפיטוניים ל-N-או C-מסוף של חלבון עלולים לחסום אינטראקציות חלבון-חלבון מקוריות, או לשבש את קיפול החלבון כדי לקדם את הקונמציות שאינן פיזיולוגיות4. יתר על כן, מערכות ביטוי חוץ רחמי בדרך כלל לבטא את החלבון פיתיון בריכוזים supraפיסיולוגיים, אשר יכול לגרום לזיהוי של אינטראקציות החלבון העובדתי, במיוחד עבור גנים מינון רגיש5. כדי לעקוף בעיות אלה, חלבון פיתיון האנדוגניים יכול להיות immunoprecipitated יחד עם משויכים החלבונים טרף הקשר, בהנחה זמינות של נוגדן באיכות גבוהה המכיר את חלבון יליד.
בתנאי כאן היא זרימת עבודה פרוטאומניקס אינטראקציה לזיהוי interactome גרעינית של חלבון אנדוסוגני באמצעות החלבון CMGC קינאז DYRK1A כדוגמה. הפרעה של מספר העתק DYRK1A, רמת הפעילות, או ביטוי יכול לגרום לנכות אינטלקטואלית חמורה בבני אדם, ו מתחלקים עובריים בעכברים6,7,8,9. DYRK1A מציג בתקנה דינמית של מכשירים מיוחדים10, ואינטראקציות חלבונים ממדר11,12, הדורשות גישות המסוגלת לזהות שותפים האינטראקציה שפע נמוך ספציפיים לתאי subcellular שונים.
פרוטוקול זה מעסיק שבירה תאית של תאי החלה של האדם לתוך שברים ציטומיים, immunoprecipitation, הכנה לדוגמא לספקטרומטר מסה, וסקירה של צינור ביולוגי להערכת איכות הנתונים והצגת תוצאות, עם הסקריפטים R הניתנים לניתוח והדמיה (איור 1). התוכנה פרוטאומניקס חבילות המשמשות בזרימת עבודה זו הם כולם זמינים באופן חופשי להורדה או ניתן לגשת דרך ממשק אינטרנט. לקבלת מידע נוסף על שיטות תוכנה וחישוביות, לימוד מעמיק והדרכה זמינים בקישורים המסופקים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 0.1% EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone (HPLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closure</td>
			<td>Caroline Biological Supply Company</td>
			<td>684239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>887845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa QC tryptic digest</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce homogenizer 7 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885301-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl endopeptidase C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>enzo life sciences</td>
			<td>ALX-350-012-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p84 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88341</td>
			<td>LCMS QC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 spin columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>For mass spectrometry sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0780-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica emitter tip</td>
			<td>Pico TIP</td>
			<td>FS360-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885302-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3787K17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 150, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>Tissue culture dish for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7&#181;m Spherical Hybrid (1.7 &#181;m, 75 &#181;m x 250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007484</td>
			<td>nanoflow C18 column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling

הספקטרום של טיהור חיסוני המסה (IP-MS) התפתחה כשיטה כמותית איתנה לזיהוי אינטראקציות חלבונים-חלבון. פרסום זה מציג את זרימת העבודה מלאה פרוטאומניקס המיועד לזיהוי האינטראקציות חלבון-חלבון נמוכה מהגרעין שניתן גם להחיל על תאים אחרים subcellular. זרימת עבודה זו כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר המסה ללא תווית בודדת, ו-במורד ניתוח חישובים והדמיית נתונים. הפרוטוקול שלנו הוא אופטימיזציה לזיהוי ממדר, שפע האינטראקציות נמוכה, כי הם קשים לזהות מפני התאים השלם (למשל, שעתוק מקדם אינטראקציות בגרעין) על ידי immunoprecipitation של חלבונים אנדוגניים מ תאי משנה בעלי משבר תאי. צינור ההכנה לדוגמה המתואר כאן מספק הוראות מפורטות להכנת התמצית הגרעינית של תא הלה, טיהור הזיקה של חלבון פיתיון אנדוגני, וניתוח ספקטרומטר מסה כמותי. אנו דנים גם בשיקולים מתודולוגיים לביצוע הimmunoprecipitation בקנה מידה גדול בניסויים ביצירת פרופילים בעלי מערכת המבוססת על ספקטרומטר המסה, ומספקים קווים מנחים להערכת איכות הנתונים כדי להבחין בין חלבון אמיתי וחיובי אינטראקציות מאינטראקציות שאינן ספציפיות. גישה זו מוכחת כאן על ידי חקירת interactome גרעינית של CMGC קינאז, DYRK1A, חלבון שפע נמוך קינאז עם אינטראקציות מוגדרות גרוע בתוך הגרעין.

רוב מסת החלבון המזוהה בניסוי ה-IP-MS מורכבת מחלבונים שאינם ספציפיים. לפיכך, אחד האתגרים המרכזיים של ניסוי ה-IP-MS הוא הפרשנות שבה חלבונים הם שחקנים בעלי ביטחון גבוה לעומת שחקנים שאינם ספציפיים. כדי להדגים את הפרמטרים הקריטיים המשמשים הערכה של איכות הנתונים המחקר ניתח טריפליכאט immunoprecipitations מ 5 מ ג של החילוץ הגרעיני הלה ניצול חרוז רק שליטה. הבדיקה הפנימית הראשונה כדי להבטיח שניסוי ה-IP-MS הוא אמין אם החלבון הפיתיון מדרג כאחד החלבונים המועשרת ביותר המזוהים על-ידי שינוי הקיפול באמצעות שליטה והסתברות קדושה. במקרה זה, הפיתיון DYRK1A המדורגים בין שלושת החלבונים המועשרת על פני השליטה (איור 2A,B). במחקר interactome גרעינית של DYRK1A ניצול ארבעה נוגדנים עצמאיים, FC-A הפסקת של > 3.00 וההסתברות סנט הסתברות > 0.7 סיפק ניתוק מחמיר לזיהוי של שני שחקנים בעבר אומת22. בעת החלתם על ניסוי זה, ניתן לראות הפרדה ברורה בין השחקנים הבין-ביטחון הגבוה לבין > 95% מהחלבונים הקווריתים המזוהים כאינם ספציפיים (איור 2A,B). החלת העשרה של שינוי מתקפל וסף הסתברות מגבירה את החריפות על-ידי דרישה להגברת מזהי חלבונים באופן עקבי באמצעות שכפול ביולוגי.
בנוסף לניקוד הסטטיסטי, זרימת העבודה בניתוח "מפות" ממפה גם את האינטראקציות שדווחו בעבר על נתוני הפיתיון23. למרות שמיפוי זה יכול להיות שימושי עבור אינטראקציות מסף ביטחון גבוה ובטחון נמוך, אינטראקציות שדווחו בעבר יכולות להבקיע בצורה לא טובה על-ידי FC-A ו-SAINT, המעידים על כך שרבים מהאינטראקציות הידועות של פיתיון נתון קיימות רק בסוגי תאים ספציפיים, הקשרים או אורגלים. לדוגמה DYRK1A dataset, iref אינטראקטור חקן FC-ערכים היו נמוכים כמו 0.45, המייצגים שליטה מאוד נמוכה על העשרה (איור 2c). כדי למנוע האינפלציה של תוצאות חיוביות כוזבות, יש לבצע את הסף הסטטיסטיות באופן שקובע סדר עדיפויות לגבי הפחתת התשלילים השקרית. יצוין כי הגילוי של אינטראקציות אלה היה עצמאי שפע של חלבון (איור 2C). מספר העתק מוחלט של כל אינטראקציה iREF בתוך תאי הלה לא הראה מתאם לרמות הזיהוי של שותף אינטראקציה על-ידי IP-MS24.
ציטוסקייפ משמש כלי יעיל להמחיש שכבות מרובות של נתונים אינטראקציה19. בניסוי DYRK1A immunoprecipitation המתואר כאן, השימוש המשולב של FC-A > 3.0 ו-SAINT > 0.9 הפחיתה את הרשימה של שחקנים בעלי ביטחון גבוה כדי שישה חלבונים (איור 2D). עם זאת, בעת החלת FC-A חיתוך של > 3.0 בבידוד, שמונה חלבונים נוספים נוספו לרשת. אלה שחקנים חלבון נוספים יש קישוריות גבוהה עם האינטרקטורים כבר ברשת, מציע שהם משויכים מתחמי דומים או תפקידים פונקציונליים. למטרה זו, הוכחה מהמחרוזת-DB של אינטראקציות חלבונים-חלבון שולבו ברשת זו כמו קווים מקווקווים כחול20. בעוד שניסוי מטריפליקט זה מספק מדגם מוגבל של הרשת הDYRK1A המלאה של האינטראקציה, ניתן להשתמש בשימוש ב-baits, בשכפל ובשילוב של ערכות נתונים ציבוריות גדולות כדי להרחיב את הרשת של אינטראקציות ביטחון גבוה. הקוטופס הסטטיסטי יהיה ספציפי לכל ניסוי בודד ויהיה צורך להעריך ביסודיות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg"> איור 1: הנציגה המייצגת את זרימת העבודה של ה-IP-MS משנה. תאים מגודלים ב 4 L עגול מבחנות התחתונה או 15 ס מ מנות התרבות רקמה וקצרו באותו זמן לשבר הסלולר. תאים מסולשים לתוך ציטוסולג, גרעיני, וכפה גרעיני, ו immunoprecipitations נעשים מ 1-10 מ ג של ליפוסט גרעיני באמצעות נוגדנים אחד או מספר לזהות את אותו פיתיון. סינון בסיוע לדוגמה (FASP) וניקוי מדגם לא מקוון מתבצעים לפני הספקטרומטר המסה היחיד שנורה. צינור חישוב במורד הזרם משמש לעיבוד נתונים לתוך מידע על אינטראקציה בין הטבלאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg"> איור 2: נתוני הנציג לניסוי ה-IP-MS חד-ממדי של נוגדן אחד. (א) FC-A ו-SAINT פלט הסתברות מתוך תהליך בדיקה מיטבית לניסוי אופטימלי באמצעות נוגדן יחיד עבור קינאז DYRK1A (n = 3). בקרות חרוזים בלבד שימשו להשוואה. קווים מוצקים אדומים מייצגים להגדיר תפשטחשבתי ב-FC-A > 3.00 ו-SAINT > 0.7. (ב) הערכות שפע של חלבון מקסקואנט (iBAQ) לעומת היחס log2 של שפע חלבונים ב DYRK1A IP לשלוט, בצבע על ידי טווח הערכים p מותאם מניתוח bayes ניסיוני של עוצמות התווית חינם. (ג) מספר העותקים המשוער של החלבונים המפורטים כאינטראקציה בין חלבונים במסד הנתונים של iref23,24. (ד) ציטוסקייפ הדמיית רשת של DYRK1A הבינשחקנים. צמתים כחולים = FC-A > 3.00, סנט > 0.7. צמתי תפוז = FC-A > 3.00. קצוות שחורים = חלבונים המזוהים כשחקנים בניסוי IPMS. מקווקו כחול קצה = אינטראקציה הקדוש בין הטרף חלבון (ביטחון >. 150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">תערובת מעכבי פרוטאז (PI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריאגנט</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>נתרן מטאביסולפיט</td>
			<td>1 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>בנזיל</td>
			<td>1 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>דיתיוטרטינול (DTT)</td>
			<td>1 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>פנילתסולולפוניל פלופ (PMSF)</td>
			<td>0.25 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">תערובת פוספספטאז (פי)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריאגנט</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיקרוקיסטין LR</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>סודיום אורטודבנאט</td>
			<td>0.1 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>נתרן פלואוריד</td>
			<td>5 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגרי שבירה משניים:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר A pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריאגנט</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל ביטון</td>
			<td>10 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>10 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר B pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריאגנט</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל ביטון</td>
			<td>20 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל שלמה</td>
			<td>420 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>החומצה האמאורית (EDTA)</td>
			<td>0.4 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>גליצרול</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר C pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריאגנט</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל ביטון</td>
			<td>20 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>100 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>החומצה האמאורית (EDTA)</td>
			<td>0.4 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>גליצרול</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגרי מImmunoprecipitation:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר ה-IP 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריאגנט</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל ביטון</td>
			<td>20 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>150 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>אדטה</td>
			<td>0.1 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>גליצרול</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר ה-IP 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריאגנט</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל ביטון</td>
			<td>20 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>אשלגן כלורי</td>
			<td>500 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>אדטה</td>
			<td>0.1 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>גליצרול</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מאגר אלקיללציה pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריאגנט</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>שירותי המשך</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>כלורואצטאמיד</td>
			<td>40 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>בעלי מארז</td>
			<td>10 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריס</td>
			<td>100 ממ '</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ה8.5 UA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריאגנט</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
		</tr>
<tr>
<td>אוריאה</td>
			<td>8 מ '</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריס</td>
			<td>0.1 מ '</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* השתמש בכיתות לציון H2O</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1: קומפוזיציות מאגר
משלים קבצי קידוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

זרימת עבודה זו של פרוטומיקה מאפשרת זיהוי ומיפוי בלתי משוחדים של אינטראקציות אנדוגניות של חלבוני חלבון עם רזולוציה תת-תאית. טכניקה זו היא יתרון במיוחד בעת חקירת חלבוני פיתיון רגישים מינון, שפע נמוך, או יש לוקליזציה subcellular מרובים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מיפוי אינטראקציות חלבון אנדוגני בהנחה שיש reagent זיקה מתאים זמין.זה חשוב במיוחד עבור רבים מאלפי חלבונים בעלי תפקוד לא ידוע, שרבים מהם קושרו עם מחלה אנושית. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכל קו תא או רקמה נוחה שבר תת תאי. כל חלבון עם זיקה מתאימה יכול להיות ממוקד.תוצאה נפוצה עבור ניסויי טיהור זיקה היא לעתים קרובות אין תוצאה. רייגנטים ממש טובים, איסוף נתוני QC לאורך כל הדרך והגבלת הטיפול בדגמים הם כולם חשובים באמת. דע שיש לך דגימה.כדי להתחיל, להפשיר את כדורי התא מוכן במשך 15 דקות בנפח גלולה 1X של חיץ קר A עם מעכבי פרוטאז או מעכבי פוספטאז. מניחים את הצינור המכיל את גלולת התא על מטור בארבע מעלות צלזיוס כדי לסייע בהקפאה במשך 30 דקות. ואז למקם את הצינור בצנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה.Decant supernatant ו resuspend התאים עם 5X נפח התא ארוז עם חיץ A.Incubate על הקרח במשך 20 דקות. לאחר מכן, גלולה שוב ב 2, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. Decant המאגר ולתלות מחדש עם חיץ נפח תא ארוז 2X A עם מעכבי פרוטאז או מעכבי פוספטאז.לנקום בערך שבע פעמים עם העלי הרופף A.צנטריפוגה lysate במשך 10 דקות ב 2, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס. מעבירים בזהירות את העל-טבעי לצינור חדש ומקפיאים אותו בחנקן נוזלי. אחסן את הלט במינוס 80 מעלות צלזיוס.יש לחדש את גלולה עם נפח גלולה 0.9X של חיץ B עם מעכבי פרוטאז או מעכבי פוספטאז ולערבב על מגוז במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי ללקט את הגרעינים, יש לשטוף 20 פעמים עם העלי הטיטר B.Mix את הלסת הגרעינית על מטור במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, כך שהוא הומוגני. ואז צנטריפוגה ליאזט גרעיני במשך 30 דקות ב 21, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס.פיפטה את supernatant ולשמור כמו תמצית חלבון גרעיני מסיס. כדי דיאליזה תמצית גרעינית מסיסים, הראשון לחתוך אורך מתאים של צינורות דיאליזה ברוחב 24 מילימטר עם ניתוק משקל מולקולרי של שמונה קילודלטון. מהדקים צד אחד של הצינורות ומטעין את הגרעין לתוך הצינורות.לאחר טעינת ליסאט, מהדקים את הקצה השני וצוללים לתוך מיכל זכוכית נקי המכיל חיץ C עם מעכבי פרוטאז. דיאליזה במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להעביר את הגרעין תמצית גרעינית דיאליזה לתוך צינור צנטריפוגה ב 21, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.העבר שלושה 20 aliquots microliter של התמצית הגרעינית לצינורות microcentrifuge חדשים עבור אימות שבר על ידי כתם מערבי. באמצעות טיפים פיפטה שנחתכו בקצה, להכין תערובת חלבון A / G חרוזים עבור כל לשכפל על ידי שילוב 12.5 נפח חרוז מיקרוליטר של חלבון A Sepharose עם 12.5 microliters של חלבון G Sepharose בצינורות מיקרו צנטריפוגה. לשטוף את תערובת חלבון A / G חרוזים פעמיים עם 300 microliters של חיץ IP I.Spin את חרוזים ב 1, 500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת decant החיץ.לאחר מכן, הכינו את חרוזי A/G של חלבון הנוגדנים. כדי לקשור את הנוגדן ל חרוזים, להוסיף לצינור 300 microliters של מאגר IP אני ו 10 מיקרוגרם של הנוגדן הרצוי. אפשר לתערובת הנוגדנים של חרוזים להתנודד על מטור ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.עכשיו aliquot כרכים מתאימים של lysates הגרעיני לתוך צינורות microcentrifuge שימור נמוך עבור מיליגרם אחד של קלט חלבון לכל לשכפל. לסובב את lysate ב 16, 000 פעמים g במשך 30 דקות ולהעביר את supernatant לצינור חדש. מוסיפים מיקרוליטר אחד של בנזונז ב 250 יחידות למיקרוליטר עבור כל מיליגרם של lysate הגרעיני סלע על nutator בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 עד 15 דקות.כדי להכין חרוזים לפני ניקוי lysate, להוסיף 12.5 microliters של כל חלבון A וחרוזי חלבון G ל 1.5 צינורות שימור נמוך מיליליטר. לשטוף פעמיים עם חיץ שטיפת IP אני עם מעכבי פרוטאז. תדקיק את החיץ ותוסיף מיליגרם אחד של ליסט הגרעין המוכן ל חרוזים.אינקובט תוך נדנדה על מטור במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה lysates מראש פינה ב 1, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. לאחר מכן לשטוף את חלבון הנוגדן A או G חרוזים פעמיים עם חיץ IP אני עם מעכבי פרוטאז.לאחר צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת, decant החיץ. עכשיו להעביר את lysate גרעיני נוקה מראש על חלבון הנוגדן A או G חרוזים. אינקובט תוך נדנדה על מטור ב 4 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות.בעקבות הדגירה, צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך דקה אחת. העבר את העל-טבעי לצינורות המסומן כזרימה עבור כל שכפול. לשטוף את חלבון הנוגדנים A או G חרוזים ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של חיץ IP II עם מעכבי פרוטאז.ואז לשטוף את חרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ IP אני עם מעכבי פרוטאז. ודא שכל המאגר יוסר לאחר הכביסה האחרונה. חלבון Elute את חרוזים על ידי דגירה עם 20 microliters של 0.1 גליצין טוחן ב pH 2.75 כל אחד במשך 30 דקות על nutator.ואז להסתובב ב 750 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת ואת פיפטה את העל טבעי. חזור על דגירה זו עם מאגר אלוטיון בפעם השנייה. לאחר הכנת גלולת החלבון, יש לתלות אותה מחדש ב-30 מיקרוליטרים של מאגר אלקליות SDS.דגירה המדגם על בלוק חום 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. ואז לתת לו להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. הוסף 300 מיליליטר של פתרון UA ו 30 microliters של 100 מילימולר TCEP לכל מדגם.טען את הפתרון למסנן צנטריפוגלי של 30,000. לאחר סיבוב מסנן צנטריפוגלי ב 21, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, לשמור על הזרימה דרך במקרה שיש בעיה עם המסנן. לאחר שטיפת המסנן על פי כתב היד, להוסיף שלושה microliters של מיקרוגרם אחד לכל microliter lyse C resuspended ב 0.1 molar טריס pH 8.5.מלא את המסננים עד לסימן 100 מיקרוליטר עם 0.1 טוחן טריס pH 8.5. אפשר לו לעכל במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס תוך נדנדה על מטור. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של מיקרוגרם אחד לכל טריפסין כיתה MS מיקרוליטר.מערבבים בעדינות ומאפשרים לטרפסין להדגים עם המדגם לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך נדנדה על מטור. בבוקר, צנטריפוגה מספר פעמים ב 21, 000 פעמים גרם במשך 20 דקות כדי לחמק פפטידים מהמסנן לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה שימור נמוך נקי. לאחר התפלת הפפטידים באמצעות עמודי ספין C18, השתמשו מחדש בפפטידים ליופילים בשבעה מיקרוליטרים של 0.1% TFA ב-5% אצטוניטריל.Sonicate את המדגם במשך שלוש דקות כדי להבטיח כי פפטידים כבר resuspended, ולאחר מכן להסתובב למטה ב 14, 000 פעמים g במשך 10 דקות. טען 15 עד 30% מהדגימה על מערכת ספקטרומטריית המסה של הכרומטוגרפיה הנוזלית לצורך ניתוח. במחקר זה, immunoprecipitations טריליקט נותחו מחמישה מיליגרם של תמצית גרעינית HeLa ניצול שליטה חרוז בלבד.הפיתיון DYRK1A מדורג בין שלושת החלבונים המועשרים המובילים על פני השליטה אשר מציין את הניסוי IP-MS שבוצע היה אמין. הפרדה ברורה הוצגה בין האינטראקציה בביטחון גבוה לבין יותר מ -95% של חלבונים copurified זוהו לא ספציפי. לדוגמה, ערכת הנתונים DYRK1A, שותפי אינטראקציה של IREF הציגו ערכי FC-A הנמוכים מ- 0.45 המייצגים העשרה נמוכה מאוד על השליטה.בהתאם לכך, רבות מהאינטראקציות שדווחו בעבר הן שליליות כוזבות בתוך ערכת נתונים זו על ידי ירידה מתחת לסף FC-A של שלוש. מספר העותק המוחלט המחושב של כל אינטראקציית IREF לא הראה מתאם לרמות הזיהוי של שותף אינטראקציה על-ידי IP-MS. השימוש המשולב של FC-A גדול משלושה קדושים יותר מ 0.9 הפחית את הרשימה של אינטראקציות ביטחון גבוה לשישה חלבונים.עם זאת, בעת החלת ניתוק FC-A של יותר משלושה בבידוד, שמונה חלבונים נוספים נוספו לרשת. החלק המכריע ביותר של פרוטוקול זה הוא הבחירה של ריאגנט נוגדנים עבור immunoprecipitation. מומלץ לבצע אימות של סלקטיביות של כתמים מערביים או של קומאסי לפני השלמת זרימת עבודה זו.עדות תומכת של אינטראקציות חלבון חלבון יכול להיות מתוך שיתוף IP המערבי סופג של אינטראקצינים מזוהים. קישור כימי חלבון, אם כי מורכב יותר, יכול לחשוף תחומי אינטראקציה של אינטראקציה. בשיטה זו, קבוצת המחקר שלי חשפה פונקציות חדשניות עבור DYRK1A, קינאז חלבון הנדרש להתפתחות המוח של יונקים ומקושר עם נוירופתולוגיה של מחלת אלצהיימר.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...