Name: label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

이 작품은 다운 증후군린다 크닉 연구소에서 W.M.O.에 그랜드 챌린지 보조금과 DARPA 협력 계약에 의해 지원되었다 13-34-RTA-FP-007. 제시 컬랜드와 키라 코졸리노가 원고를 읽고 댓글을 남기는 데 기여한 것에 대해 감사드립니다.

<ol>
	<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group.">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li><li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification.">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li><li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+'nonspecific'+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1.">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52 (2015).</li><li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+the+ends:+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7.">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10, 715-721 (2013).</li><li>Bronicki, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+new+cases+further+delineate+the+syndromic+intellectual+disability+phenotype+caused+by+mutations+in+DYRK1A.">Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A.</a> European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).</li><li>Antonarakis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+syndrome+and+the+complexity+of+genome+dosage+imbalance.">Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance.</a> Nature Reviews Genetics. , (2016).</li><li>Dowjat, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy-driven+overexpression+of+DYRK1A+kinase+in+the+brain+of+subjects+with+Down+syndrome.">Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome.</a> Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).</li><li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice.">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li><li>H&#228;mmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb/Dyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development.">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li><li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+MNB/DYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome.">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).</li><li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis.">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAINT:+Probabilistic+scoring+of+affinity+purificationg-mass+spectrometry+data.">SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 8, 70-73 (2011).</li><li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape:+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks.">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li><li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair.">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539 (2019).</li><li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iRefIndex:+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance.">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li><li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance.">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없다.

여기에 설명된 프로테오믹스 워크플로우는 관심 있는 단백질에 대한 고신뢰 단백질 인터랙터를 식별하는 효과적인 방법을 제공합니다. 이 접근 방식은 세포외 분획을 통해 시료의 복잡성을 감소시키고 강력한 시료 준비, 오프라인 시료 정리 및 LC-MS 시스템의 엄격한 품질 관리를 통해 식별 상호 작용 파트너를 늘리는 데 중점을 둡니다. 여기에 설명된 다운스트림 데이터 분석은 미끼와 공정화하는 것으로 확인된 단백질의 간단한 통계적 평가를 가능하게 한다. 그러나, 실험 변수 (규모, 세포주, 항체 선택)의 높은 수로 인해, 각 실험은 데이터 시각화 및 농축에 관한 다른 컷오프 및 고려 사항을 필요로한다.
IP-MS 실험에서 첫 번째 디자인 고려 사항은 상호 작용하는 파트너와 함께 관심 있는 단백질의 공정화에 사용될 항체의 선택입니다. 상업적인 항체의 가용성은 지난 수십 년 동안 인간 단백질의 더 큰 부분을 커버하기 위하여 확장되는 동안, 시약이 제한되는 많은 단백질이 아직도 있습니다. 더욱이, 웨스턴 블롯 검출과 같은 응용을 위해 검증된 항체는 면역 침전 실험에서 표적 단백질의 선택적 농축이 불가능할 수 있다. 대규모 상호작용 프로테오믹스 실험을 수행하기 전에, 90% 동률 10 cm 접시, 또는 동등한 세포 수로부터 IP를 완료하고, 서양 블로팅에 의한 관심 있는 표적 단백질에 대한 프로브를 제안하는 것이 좋습니다. 단일 항체이상이 면역침전에 이용가능한 경우, 단백질의 상이한 부분 내에서 에피토프를 인식하는 다중 항체를 선택하는 것이 추가로 제안된다. 미끼 단백질에 대한 항체의 결합은 가설 상호 작용 파트너를 위해 필요한 결합 인터페이스를 폐색할 수 있다. 미끼 단백질에 대한 이차 에피토프의 선택은 질량 분석 기반 실험에 의해 확인된 상호작용 프로파일의 커버리지를 증가시킬 것이다.
두 번째 주요 고려 사항은 미끼와 공정화로 확인 된 것과 낮은 신뢰 또는 비특이적 인 상호 작용에서 높은 신뢰도 상호 작용을 구별하기위한 적절한 제어의 선택에있다. IP-MS 실험에 대한 가장 엄격한 대조군은 미끼의 CRISPR KO 세포주로부터 면역침전을 완료하는 것이다. 이러한 제어는 미끼 단백질보다는 항체에 직접 결합하는 비특이적 단백질을 식별하고 필터링할 수 있게 합니다. 각 미끼 단백질의 CRISPR KO 세포주 생성이 가능하지 않은 경우, 미끼 항체의 동일한 이소타입의 IgG-비드 조절제가 사용될 수 있다. 여러 종을 나타내는 항체 패널을 사용하는 실험에서, 비드 만 제어의 사용은 적절할 수 있지만 높은 신뢰형 인터랙터로 확인된 거짓 긍정의 비율을 증가시킬 것이다.
IP-MS 실험에 사용된 세포주의 선택은 몇 가지 주요 요인에 의존한다. 단백질 발현 및 국소화는 세포 유형에 크게 의존한다. RNA 발현 추정치는 많은 일반적으로 사용되는 세포주에서 대부분의 유전자에 대해 발견될 수 있지만, 단백질 발현은 RNA 발현과 잘 연관되어 있으며 실험적으로25를결정해야 한다. 미끼 단백질이 매우 낮은 카피 수로 발현되는 세포주는 필요할 수 있는 세포 배양 규모의 급격한 증가와 관련된 문제를 회피하는 것을 피해야 한다. 그러나, 샘플 준비는 매우 낮은 풍부 단백질의 검출을 위해 최적화 될 수 있다는 점에 유의해야한다. 필터 보조 시료 준비(FASP) 방법은 견고하면서도 시료에서 펩티드의 50% 이상 손실을 초래할 수 있다. 단일 냄비 고체 상 강화 샘플 준비 (SP3)는 시료 손실26을최소화하는 질량 분석 분석을위한 샘플을 생성하는 효율적인 방법입니다. 샘플 제제의 SP3 방법에 의해 활성화된 증가된 회복은 검출 한계에 가까운 단백질의 정량화를 위한 이 워크플로우에서 유용한 대안이 될 수 있다.
이 프로테오믹스 워크플로우는 키나아제, E3 유비퀴틴 리가제 및 다분체 복합체의 비계 구성원을 포함한 많은 핵 미끼에 적용되었습니다. 항체 시약의 적절한 검증을 가정할 때, 이 워크플로우를 성공적으로 실행하면 관심 있는 단백질에 대한 고신뢰 단백질 핵 상호작용 파트너가 검출될 것입니다.

인간 프로테오메는 안정적인 다분체 복합체 형성과 일시적인 단백질-단백질 상호 작용을 통해 광대한 구조적 및 생화학적 다양성을 나타낸다. 따라서, 관심 있는 단백질에 대한 상호작용 파트너의 식별은 분자 메커니즘을 해명하기 위한 조사에서 일반적으로 요구된다. 선호도 정제 프로토콜의 최근 발전과 고해상도 고속 스캐닝 질량 분석 기의 출현은 단일 편견 없는 실험에서 단백질 상호작용 풍경을 쉽게 매핑할 수 있게 되었습니다.
단백질 상호작용 프로토콜은 일반적으로 관심 있는 단백질을 인식하는 고품질 항체를 요구하지 않고 단백질 상호작용을 식별하기 위해 친화성 태그가 달린 융합 구체를 가진 자궁경화성 발현 시스템을 사용합니다1,2. 그러나 에피토프 태그 기반 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 에피토프와의 물리적 상호 작용은 비특이적 항화 단백질3의검출을유도할 수 있다. 부가적으로, 단백질의 N-또는 C 단말에 이들 에피토프 태그를 융합하면 네이티브 단백질-단백질 상호작용을 차단하거나, 단백질 폴딩을 방해하여 비생리적 적합성을 촉진할 수있다 4. 더욱이, 자궁경화 발현 시스템은 전형적으로 초생리학적 농도에서 미끼 단백질을 과발현하며, 이는 특히 투여에 민감한 유전자에 대해, 특히 단백질 상호작용의 식별을 초래할 수 있다5. 이러한 문제를 우회하기 위해, 내인성 미끼 단백질은 네이티브 단백질을 인식하는 고품질 항체의 가용성을 가정하고, 관련 상호 작용하는 먹이 단백질과 함께 면역 침전될 수 있다.
여기에 제공된 단백질성 단백질은 예를 들어 CMGC 단백질 키나아제 DYRK1A를 사용하여 내인성 단백질의 핵 상호작용을 검출하기 위한 워크플로우이다. DYRK1A 카피 수, 활성 수준 또는 발현의 중단은 인간에서 심각한 지적 장애를 일으킬 수 있으며, 마우스6,7,8,9에서 배아 치사성을 유발할 수있다. DYRK1A는 동적 시공간 조절10,및 구획화된 단백질 상호작용11,12를나타내며, 상이한 세포내 구획에 특이적인 낮은 풍부 상호작용 파트너를 검출할 수 있는 접근법을 요구한다.
이 프로토콜은 인간 HeLa 세포의 세포 분획을 시토졸 및 뉴클레오플라스 분획, 면역 침전, 질량 분석에 대한 샘플 준비 및 데이터 품질 및 시각화 결과를 평가하기 위한 생물 정보학 파이프라인의 개요를 분석 및 시각화용으로 제공하는 R 스크립트를 사용합니다(그림1) 이 워크플로우에 사용되는 Proteomics 소프트웨어 패키지는 모두 자유롭게 다운로드할 수 있으며 웹 인터페이스를 통해 액세스할 수 있습니다. 소프트웨어 및 계산 방법에 대한 자세한 내용은 제공된 링크에서 자세한 자습서 및 지침을 확인할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 0.1% EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone (HPLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closure</td>
			<td>Caroline Biological Supply Company</td>
			<td>684239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>887845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa QC tryptic digest</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce homogenizer 7 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885301-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl endopeptidase C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>enzo life sciences</td>
			<td>ALX-350-012-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p84 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88341</td>
			<td>LCMS QC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 spin columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>For mass spectrometry sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0780-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica emitter tip</td>
			<td>Pico TIP</td>
			<td>FS360-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885302-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3787K17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 150, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>Tissue culture dish for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7&#181;m Spherical Hybrid (1.7 &#181;m, 75 &#181;m x 250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007484</td>
			<td>nanoflow C18 column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling

면역친화 질량 분석법(IP-MS)은 단백질-단백질 상호작용을 식별하는 강력한 정량적 방법으로 부상하였다. 이 간행물은 또한 그밖 세포외 구획에 적용될 수 있는 핵에서 낮은 풍부한 단백질 단백질 상호 작용을 확인하기 위하여 디자인된 완전한 상호 작용 proteomics 워크플로우를 제출합니다. 이 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 샘플 준비, 오프라인 정리, 단일 샷 라벨 없는 질량 분석법, 다운스트림 계산 분석 및 데이터 시각화가 포함됩니다. 우리의 프로토콜은 전체 세포 용해물 (예를 들어, 핵에서 전사 인자 상호 작용)에서 내인성 단백질의 면역 침전에 의해 식별하기 어려운 구획화, 낮은 풍부 상호 작용을 검출하기 위해 최적화되어 있습니다. 분별 된 세포 실. 여기에 설명된 샘플 제제 파이프라인은 HeLa 세포 핵 추출물의 제조, 내인성 미끼 단백질의 면역 친화성 정제 및 정량 질량 분석 분석에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 또한 질량 분석 기반 상호 작용 프로파일링 실험에서 대규모 면역 침전을 수행하기 위한 방법론적 고려 사항에 대해 논의하고 진정한 양성 단백질을 구별하기 위한 데이터 품질 평가 지침을 제공합니다. 비특이적 상호 작용에서 상호 작용. 이 접근법은 CMGC 키나아제, DYRK1A, 핵 내의 잘못 정의된 상호작용을 갖는 낮은 풍부 단백질 키나아제의 핵 상호작용을 조사함으로써 여기에서 입증된다.

IP-MS 실험에서 확인된 단백질 질량의 대다수는 비특이성 단백질로 이루어져 있습니다. 따라서, IP-MS 실험의 주요 과제 중 하나는 단백질이 높은 신뢰형 인터랙터 대 비특이적 인터랙터인 해석입니다. 데이터 품질 평가에 사용되는 중요한 파라미터를 입증하기 위해 비드 전용 제어를 이용한 HeLa 핵 추출물 5 mg의 삼중면역침전을 분석하였다. IP-MS 실험이 신뢰할 수 있는지 확인하기 위한 첫 번째 내부 검사는 미끼 단백질이 대조군과 SAINT 확률 모두에 의해 확인된 가장 높은 농축 단백질 중 하나로 평가되는지 여부입니다. 이 경우, 미끼 DYRK1A는 대조군을 통해 상위 3개의 농축 단백질 중 하나로 선정되었다(도2A,B). 4개의 독립적인 항체를 이용한 DYRK1A의 핵 상호 작용 연구에서, >3.00 및 SAINT 확률 컷오프 >0.7의 FC-A 컷오프는 신규 및 이전에 검증된인터랙터(22)의식별을 위한 엄격한 컷오프를 제공했다. 본 실험에 적용하면, 비특이적으로 확인된 고신뢰성 간체와 >95%의 비특이성 단백질 사이에 명확한 분리가 이루어질 수있었다(도 2A,B). 배 변화 농축 및 확률 임계값을 모두 적용하면 생물학적 복제에 걸쳐 일관되게 높은 단백질 ID를 풍부하게 하여 응력성을 증가시킵니다.
통계적 점수 매기기 이외에, CRAPome 분석 워크플로우도 이전에 보고된 상호작용을 미끼-먹이데이터(23)에매핑한다. 이 매핑은 높고 낮은 신뢰도 상호 작용을 임계값화하는 데 유용할 수 있지만, 이전에 보고된 상호 작용은 FC-A 및 SAINT 확률에 의해 저조한 점수를 매길 수 있으며, 잠재적으로 주어진 미끼의 많은 알려진 상호 작용이 특정 세포 유형, 컨텍스트 또는 세포기관에서만 존재할 수 있음을 나타냅니다. DYRK1A 데이터 세트의 경우, iREF 상호작용자 FC-A 값은 0.45로 낮았으며, 제어에 대한 매우 낮은 보강을 나타내고있다(그림 2C). 거짓 긍정의 인플레이션을 방지하려면 통계 적 임계값을 거짓 부정 의 감소보다 엄격성을 우선시하는 방식으로 수행해야 합니다. 이러한 상호작용의 검출은 단백질 풍부도(도2C)와무관하다는 점에 유의해야한다. HeLa 세포 내의 각 iREF 상호작용의 계산된 절대 카피 수는 IP-MS24에의한 상호작용 파트너의 검출 수준과 상관관계가 없음을 나타내고 있다.
Cytoscape상호 작용 데이터19의여러 계층을 시각화하기위한 효과적인 도구 역할을합니다. 여기서 설명된 DYRK1A 면역 침전 실험에서 FC-A > 3.0 및 SAINT > 0.9의 결합 사용은 6개의 단백질로 고신뢰 성간자 목록을 감소시켰습니다(도2D). 그러나 FC-A 컷오프를 적용했을 때 > 3.0을 격리하여, 8개의 단백질을 네트워크에 추가하였습니다. 이 추가 단백질 상호 작용자는 네트워크에 이미 있는 인터랙터와 높은 연결성이 있으며, 이는 유사한 복합체 또는 기능적 역할과 관련이 있음을 시사합니다. 이를 위해, 단백질-단백질 상호작용의 STRING-DB로부터의 증거는 청색파선(20)으로서이 네트워크에 통합되었다. 이 단일 미끼 실험은 전체 DYRK1A 상호 작용 네트워크의 제한된 샘플을 제공하지만, 대규모 공용 데이터 세트의 추가 미끼, 복제 및 통합을 사용하여 신뢰도가 높은 상호 작용의 네트워크를 확장할 수 있습니다. 따라서 통계 적 차단은 각 개별 실험에 특정되며 철저하게 평가되어야합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg"> 그림 1: 세포외 IP-MS에 대한 대표적인 프로테오믹스 워크플로우. 세포는 4L 둥근 바닥 플라스크 또는 15 cm 조직 배양 접시에서 성장하고 세포 분열을 위해 동시에 수확됩니다. 세포는 세포토졸, 핵 및 핵 펠릿으로 분획되고, 면역 침전은 동일한 미끼를 인식하는 하나 또는 다중 항체를 사용하여 핵 용해의 1-10 mg에서 행해낸다. 필터 보조 시료 준비(FASP) 및 오프라인 샘플 정리는 단일 샷 질량 분석 전에 수행됩니다. 다운스트림 계산 파이프라인은 데이터를 해석 가능한 상호 작용 데이터로 처리하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg"> 도 2: 단일 미끼 단일 항체 IP-MS 실험을 위한 대표적인 데이터. (a)키나아제 DYRK1A(n=3)에 대한 단일 항체를 이용한 최적의 실험을 위한 CRAPome 분석 워크플로우로부터의 FC-A 및 SAINT 확률 출력. 비드 전용 컨트롤은 비교를 위해 사용되었습니다. 빨간색 실선은 FC-A > 3.00 및 SAINT > 0.7에서 설정된 컷오프를 나타냅니다. (B)최대정산 단백질 풍부도 추정치(iBAQ) 출력 대 log2 비율의 단백질 풍부도는 DYRK1A IP에서 조절할 수 있으며, 라벨없는 강도의 경험적 베이즈 분석으로부터 조절된 p 값 범위에 의해 착색된다. (C)FC-A 및 iRef 데이터베이스23,24에서상호 작용 단백질로 열거된 단백질의 추정 카피 수. (D) DYRK1A 인터랙터의 사이토스케이프 네트워크 시각화. 파란색 노드 = FC-A > 3.00, SAINT > 0.7. 주황색 노드 = FC-A > 3.00. IPMS 실험에서 인터액터로 확인된 검정 가장자리 = 단백질. 파란색 파선 가장자리 = 먹이 단백질 사이의 SAINT 상호 작용 (신뢰도 > .150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">프로테아제 억제제 (PI) 혼합물</td>
		</tr>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>나트륨 메타비술핏</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>벤자미딘</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>디티오트레이톨 (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>페닐메탄설포닐 불소 (PMSF)</td>
			<td>0.25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">인산염 억제제 (PhI) 혼합물</td>
		</tr>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>마이크로시스틴 LR</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>오르토바나데이트 나트륨</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>불소 나트륨</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">세포분획 버퍼:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">버퍼 A pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스 (주)는</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">버퍼 B pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스 (주)는</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1.5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>420 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>에틸렌디아미네테트라아세트산 (EDTA)</td>
			<td>0.4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>글리세롤</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">버퍼 C pH 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스 (주)는</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>에틸렌디아미네테트라아세트산 (EDTA)</td>
			<td>0.4 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>글리세롤</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">면역 침전 버퍼:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP 버퍼 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스 (주)는</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>글리세롤</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP 버퍼 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스 (주)는</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>0.1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0.1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>글리세롤</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS 알킬레이션 버퍼 pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sds</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>클로로아세타미드</td>
			<td>40 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>TCEP</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>시약</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>우 레 아</td>
			<td>8 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">* HPLC 등급 H2O를 사용</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 버퍼 컴포지션
추가 코딩 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

이 프로테오믹스 워크플로우를 통해 세포외 분해능과 내인성 단백질-단백질 상호 작용의 편견없는 식별 및 매핑을 가능하게 합니다. 이 기술은 복용량에 민감한 미끼 단백질을 조사 할 때 특히 유리하다, 낮은 풍부, 또는 여러 세포 소세포 지역화가. 이 방법은 적합한 친화성 시약이 있다고 가정하여 내인성 단백질 상호 작용을 매핑하는 데 적용될 수 있습니다.이것은 알 수 없는 기능을 가진 단백질의 수천의 많은 특히 중요합니다, 많은 인간 적인 질병과 연결 되었습니다. 이 방법은 세포외 분획에 적합한 임의의 세포주 또는 조직에 적응할 수 있다. 적당한 친화성 시약을 가진 모든 단백질은 표적으로 할 수 있었습니다.선호도 정제 실험의 일반적인 결과는 종종 결과가 아닙니다. 정말 좋은 시약, 전체 QC 데이터를 수집, 샘플 처리를 제한하는 것은 모두 정말 중요합니다. 샘플이 있다는 것을 알 수 있습니다.시작하려면, 프로테아제 억제제 또는 인산염 억제제로 차가운 완충제 A의 1X 펠릿 부피에서 15 분 동안 준비 된 세포 펠릿을 해동하십시오. 세포 펠릿이 들어 있는 튜브를 섭씨 4도에 영양사에 놓아 30분 동안 재서스펜션을 돕습니다. 그런 다음 튜브를 원심분리기에 2, 000배, 섭씨 4도에 넣고 펠릿까지 10분간 배치합니다.상체를 데수제와 5배로 세포를 다시 일시 중지하여 20분 동안 얼음에 버퍼 A.Incubate를 장착하여 압축된 세포 부피를 재보아보시합니다. 다음으로, 펠릿은 다시 2, 000 배 g와 10 분 동안 섭씨 4도에서 다시. 프로테아제 억제제 또는 인산염 억제제로 버퍼를 억제하고 2X 원래 포장된 세포 부피 버퍼 A로 재연한다.느슨한 유봉 A.원심분리기로 약 7회 2, 000배, 섭씨 4도에서 10분 동안 용해됩니다. 상체를 새 튜브로 조심스럽게 옮기고 액체 질소로 얼리십시오. 영하 80도에 보관하십시오.프로테아제 억제제 또는 인산염 억제제로 완충 B의 0.9X 펠릿 부피로 펠릿을 다시 중단하고 4°C에서 5분간 누에이터에 섞는다. 핵을 lyse하려면, 티터 유봉 B.Mix와 함께 20 번 을 투하 B.Mix는 4섭씨에서 30 분 동안 영양사에 핵 용해를 혼합하여 균질성입니다. 그런 다음 원심 분리핵은 섭씨 4도에서 21, 000배 에서 30분 동안 30분 동안 용해됩니다.상체에서 피펫과 수용성 핵 단백질 추출물로 저장합니다. 용해성 핵 추출물을 투석하기 위해 먼저 8킬로톤 분자량 차단으로 24mm 너비투석 튜브를 적절히 자른다. 튜브의 한쪽을 고정하고 핵을 튜브에 적재합니다.용재를 로드한 후, 다른 쪽 끝을 고정하고 프로테아제 억제제로 버퍼 C를 함유한 깨끗한 유리 용기에 담급드한다. 섭씨 4도에서 3시간 동안 투석합니다. 그 후 투석된 핵 추출물을 튜브로 옮기고 원심분리기를 21, 섭씨 4도에서 000배 30분 동안 이송한다.핵 추출물의 20개의 마이크로리터 알리쿼트 3개를 새로운 미세원심분리기 튜브로 이송하여 서부 블롯에 의한 분별 검증을 한다. 팁에서 절단 된 파이펫 팁을 사용하여, 마이크로 센티슈분리기 튜브에 단백질 G Sepharose의 12.5 마이크로 리터와 단백질 A Sepharose의 12.5 마이크로 리터를 결합하여 각 복제에 대한 단백질 A / G 비드 혼합물을 준비합니다. 단백질 A/G 비드 혼합물을 IP 버퍼 300 마이크로리터로 두 번 세척하여 구슬을 섭씨 4도에서 1, 500회 스핀하고 완충제를 절인다.다음으로, 항체 단백질 A/G 구슬을 준비한다. 비드에 항체를 결합하려면, 튜브에 추가 300 IP 버퍼 I의 마이크로 리터 와 원하는 항체의 10 마이크로 그램. 비드 항체 혼합물이 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 영양사에 흔들도록 합니다.이제 핵의 적절한 볼륨을 복제당 단백질 입력 1 밀리그램에 대해 낮은 보존 미세 센심 분리 튜브로 알리쿼트합니다. lysate를 16, 000회 g에서 30분 동안 회전시키고 상체를 새로운 튜브로 옮긴다. 10~15분 동안 4°C에서 4°C의 핵 라이세이트와 바위에 마이크로리터 당 250유닛에 벤조나아제 1마이크로리터를 넣습니다.lysate를 미리 지우기 위한 구슬을 준비하려면 각 단백질 A및 단백질 G 비드1.5 밀리리터 저보유 튜브에 12.5 마이크로리터를 추가하십시오. 프로테아제 억제제로 IP 워시 버퍼 I로 두 번 씻습니다. 버퍼를 데수제하고 준비된 핵 리세이트의 1밀리그램을 구슬에 넣습니다.섭씨 4도에서 1시간 동안 누에이터를 흔들면서 배양하십시오. 미리 지워진 용해는 1, 500배, 섭씨 4도에서 1분간 원심분리합니다. 그런 다음 프로테아제 억제제로 IP 버퍼 I로 항체 단백질 A 또는 G 비드를 두 번 세척합니다.원심분리 후 1, 500배, 섭씨 4도에서 1분간 완충제를 절개합니다. 이제 미리 지워진 핵 용액을 항체 단백질 A 또는 G 구슬에 전달한다. 4 시간 동안 섭씨 4도에서 영양가를 흔들면서 배양하십시오.인큐베이션에 이어 원심분리기는 1, 500배, 섭씨 4도에서 1분간. 상체를 각 복제에 대한 흐름으로 표시된 튜브로 전송합니다. 프로테아제 억제제로 IP 완충 II 1밀리리터로 항체 단백질 A 또는 G 비드를 4회 세척한다.그런 다음 비드를 프로테아제 억제제로 IP 버퍼 I1 밀리리터로 두 번 씻습니다. 마지막 세척 후 모든 버퍼가 제거되었는지 확인합니다. 구슬에서 엘루트 단백질은 pH 2.75에서 0.1 개의 어금니 글리신 20 마이크로 리터를 영양사에서 30 분 동안 배양하여 구슬을 벗어 나.그런 다음 750 배 g와 섭씨 4도에서 1 분 동안 회전하고 상체에서 파이펫을 피펫합니다. 용출 버퍼로 이 배큐어를 두 번째로 반복합니다. 단백질 펠릿을 준비한 후 SDS 알킬레이션 버퍼30 마이크로리터로 다시 중단하십시오.샘플을 섭씨 95도 의 열 블록에 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 15 분 동안 식힙니다. 각 샘플에 300밀리리터의 UA 솔루션과 100밀리머 TCEP30 마이크로리터를 추가합니다.솔루션을 30K 원심 필터에 로드합니다. 원심 필터를 실온에서 21, 000배 에서 10분 간 회전한 후 필터에 문제가 있는 경우 흐름을 유지한다. 원고에 따라 필터를 세척 한 후, 마이크로 리터 리제 C 당 1 마이크로 그램의 3 마이크로 리터를 0.1 어금니 Tris pH 8.5로 재장 매재합니다.필터를 0.1 어금니 Tris pH 8.5로 100 마이크로리터 마크까지 채웁니다. 영양가를 흔들면서 섭씨 37도에서 1 시간 동안 소화할 수 있습니다. 다음으로, 마이크로리터 MS 등급 트립신당 1마이크로그램의 마이크로리터를 추가합니다.부드럽게 섞어서 트립신이 영양사에 흔들면서 하룻밤 사이에 샘플과 함께 배양할 수 있습니다. 아침에는 21회, 000배에서 여러 번 원심분리기를 사용하여 필터에서 펩티드를 깨끗한 낮은 보존 마이크로센티슈지 튜브로 엘로우게 한다. C18 스핀 컬럼을 사용하여 펩티드를 탈염한 후, 5%아세토닐릴에서 0.1%TFA의 7개의 마이크로리터에서 리오필화된 펩티드를 재분배한다.펩티드가 다시 중단되었는지 확인하기 위해 샘플을 3분 동안 초음파 처리한 다음 10분 동안 14, 000배 g로 회전합니다. 분석을 위해 액체 크로마토그래피 질량 분광계 시스템에 샘플의 15~30%를 적재합니다. 이 연구에서는, 삼중면 면역 침전물은 구슬 전용 제어를 이용한 HeLa 핵 추출물의 5밀리그램으로부터 분석되었다.미끼 DYRK1A는 수행된 IP-MS 실험이 신뢰할 수 있음을 나타내는 대조군을 통해 상위 3개의 농축 단백질 중 하나로 선정되었습니다. 높은 신뢰도 인터랙터와 95% 이상의 코퓨화된 단백질 사이에 명확한 분리가 비특이적으로 확인되었다. 예를 들어 DYRK1A 데이터 집합의 경우 IREF 상호 작용 파트너는 FC-A 값을 0.45로 표시하여 제어에 대한 매우 낮은 농축을 나타냅니다.따라서 이전에 보고된 상호 작용 의 대부분은 FC-A 임계값 3 이하로 떨어짐으로써 이 데이터 집합 내에서 거짓 네거티브입니다. 각 IREF 상호 작용의 계산된 절대 복사 수는 IP-MS에 의한 상호 작용 파트너의 검출 수준과 상관관계가 없음을 보여 주었다. FC-A의 결합된 사용은 3개 이상 이고 성도가 0.9보다 큰 6개의 단백질로 높은 신뢰성 인터랙터의 목록을 감소시다.그러나, 격리에서 3개 이상의 FC-A 컷오프를 적용할 때, 8개의 추가 단백질이 네트워크에 추가되었다. 이 프로토콜의 가장 중요한 부분은 면역 강수량을 위한 항체 시약의 선택입니다. 이 워크플로를 완료하기 전에 선택성의 웨스턴 블롯 또는 쿠마시 유효성 검사를 권장합니다.단백질 단백질 상호 작용의 증거를 지원 하는 식별 된 interactors의 공동 IP 서쪽 blotting에서 있을 수 있습니다. 단백질 화학 적 상호 연결, 비록 더 복잡 하지만, 상호 작용 도메인을 공개할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 나의 연구 단은 DYRK1A를 위한 새로운 기능을, 포유류 두뇌 발달을 위해 요구되고 알츠하이머 병 신경 병리학과 연결한 단백질 키나아제를 발견했습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

연구

생화학

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

라벨없는 임피던스 기반 GPCR 분석에서 처리량 증가를위한 단계별 투약 프로토콜

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...