Name: label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling
Uploaded: 2019-11-17T12:30:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Эта работа была поддержана Грантом Grand Challenge W.M.O. от Института Линды Крник по синдрому Дауна и соглашением о сотрудничестве DARPA 13-34-RTA-FP-007. Мы хотели бы поблагодарить Джесси Курланд и Киру Коццолино за их вклад в чтение и комментирование рукописи.

<ol>
	<li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+interaction+landscape+of+the+human+CMGC+kinase+group.">The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group.</a> Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).</li><li>Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Affinity+Tags+for+Protein+Purification.">Overview of Affinity Tags for Protein Purification.</a> Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).</li><li>Mahmood, N., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endogenous+'nonspecific'+protein+detected+by+a+His-tag+antibody+is+human+transcription+regulator+YY1.">An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1.</a> Data in Brief. 2, 52 (2015).</li><li>Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+the+ends:+internal+epitope+tagging+of+proteins+using+transposon+Tn7.">Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7.</a> Genetics. 200, 47-59 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nature Methods. 10, 715-721 (2013).</li><li>Bronicki, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+new+cases+further+delineate+the+syndromic+intellectual+disability+phenotype+caused+by+mutations+in+DYRK1A.">Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A.</a> European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).</li><li>Antonarakis, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down+syndrome+and+the+complexity+of+genome+dosage+imbalance.">Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance.</a> Nature Reviews Genetics. , (2016).</li><li>Dowjat, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy-driven+overexpression+of+DYRK1A+kinase+in+the+brain+of+subjects+with+Down+syndrome.">Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome.</a> Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).</li><li>Fotaki, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyrk1A+haploinsufficiency+affects+viability+and+causes+developmental+delay+and+abnormal+brain+morphology+in+mice.">Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).</li><li>H&#228;mmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+and+subcellular+expression+of+the+candidate+Down+syndrome+gene+Mnb/Dyrk1A+in+the+developing+mouse+brain+suggests+distinct+sequential+roles+in+neuronal+development.">The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development.</a> European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).</li><li>Funakoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+human+MNB/DYRK1A+gene+induces+formation+of+multinucleate+cells+through+overduplication+of+the+centrosome.">Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).</li><li>Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+between+DYRK1A+and+DCAF7+phosphorylates+the+C-terminal+domain+of+RNA+polymerase+II+to+promote+myogenesis.">A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>Wi&#347;niewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).</li><li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+(prote)omics+data.">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13, 731-740 (2016).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+A+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAINT:+Probabilistic+scoring+of+affinity+purificationg-mass+spectrometry+data.">SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 8, 70-73 (2011).</li><li>Shannon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape:+a+software+environment+for+integrated+models+of+biomolecular+interaction+networks.">Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks.</a> Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STRING+database+in+2017:+quality-controlled+protein-protein+association+networks,+made+broadly+accessible.">The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible.</a> Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClueGO:+a+Cytoscape+plug-in+to+decipher+functionally+grouped+gene+ontology+and+pathway+annotation+networks.">ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks.</a> Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).</li><li>Guard, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+interactome+of+DYRK1A+reveals+a+functional+role+in+DNA+damage+repair.">The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair.</a> Scientific Reports. 9, 6539 (2019).</li><li>Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iRefIndex:+A+consolidated+protein+interaction+database+with+provenance.">iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance.</a> BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).</li><li>Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal,+encapsulated+proteomic-sample+processing+applied+to+copy-number+estimation+in+eukaryotic+cells.">Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells.</a> Nature Methods. 11, 319-324 (2014).</li><li>Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Dependency+of+Cellular+Protein+Levels+on+mRNA+Abundance.">On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance.</a> Cell. 165, 535-550 (2016).</li><li>Hughes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+proteome+analysis+using+paramagnetic+bead+technology.">Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.</a> Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Рабочий процесс протеомики, изложенный здесь, является эффективным методом выявления высокодоверчивых белковых интеркторов для интересуемого белка. Этот подход уменьшает сложность выборки через субклеточные фракции и фокусируется на увеличении партнеров по взаимодействию идентификации за счет надежной подготовки к образцу, очистки образцов в автономном режиме и строгого контроля качества системы LC-MS. Анализ данных, описанный здесь ниже по течению, позволяет провести простую статистическую оценку белков, идентифицированных как коочищение с приманкой. Однако, из-за большого количества экспериментальных переменных (масштаб, клеточная линия, выбор антител), каждый эксперимент требует различных отсечений и соображений, касающихся визуализации данных и обогащения.
Первым проектным соображением в эксперименте IP-MS является выбор антител, которые будут использоваться для коочищения интересующего белка вместе со своими взаимодействующими партнерами. Хотя доступность коммерческих антител расширилась, чтобы охватить большую часть протеома человека за последние несколько десятилетий, Есть еще много белков, для которых реагенты ограничены. Кроме того, антитела, которые были проверены для таких приложений, как западное обнаружение побелки, могут быть неспособны к выборочному обогащению целевого белка в эксперименте по иммунопреционированию. Перед проведением крупномасштабного эксперимента протеомики взаимодействия предлагается завершить IP с 90% конфлеционную тарелку 10 см, или эквивалентное число клеток, и зонд для целевого белка, интересуемого западным и блеттингом. Если для иммунопреципиции доступно более одного антитела, рекомендуется дополнительно выбрать несколько антител, распознающих эпитопы в разных частях белка. Привязка антитела к белку приманки может заткнеть необходимый связывающий интерфейс для предполагающих взаимодействующих партнеров. Выбор вторичного эпитопа для белка приманки увеличит охват профиля взаимодействия, выявленного в ходе эксперимента на основе масс-спектрометрии.
Второе важное соображение заключается в выборе соответствующего контроля для разграничения взаимодействий с высокой достоверностью от низкой достоверности или неспецифических взаимодействий от тех, которые определены как коочищение с приманкой. Самый строгий контроль для эксперимента IP-MS заключается в завершении иммунопреципиции от CRISPR KO клеточной линии приманки. Такой контроль позволяет выявить и отфильтровать неспецифические белки, которые связываются непосредственно с антителом, а не с белками приманки. В тех случаях, когда генерация CRISPR KO клеточной линии каждого белка приманки не представляется возможным, IgG-бисер управления же изотип приманки антитела могут быть использованы. В экспериментах с использованием панели антител, представляющих несколько видов, использование бисера только контроль может быть целесообразным, но увеличит скорость ложных срабатываний определены как высокой уверенности взаимодействующих.
Выбор клеточной линии, используемой в эксперименте IP-MS, зависит от нескольких ключевых факторов. Выражение и локализация белка в значительной степени зависят от типа клеток. В то время как оценки экспрессии РНК можно найти для большинства генов во многих широко используемых клеточных линиях, экспрессия белка плохо коррелирует с экспрессией РНК и должна быть определена экспериментально25. Клеточные линии, в которых белок приманки выражается в очень низком количестве копий следует избегать, чтобы обойти проблемы, связанные с резким увеличением масштаба клеточной культуры, которые могут потребоваться. Следует отметить, однако, что подготовка образцов может быть оптимизирована для обнаружения очень низкого изобилия белков. Фильтр помогал метод подготовки образца (FASP), в то время как надежный, может привести к более чем 50% потере пептида в образце. Однопотно-поток твердых фазы расширенной подготовки образца (SP3) является эффективным методом генерации образцов для анализа масс-спектрометрии, что сводит к минимуму потери образца26. Увеличение восстановления, включенное методом SP3 подготовки образцов, может быть полезной альтернативой в этом рабочем процессе для количественной оценки белков, которые подпадают под предел обнаружения.
Этот рабочий процесс протеомики был применен во многих ядерных приманках, включая киназы, e3 убиквитин лигазы, и леса членов мультисубутных комплексов. Предполагая надлежащую проверку реагентов антител, успешное выполнение этого рабочего процесса приведет к обнаружению высокоуверенных белков ывателей партнеров по взаимодействию для белка, представляющих интерес.

Протеом человека обладает огромным структурным и биохимическим разнообразием путем формирования стабильных мультисубунитов и переходных белково-белковых взаимодействий. Соответственно, идентификация партнеров взаимодействия для белка интереса обычно требуется в исследованиях, чтобы разгадать молекулярный механизм. Недавние достижения в протоколах очистки сродства и появление приборов быстрого сканирования масс-спектрометрии с высоким разрешением позволили легко отображение ландшафтов взаимодействия белков в одном объективном эксперименте.
Протоколы взаимодействия протеина обыкновенно используют системы эктопического выражения с сродством-помеченными конструкциями сплавливания для того чтобы определить взаимодействия протеина без требовать высокое качество антитела узнавая протеин интереса1,2. Тем не менее, методы на основе эпитопных тегов имеют несколько недостатков. Физические взаимодействия с эпитопом могут привести к обнаружению неспецифических коочищенных белков3. Кроме того, слияние этих эпитопных тегов к N- или C-терминалу белка может блокировать взаимодействие родного белка-белка, или нарушить сворачивание белка, чтобы способствовать нефизиологическим конформациям4. Кроме того, эктопические системы экспрессии обычно переэкспрессируют белок приманки в надфизиологических концентрациях, что может привести к выявлению артистивных белковых взаимодействий, особенно для чувствительных к дозировке генов5. Чтобы обойти эти проблемы, эндогенный белок приманки может быть иммунопроцирован вместе с соответствующими взаимодействующих белков добычи, предполагая наличие высококачественного антитела, которое распознает родной белок.
Приведено здесь взаимодействие протеомики рабочего процесса для обнаружения ядерного взаимодействия эндогенного белка с использованием белка киназы CMGC DYRK1A в качестве примера. Нарушение номера копий DYRK1A, уровня активности или выражения может привести к тяжелой умственной неполноценности у людей, а эмбриональная летальность у мышей6,7,8,9. DYRK1A демонстрирует динамическую пространственно-временное регулирование10,и разрозненные белковые взаимодействия11,12, требующие подходов, способных обнаруживать низкое изобилие партнеров взаимодействия, специфичных для различных субклеточных отсеков.
Этот протокол использует клеточной фракции клеток человека HeLa в цитозол и нуклеоплазмы фракций, иммунопрециционности, образец подготовки к масс-спектрометрии, а также обзор биоинформатический трубопровод для оценки качества данных и визуализации результатов, с R скрипты, предусмотренные для анализа и визуализации (Рисунок 1) . Пакеты программного обеспечения Proteomics, используемые в этом рабочем процессе, находятся в свободном доступе для скачивания или могут быть доступны через веб-интерфейс. Для получения дополнительной информации о программном обеспечении и вычислительных методах, углубленные учебники и инструкции доступны по предоставленным ссылкам.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin, 0.1% EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4561096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone (HPLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A949SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC503096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzonase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing closure</td>
			<td>Caroline Biological Supply Company</td>
			<td>684239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-47724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>887845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa QC tryptic digest</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>88329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ1692630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KONTES Dounce homogenizer 7 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885300-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885301-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysyl endopeptidase C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>125-05061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>enzo life sciences</td>
			<td>ALX-350-012-C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P 40 Substitute solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>98379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p84 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX70220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BSA Protein Digest, MS grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88341</td>
			<td>LCMS QC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce C18 spin columns</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Trypsin Protease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td>For mass spectrometry sample prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0780-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose 4 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences</td>
			<td>17-0618-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica emitter tip</td>
			<td>Pico TIP</td>
			<td>FS360-20-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Clearance pestle 7ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT885302-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium metabisulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>3787K17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 150, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3903</td>
			<td>Tissue culture dish for adherent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PG82080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>29700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY M-Class UPLC</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7&#181;m Spherical Hybrid (1.7 &#181;m, 75 &#181;m x 250 mm)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007484</td>
			<td>nanoflow C18 column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free immunoprecipitation mass spectrometry workflow for large-scale nuclear interactome profiling

Спектрометрия иммуноаффинционности очистки (IP-MS) стала надежным количественным методом выявления белково-белковых взаимодействий. Эта публикация представляет собой полное взаимодействие протеомики рабочий процесс, предназначенный для выявления низкого изобилия белка-белковых взаимодействий из ядра, которые также могут быть применены к другим субклеточным отсеков. Этот рабочий процесс включает в себя субклеточной фракционации, иммунопрецитистиция, подготовка образца, автономной очистки, одноразовой этикетки без спектрометрии, а также вниз по течению вычислительного анализа и визуализации данных. Наш протокол оптимизирован для обнаружения разрозненных, низкообильных взаимодействий, которые трудно определить из целых клеточных лизатов (например, транскрипционные факторы взаимодействия в ядре) путем иммунопроницания эндогенных белков из фракционные субклеточные отсеки. В описанном здесь трубопроводе подготовки образцов содержатся подробные инструкции по подготовке клеточного экстракта HeLa, очищению иммуноаффинити эндогенного белка приманки и количественному анализу масс-спектрометрии. Мы также обсуждаем методологические соображения для выполнения крупномасштабных иммунопрециционных действий в масс-спектрометрии на основе взаимодействия профилирования экспериментов и предоставить руководящие принципы для оценки качества данных, чтобы различать истинный положительный белок взаимодействия от неспецифических взаимодействий. Этот подход демонстрируется здесь, исследуя ядерный interactome из CMGC киназы, DYRK1A, низкое изобилие белка киназы с плохо определенными взаимодействиями в ядре.

Большая часть белковой массы, идентифицированная в эксперименте IP-MS, состоит из неспецифических белков. Таким образом, одной из ключевых проблем эксперимента IP-MS является интерпретация того, какие белки являются высокодоверковаемыми интерактантами против неспецифических взаимодействующих. Чтобы продемонстрировать важнейшие параметры, используемые при оценке качества данных, в исследовании проанализированы тройные иммунопрециционные показатели из 5 мг ядерного экстракта HeLa, используя только контроль за бисом. Первая внутренняя проверка для того чтобы обеспечить что эксперимент IP-MS надежен ли протеин приманки выстраивает в ряд как один из самых высоки обогащенных протеинов определенных как сложить-изменение над управлением и вероятностью SAINT. В этом случае приманка DYRK1A входит в тройку обогащенных белков по контролю(рисунок 2A,B). В ядерном исследовании interactome DYRK1A с использованием четырех независимых антител, FC-A отсечения от йgt;3.00 и SAINT вероятность отсечения При применении к этому эксперименту, четкое разделение можно было увидеть между высокой достоверности взаимодействующих и йgt;95% социоренных белков, идентифицированных как неспецифические (Рисунок 2A,B) . Применение как обогащения изменения раза и порог аналогов увеличивает строгость, требуя последовательно высокого обогащения белковых идентипов через биологические репликации.
В дополнение к статистическому скорингу, рабочий процесс анализа CRAPome также отображает ранее сообщенные взаимодействия на данные добычи23. Хотя это отображение может быть полезно для порога высокой и низкой достоверности взаимодействий, ранее сообщалось взаимодействия могут оценка плохо FC-A и SAINT вероятности, потенциально указывая, что многие известные взаимодействия данной приманки может существовать только в конкретных типах клеток, контекстах, или органелл. Например, набор данных DYRK1A, значения iREF-взаимодействующих FC-A были столь же низкими, как 0,45, что представляет собой очень низкое обогащение над контролем(рисунок 2C) . Во избежание инфляции ложных срабатываний статистическое пороговое значение должно осуществляться таким образом, чтобы отоставлять приоритеты в отношении снижения числа ложных негативов. Следует отметить, что обнаружение этих взаимодействий не зависит от изобилия белка(рисунок 2C). Рассчитанное абсолютное количество копий каждого взаимодействия iREF в клетках HeLa не выявило корреляции с уровнями обнаружения партнера по взаимодействию IP-MS24.
Cytoscape служит эффективным инструментом для визуализации нескольких уровней данных взаимодействия19. В эксперименте dyRK1A иммунопреципсии описано здесь, комбинированное использование FC-A йgt; 3.0 и SAINT Тем не менее, при применении FC-A отсечения от 3,0 в изоляции, восемь дополнительных белков были добавлены в сеть. Эти дополнительные белковые интеркторы имеют высокую связь с уже вданными в сеть, что позволяет предположить, что они связаны с аналогичными комплексами или функциональными ролями. С этой целью, доказательства от STRING-DB белково-белковых взаимодействий был интегрирован в эту сеть, как синий пунктирной линии20. В то время как этот эксперимент с одной приманкой, тройной предоставляет ограниченный образец полной сети взаимодействия DYRK1A, использование дополнительных приманок, репликаций и интеграции больших общедоступных наборов данных может быть использовано для расширения сети взаимодействий с высоким уровнем доверия. Таким образом, статистические отсечения будут специфичны для каждого отдельного эксперимента и нуждаются в тщательной оценке.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig01.jpg"> Рисунок 1: Представитель протеомики рабочего процесса для субклеточного IP-MS. Клетки выращиваются в 4 l круглых нижних колбах или 15 см ткани культуры блюда и собирают в то же время для субклеточной фракции. Клетки фракционируются в цитосолик, ядерный и ядерный гранулы, и иммунопрециционные данные делаются из 1,10 мг ядерного лисата с помощью одного или нескольких антител, распознающих одну и ту же приманку. Фильтр помощь образца подготовки (FASP) и автономной очистки образца выполняются до одного выстрела масс-спектрометрии. Вычислительный конвейер ниже по течению используется для обработки данных в интерпретируемые данные взаимодействия. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60432/60432fig02.jpg"> Рисунок 2: Репрезентативные данные для одноразового эксперимента IP-MS. (A)FC-A и SAINT выход вероятности из рабочего процесса анализа CRAPome для оптимального эксперимента с использованием одного антитела для киназы DYRK1A (n No 3). Для сравнения использовались только средства управления бисером. Красные твердые линии представляют отсечения, установленные на FC-A , 3,00 и SAINT (B) Макквант оценок изобилия белка (iBA) выход по сравнению с log2 соотношение белка изобилие в DYRK1A IP для контроля, окрашенные скорректированной р значение диапазона от эмпирического анализа Байес этикетки свободной интенсивности. (C) FC-A и предполагаемое количество копий белков, перечисленных в качестве взаимодействующих белков в базе данных iRef23,24. (D) Визуализация сети Cytoscape взаимодействующих DYRK1A. Синие узлы - FC-A - 3,00, SAINT Оранжевые узлы - FC-A - 3.00. Черные края и белки, идентифицированные как взаимодействуют в эксперименте IPMS. Синий пунктирный край - SAINT взаимодействие между хищным белком (уверенность в себе; .150). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/60432fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Ингибитор протеазы (PI) смесь</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>Метабисульфит натрия</td>
			<td>1 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Бензамин</td>
			<td>1 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Дитиотрейтол (DTT)</td>
			<td>1 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Фенилметанесульфонил фторид (PMSF)</td>
			<td>0,25 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Ингибитор фосфатазы (PhI) смесь</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>Микроцист ЛР</td>
			<td>1 км</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ортованат натрия</td>
			<td>0,1 мм</td>
		</tr>
<tr>
<td>Фтор натрия</td>
			<td>5 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Субклеточные фракционные буферы:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Буфер рН 7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>ГЕПЕС</td>
			<td>10 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>10 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Буфер B рН 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>ГЕПЕС</td>
			<td>20 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>1,5 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>420 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Этиленедиаминететраацетическая кислота (ЭДТА)</td>
			<td>0,4 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Глицерин</td>
			<td>25% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Буфер C рН 7,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>ГЕПЕС</td>
			<td>20 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>2 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>100 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Этиленедиаминететраацетическая кислота (ЭДТА)</td>
			<td>0,4 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Глицерин</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Иммунопрефферы:</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP буфер 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>ГЕПЕС</td>
			<td>20 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>150 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Эдта</td>
			<td>0,1 мм</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Глицерин</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">IP буфер 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>ГЕПЕС</td>
			<td>20 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>500 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Эдта</td>
			<td>0,1 мм</td>
		</tr>
<tr>
<td>NP-40</td>
			<td>0,1% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Глицерин</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">SDS Алкилация Буфер рН 8,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sds</td>
			<td>4% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Хлороацетамид</td>
			<td>40 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>TCEP</td>
			<td>10 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Трис</td>
			<td>100 мМ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">UA pH 8.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация</td>
		</tr>
<tr>
<td>Мочевины</td>
			<td>8 М</td>
		</tr>
<tr>
<td>Трис</td>
			<td>0,1 м</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">- использовать HPLC класса H2O</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Буферные композиции
Дополнительные файлы кодирования. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60432/Supplemental_Coding_Files.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling at JoVE.com

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Описанный является протеомикой рабочего процесса для выявления белковых партнеров взаимодействия из ядерной субклеточной фракции с использованием иммуноаффинити обогащения данного белка интерес и этикетки свободной масс-спектрометрии. Рабочий процесс включает в себя субклеточной фракционации, иммунопрецитистицитов, фильтр помощь подготовки образца, автономной очистки, масс-спектрометрии, и вниз по течению биоинформатики трубопровода.

Без этикетки Иммунопрецитис Масса Спектромтертрия Рабочий процесс для крупномасштабного ядерного взаимодействия Профилирование

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Этот рабочий процесс протеомики позволяет объективно идентифицировать и картировать эндогенные белково-белковые взаимодействия с субклеточным разрешением. Этот метод особенно выгоден при расследовании приманки белков, которые дозировка чувствительны, низкое изобилие, или имеют несколько субклеточных локализаций. Этот метод может быть применен к отображению эндогенных белковых взаимодействий при условии наличия подходящего реагента сродства.Это особенно важно для многих из тысяч белков, которые имеют неизвестную функцию, многие из которых были связаны с болезнью человека. Этот метод может быть адаптирован к любой клеточной линии или ткани, подменяемой для субклеточной фракции. Любой белок с подходящим реагентом сродства может быть мишенью.Общий результат для сродства экспериментов по очищению часто не является результатом. Действительно хорошие реагенты, сбор данных КК во всем, и ограничение обработки образцов все очень важны. Знайте, что у вас есть образец.Для начала оттаивать подготовленные клеточные гранулы в течение 15 минут в 1X гранулы объем холодного буфера с ингибиторами протеазы или ингибиторы фосфатазы. Поместите трубку, содержащую гранулы клетки на nutator при четырех градусах по Цельсию, чтобы помочь в повторном получении в течение 30 минут. Затем поместите трубку в центрифугу при 2000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут, чтобы гранулы.Декант supernatant и повторного перерасхода клеток с 5X упакованный объем ячейки с буфером A.Incubate на льду в течение 20 минут. Затем, гранулы снова на 2000 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Decant буфера и resuspend с 2X оригинальный буфер объема упакованных клеток с ингибиторами протеазы или ингибиторы фосфатазы.Dounce около семи раз с рыхлой пестик A.Centrifuge лисат в течение 10 минут при 2000 раз г и четыре градуса по Цельсию. Аккуратно перенесите супернатант в новую трубку и вспышки заморозьте его жидким азотом. Храните лисат при температуре минус 80 градусов по Цельсию.Повторное использование гранул с 0,9X гранулы объем буфера B с ингибиторами протеазы или ингибиторы фосфатазы и смешать на nutator в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Чтобы вынизыть ядра, dounce 20 раз с titer pestle B.Mix ядерного лизата на nutator в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию, так что это однородно. Затем центрифугировать ядерный лисат в течение 30 минут при 21 000 раз г при четырех градусах Цельсия.Pipette от супернатанта и сохранить в качестве растворимого экстракта ядерного белка. Чтобы облизать растворимый ядерный экстракт, сначала вырежьте соответствующую длину 24 миллиметра шириной диализа трубки с восьмикилограммовым молекулярным разрезом веса. Зажимите одну сторону трубки и загрузите нуклеоплазму в трубу.После загрузки лизата зажимите другой конец и погрузите в чистый стеклянный контейнер, содержащий буфер С с ингибиторами протеазы. Диализ в течение трех часов при четырех градусах по Цельсию. После этого перенесите диализу ядерного экстракта нуклеоплазмы в трубку и центрифугу при 21 000 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.Перенесите три 20 микролитровых алицитов ядерного экстракта в новые микроцентрифуговые трубки для проверки фракционации западным пятном. Используя пипетки советы, которые были сокращены на кончике, подготовить белок A / G шарик смеси для каждой репликации путем объединения 12,5 микролитера шарик объем белка Сефхароз с 12,5 микролитров белка G Sepharose в микроцентрифуг труб. Вымойте смесь шарика белка A/G два раза с помощью 300 микролитров буфера IP I.Spin шариков при 1500 г при четырех градусах По Цельсию в течение одной минуты и вылейте буфер.Далее приготовьте антитела белка A/G бисера. Чтобы связать антитела к бисеру, добавьте в трубку 300 микролитров IP-буфера I и 10 микрограммов желаемого антитела. Разрешить бисер-антитела смеси рок на nutator при четырех градусах по Цельсию в одночасье.Теперь aliquot соответствующие объемы ядерных лизайтов в низкой удержания микроцентрифуг трубки для одного миллиграмма белка входных на репликацию. Закрутите лизат 16 000 раз г в течение 30 минут и перенесите супернатант в новую трубку. Добавьте один микролитр бензоразы по 250 единиц на микролитр на каждый миллиграмм ядерного лизата и камень на нутриторе при четырех градусах Цельсия в течение 10-15 минут.Для приготовления бисера для предварительной очистки лизата добавьте 12,5 микролитров каждого белка А и белка G бисера в 1,5 миллилитровых трубок с низким удержанием. Вымойте два раза с буфером мытья IP I с ингибиторами протеазы. Decant буфера и добавить один миллиграмм подготовленных ядерных лисировать на бисер.Инкубировать во время качания на nutator в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию. Центрифуга предварительно очищенных лизатов при 1500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты. Затем мыть антитела белка A или G шарики два раза с IP буфер i с ингибиторами протеазы.После центрифугирования при 1500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты, decant буфера. Теперь перенесите предварительно очищенный ядерный лизат на антитела белка А или G шарики. Инкубировать во время качания на nutator при четырех градусах по Цельсию в течение четырех часов.После инкубации центрифуга в 1500 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты. Перенесите супернатант в трубки, помеченные как поток для каждой репликации. Вымойте белок антител A или G бисером четыре раза с одним миллилитром БУФЕРа IP II с ингибиторами протеазы.Затем мыть бисер два раза с одним миллилитр IP буфера I с ингибиторами протеазы. Убедитесь, что все буферы удаляются после последней стирки. Elute белка от бисера путем инкубации с 20 микролитров 0,1 молярного глицина при рН 2,75 каждый в течение 30 минут на гайки.Затем спина в 750 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение одной минуты и пипетки от супернатанта. Повторите эту инкубацию с буфером elution во второй раз. После приготовления белковой гранулы, повторно посовещение его с 30 микролитров буфера алкилирования SDS.Инкубировать образец на 95 градусов по Цельсию тепловой блок в течение пяти минут. Затем дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте в каждый образец 300 миллилитров раствора UA и 30 микролитров по 100 миллимоляров TCEP.Загрузите раствор на центробежный фильтр 30K. После вращения центробежного фильтра при 21 000 г при комнатной температуре в течение 10 минут держите поток до конца в случае, если есть проблемы с фильтром. После мытья фильтра в соответствии с рукописью, добавьте три микролитера по одному микрограмму на микролитер lyse C, перерасходуемый в 0,1 молярных Трис рН 8,5.Заполните фильтры до отметки 100 микролитров с 0,1 моляра Tris pH 8.5. Дайте ему переварить в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию во время качания на нутриторе. Далее добавьте один микролитер по одному микрограмму на микролитер MS класса трипсина.Смешайте осторожно и дайте трипсину инкубировать с образцом на ночь при 37 градусах по Цельсию во время качания на nutator. Утром центрифуга несколько раз в 21 000 раз г в течение 20 минут, чтобы урезать пептиды из фильтра в чистую микроцентрифугную трубку с низким содержанием удержания. После опреснительной пептиды с помощью C18 спина колонки, повторно лиофилизированных пептидов в семи микролитров 0,1%TFA в 5%acetonitrile.Sonicate образца в течение трех минут, чтобы убедиться, что пептиды были повторно, а затем спина вниз на 14000 раз г в течение 10 минут. Загрузите от 15 до 30% образца на систему масс-спектрометрии жидкой хроматографии для анализа. В этом исследовании были проанализированы трипликатные иммунопреципитации из пяти миллиграммов ядерного экстракта HeLa с использованием только бисерного контроля.Приманка DYRK1A входит в тройку самых обогащенных белков по контролю, что указывает на надежность выполненного эксперимента IP-MS. Было показано четкое разделение между взаимодействиями высокой уверенности и более 95% копурифицированных белков были определены как неспецифические. В примере набора данных DYRK1A партнеры IREF представили значения FC-A как низкие до 0,45, что представляет собой очень низкое обогащение над контролем.Соответственно, многие из этих ранее зарегистрированных взаимодействий являются ложными негативами в этом наборе данных, опадая ниже порога FC-A в три. Рассчитанное абсолютное число копий каждого взаимодействия IREF не показало никакой корреляции с уровнями обнаружения партнера по взаимодействию IP-MS. Комбинированное использование FC-A больше, чем три и святой больше, чем 0,9 сократили список высокой уверенности взаимодействующих до шести белков.Однако при применении FC-A отсечения более трех в изоляции, восемь дополнительных белков были добавлены в сеть. Наиболее важной частью этого протокола является отбор реагента антител для иммунопреципиента. Западная помарка или Coomassie проверка селективности рекомендуется до завершения этого рабочего процесса.Подтверждающие доказательства взаимодействия протеин-белка можно иметь от co-IP западного blotting определенных interactors. Белковые химические перекрестные связи, хотя и более сложные, могут выявить области взаимодействия взаимодействующих. Используя этот метод, моя исследовательская группа обнаружила новые функции для DYRK1A, протеиновой киназы, необходимой для развития мозга млекопитающих и связанной с невропатологией болезни Альцгеймера.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Оптимальная подготовка формалин фиксированной образцы для пептида основан матрицу помогает лазерная десорбция/ионизации масс-спектрометрия визуализации рабочих процессов

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

Протокол поэтапного дозирования для увеличения пропускной записи в label-Free Impedance основе GPCR анализы

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...